银鲫原肠胚差异表达基因的筛选

收稿日期: 2004-09-09;修订日期: 2004-10-25 基金项目:国家重点研究发展( 2004CB117401)、中国科学院知识创新方向项目 (KSCX2-SW-303)和中国科学院知识创新领域前沿项目 ( 220309) 作者简介:刘静霞( 1976) ) ,女,湖北汉川市人;博士研究生。研究方向:发育遗传学 通讯作者:桂建芳, E-mail: jfgui@ ihb1 ac1 cn 银鲫原肠胚差异表达基因的筛选 刘静霞 石耀华 桂建芳 (中国科学院水生生物研究所,淡水生态与生物技术国家重点实验室;中国科学院研究生院,武汉 430072) 摘要 :胚胎发育是基因组中各个基因在时间和空间上选择性表达的结果。为了鉴定参与鱼类早期胚胎发育和胚层 分化的调控因了,分别构建了银鲫( Carassius auratus gibelio)原肠胚和成熟卵子的 SMART cDNA 文库, 并采用差异筛 选的,从银鲫原肠胚 SMART cDNA文库中筛选不同于成熟卵子的差异表达基因。通过菌斑和 PCR 产物的两轮 斑点杂交,从大约 1500 个克隆中筛选出 131 个阳性克隆,从中选择 58个克隆测序并将测得的序列进行了数据库比 对分析,结果显示这些差异表达基因大部分为参与转录和翻译的调控因子和核糖体蛋白以及一些在胚胎早期大量 表达的参与脂类代谢的脂蛋白和一些未知的新基因。接着采用 RT-PCR 技术, 对其中 6 个基因在胚胎发育不同阶 段的表达特征进行了分析,进一步证实这些基因在胚胎发育过程中存在表达差异;研究还从分析的基因中揭示出 4 类不同的表达模式。通过本研究,已筛选出一批在银鲫胚胎发育早期开始表达的调控基因, 为开展鱼类胚胎发育 早期表达基因的功能研究奠定了前期工作基础。 关键词: 银鲫; 原肠胚;胚胎发育; SMART cDNA文库; 差异表达 中图分类号: Q173 文献标识码: A 文章编号: 1000-3207( 2005) 04-0359-07 原肠胚期是胚胎发生中一个极为重要的时期, 在这个时期,囊胚细胞通过运动而发生细胞重排, 使 胚体细胞被重新定位,初步形成内、中、外三个胚层, 构成所有器官形成的细胞基础。在原肠胚期, 细胞 核控制细胞分化的作用日益明显,胚胎细胞开始合 成新的各种类型的 RNA和专一性的蛋白质,指导器 官原基的形成和细胞的分化及定位[ 1]。已有的研究 结果表明,在果蝇的早期发育中, 有 60个基因参与 了从模式形成到体节出现这一胚胎发育过程, 同时 估计脊椎动物的参与基因更多[ 1]。 鱼类以其产卵量大、胚胎体外发育、胚体透明和 发育速度快等特点,近年来已成为发育生物学研究 的主要对象[ 2) 4]。迄今为止, 利用同源克隆或正向 遗传学的方法在鱼类中鉴定到大量的参与早期胚胎 发育的因子。例如参与内胚层分化的 Nodal通路的 信号因子, Znr-1和 Znr的克隆是利用老鼠和爪蟾的 序列设计简并引物从库中扩增而获得[ 5] ; 参与鱼类 早期胚胎发育和胚层分化的重要调控因子如 Squint , Cyclops, Cas, Boz 和 Oep 等基因, 都是利用定 位克隆的方法, 从斑马鱼的突变体中鉴定出来 的[ 6) 11]。银鲫因其天然群体中存在 5%至 20%的 雄性个体[ 12] ,且已发现其卵子具有雌核生殖和两性 生殖两种不同的生殖方式,已被认为是研究鱼类卵 子成熟、受精和早期胚胎发育的独特对象[ 13) 17]。 本研究在实验室构建了银鲫尾芽期胚胎与心跳期胚 胎、原肠期胚胎与尾芽期胚胎抑制性差减杂交 cDNA 文库,筛选到一批在这些胚胎发育时期差异表达基 因的基础上[ 18) 22] ,进一步以银鲫为材料, 利用差异 呈现方法[ 23]试图筛选原肠期胚胎相对于其成熟卵 子差异表达的基因, 希望获得一些重要的在胚胎发 育早期起调控作用的基因。 1 材料和方法 111 银鲫及其胚胎 银鲫( Carassius auratus gibelio Bloch)取自中国科学院水生生物研究所关桥实验基 地,实验鱼的人工催产、受精和胚胎发育按照以前报 道的方法进行[ 24]。 112 胚胎发育各期胚胎总 RNA的提取 不同发育 第 29卷 第4 期 水 生 生 物 学 报 Vol129, No14 2 0 0 5 年 7 月 ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA July, 2 0 0 5 时期胚胎的总 RNA 用 SV Total RNA Isolation System (Promega)提取,用于 RT-PCR检测,步骤详见 SV To- tal RNA Isolation System( Promega)操作手册。依试剂 盒的说明分别称取适量的新鲜组织,加入 1mL 抽提 缓冲溶液。充分匀浆后,各取 175LL 匀浆液转移到 115mL离心管中,加入 350LL SV RNA稀释 Buffer, 混 匀后 70 e 封阻 3min, 14000r/ min 离心 10min。转移 上清,加入 200LL 95%乙醇,吹打混匀后转移至离心 柱, 14 000r/ min离心 1min, 加入 600LL SV RNA洗涤 液, 14 000r/ min 离心 1min。加入 50LL DNase I 于 20 ) 25 e 消化 15min 后, 加 200LL SV DNase 终止溶 液, 14 000r/ min 离心 1min。加入 600LL SV RNA 洗 涤液, 14 000r/ min离心 1min后,再次加入 250LL SV RNA洗涤液,高速离心 2min。用 250LL无 RNA酶水 洗脱总 RNA 两次。总 RNA于- 70 e 冰冻, 真空冻 干机超低温冻干浓缩后, 溶解于 20 ) 30LL 水中, 取 015LL 电泳检测 RNA浓度和质量。 113 SMART cDNA的合成 SMART cDNA 的合成 和文库构建流程参照以前的报道[ 25) 28]。取以上提 取的银鲫成熟卵母细胞和原肠期胚胎的 RNA, 按 Clontech SMART PCR Synthesis 试剂盒合成 SMART cDNA。取适量原肠期胚胎的 SMART cDNA 连入 TOPO-XL PCR载体,并利用电转化的方法将连接产 物转入 TOPO10电转化感受态细胞, 在 X-gal/ IPTG 琼脂平板上挑取白色菌落, 从而获得银鲫原肠期 SMART cDNA质粒文库。 114 斑点杂交筛选差异表达基因 利用 DNA地高 辛标记试剂盒标记银鲫原肠期胚胎和成熟卵母细胞 的第一链 cDNA,分别作为阳性探针和阴性探针。杂 交筛选的方法和过程参照以前的报道[ 24) 27]。第一 轮筛选是直接将银鲫原肠期SMART cDNA质粒文库 的单克隆菌液分别点在两张尼龙膜的对应位置上。 膜在 10% SDS 中浸润 3min, 再在变性液中浸泡 5min,然后在中和液中浸泡 5min,最后在 2 @ SSPE 中 浸泡 3min后, 自然晾干。80 e 烤膜 2h 后即可用于 斑点杂交或存放起来。杂交过程与以前的报道相 同[ 18 ) 21] , 68 e 预杂交 115h,加入探针后 68 e 继续杂 交 16h。杂交后于室温洗膜两次,每次 10min, 洗膜 液为含 011% SDS 的 2 @ SSC。再用含 011% SDS 的 011 @ SSC于 68 e 洗膜两次, 每次 15min,用碱性磷酸 偶联的地高辛抗体和 BCIP/NBT 底物进行显色检 测。挑选的阳性克隆作为模板用 Nested 引物进行 PCR 扩增, 点膜后再用以上探针进行第二轮斑点 杂交。 115 RT-PCR分析基因在不同胚胎发育时期的表达 将SV Total RNA Isolation System( Promega)提取的 总RNA 用 SuperScript Ò逆转录酶 ( GIBCO) 和 oligo ( dT)引物合成单链 cDNA。用基因特异的引物进行 胚胎发育时序的半定量 RT-PCR检测, 以银鲫的 A- tubulin基因调整模板浓度并作为对照。 2 结果 211 原肠胚和成熟卵子 SMART cDNA的合成以及 原肠胚 SMART cDNA文库的构建 在 SMART cDNA合成中, 只有当逆转录进行到 mRNA末端时才会发生模板链的转换, 其 cDNA才能 被 PCR扩增。因此, SMART cDNA合成技术是获取 基因全长 cDNA的较好方法。取 SV Total RNA Isola- t ion System提取的总RNA,按SMART cDNA文库合成 的方法逆转录合成第一链, 然后进行 13个循环的长 距离 PCR( LD-PCR)扩增 SMART cDNA。110%琼脂 糖凝胶电泳检测 SMART cDNA 的合成, 结果如图 1 所示, cDNA的弥散带大小主要集中于 017kb 以上, 可见合成的 cDNA 质量良好。银鲫原肠胚 SMART cDNA连入 TOPO-XL PCR 载体后, 经电转化转入 TOPO10感受态细胞,经统计,文库的转化效率达 107 左右。待菌落呈现蓝白两色时, 挑取了大约 1500个 白色菌落接种于 LB液体培养基中用于斑点杂交。 图 1 银鲫原肠胚( G)和成熟卵子( O)的 SMART cDNA。M:DL2000 DNA 分子量 Fig. 1 SMART cDNAs from gastrula embryos and mature eggs of Carassius auratus gibelio. M: DL 2000 DNA molecular weight marker 212 原肠胚差异表达基因的筛选 将上述来自银鲫原肠胚 SMART cDNA文库的大 约 1500个已达到生长对数期的克隆排序, 编号, 每 个克隆取 5LL 菌液分别点在两张膜上相对应的位 置,并分别用原肠胚和成熟卵子的第二链 cDNA标 记的探针做点杂交。在两张膜上相同的位置,杂交 360 水 生 生 物 学 报 29卷 信号强度相差 5倍以上的认为是阳性克隆。一共得 到 229 个杂交阳性菌斑。再将这些菌斑以 Nested PCR primers进行 PCR扩增,筛选重组阳性克隆, 并 鉴定插入片段的大小。图 2显示了 229个杂交阳性 菌中 14个克隆的 PCR结果。有部分菌斑阳性克隆 为空载体或 PCR 扩增出现一条以上的条带。重组 克隆插入的 cDNA片段基本上分布于 015 ) 210kb之 间。对有效的229个 PCR产物进行了第二轮的斑点 杂交筛选, 斑点筛选的结果见图 3, 一共从中筛出 110个阳性克隆。取阳性信号显著的 58个克隆, 分 别进行测序。测序结果经 blast 明, 它们包括 25个可查出同源已知基因的cDNA和11个查不出 图 2 PCR检测第一轮斑点杂交阳性克隆中 cDNA片段的大小。1 ) 14:从筛选的阳 性克隆中随机挑取的 14个克隆。M:K/ HindÓ+ EcoR Ñ DNA 分子量标准 Fig. 2 Size ident if ication of the cDNA fragments in the posit ive clones resulted from the f irst do-t blott ing1Lanes 1 ) 14: The 14 randomly picked positive clones from the first dot blott ing. M:K/HindÓ+ EcoR Ñ DNA molecular weight marker 图 3 差别杂交筛选银鲫原肠胚 Smart cDNA 文库。每个克隆点 在两张膜上相同的位置,分别用银鲫原肠胚( A、C)和成熟卵子 ( B、D) cDNA 的第二链PCR产物作探针杂交,杂交信号相差 5倍 以上的是阳性克隆。阳性克隆用箭头标出 Fig3. Screening of the Smart cDNA plasmid library of gastrula embryos by differential do-t blot1Two ident ical membranes were hybridized with probes from gastrula embryo( A, C) secondary cDNA strands and mature egg( B,D)secondary cDNA strands1Whose signals on the two membranes are different more than 5 folds are positive clones1The posit ive clones were indicated with arrows 同源性的可能为新基因的 cDNA(表 1) ;在它们之中 有 11个cDNA重复出现2次或 2次以上,其中与阿朴 脂蛋白(Apolipoprotein)同源的 cDNA出现频率最高, 在 58个测序克隆中共出现了 7次(表 1) ,占测序克 隆总数的12%以上。 213 差异表达基因在胚胎发育过程中的 RT-PCR 验证 为了揭示这些差异表达基因在胚胎发育过程中 的表达特征,选取以上筛选的 6个基因进行了进一 步的RT-PCR分析。根据这 6个基因的 cDNA序列, 分别设计出其特异的 PCR引物。RT-PCR 扩增结果 表明,这 6个基因在银鲫胚胎发育过程中都呈现差 异表达。图 4显示了其中4个基因呈现的 4种不同 的胚胎发育表达模式。例如编号为 161的基因, 虽 然具有母源的 mRNA, 但其含量较低, 到原肠期时, 其含量又明显增加, 并一直维持着稳定的含量持续 到出苗, 这显然是在原肠期新转录的 mRNA导致的 结果(图 4A) ; 编号为 153 和 59的基因, 如图 4B和 4C所示,分别从囊胚期和原肠期开始转录, 此后一 直呈现高水平的表达并持续到出苗; 编号为 138的 基因, 如图 4D所示,从囊胚期开始转录, 在尾芽和 心跳期胚胎中 RNA的含量达到最高, 出苗时其含量 又显著减弱, 该基因可能为仅在胚胎发育期间表达 的基因。 表 1 斑点杂交阳性克隆测序 cDNA 片段的大小及其同源性查询 Tab. 1 Size and homologue searching of the sequenced cDNA fragments from the dot blot posit ive clones 克隆编号 PCR 产物大小( Kb) 测序的方向 同源性比较 74, 114 111 3c New gene, withAAATAA 104, 124 112 3c New gene, similar to Mus musculus hypothetical protein 4期 刘静霞等: 银鲫原肠胚差异表达基因的筛选 361 续表 克隆编号 PCR 产物大小( Kb) 测序的方向 同源性比较 143, 175, 206 0195 3c New gene, withAAATAA 185 1 3c New gene, withAAATAA 67, 138, 73, 184 017 3cor 5c New gene, withAAATAA 26, 52, 153, 125 116 3cor 5c Homo sapiens Fetuin protein B, 45% 59, 217 019 3c Anguilla japonica 14KD apolipoprotein, 46% 9, 23, 190, 165, 202, 199, 103 111 5c Danio rerio apolipoprotein, 84% 168 112 5c Dryzias lat ipes annexin max3, 56% 192 0175 5c copper chaperone[ Canis familiaris] , 70% 46 114 3c Cyprinus carpio Alpha-1-antitrypsin mRNA or serin protease inhibitor, 91% 38 019 Lctalurus punctatus Ribosomal protein L7a, 84% 15 014 3c Cyprinus carpio Ribosomal protein L4 1, 93% 186 016 5c Lctalurus punctatus ribosomal protein L 18a, 88% 226 113 5c Lctaluras punctatus ribosomal protein L3, 83% 178 018 5c Lctaluras punctatus Ribosomal protein L 10a, 87% 127, 42, 193 115 5c Mus musculus HistoneH313, 93% 144 115 5c Danio rerio cellular nucleic acid binding protein, 99% 57, 223 113 5c Homo sapiens fructose-1, 6-bisphosphatase2, 81% 80, 31 019 3c Danio rerio histone variant H2A, 92% 36 114 5c Danio rerio Type Ñ cytokerat in, enveloping layer, 87% 12 116 3c Goldfish large ribosomal RNA, 96% 19 019 5c Danio rerio ran binding protein, 88% 159 118 3c Homo sapiens adenosine kinase, 89% 161, 220 019 5c Homo sapiens Histone H2A purine rich binding element protein B, 100% 198 019 5c Xenopus laevis RNA binding motif protein Y14, 81% 221 113 5c Mus musculus translocase of inner mitochondrial membrane 9 homolog, 82% 3 115 5c Danio rerioA-tubulin, 84% 89 3 5c Danio rerio B-tubulin, 87% 117 112 5c Homo sapiens Dystrophin-ralated protein, 46% 115 1 3c New gene, without AAATAA 51 2 3c New gene, without AAATAA 16 3 3c New gene, without AAATAA 225 115 3c New gene, without AAATAA 62 1 3c New gene, without AAATAA 210 015 3c New gene, without AAATAA 362 水 生 生 物 学 报 29卷 图 4 差异表达基因(A-161; B-153; C-59; D-138; E-Atubulin对照) 在卵子和胚胎发育不同时期的 RT-PCR 检测。E1-未受精卵; E2-受精 5min; E3-受精 40min ; E4-多胞期 ; E5-桑椹胚; E6-囊胚 ; E7-原肠胚; E8-神经胚; E9-尾芽期; E 10-心跳期; E 11-出苗前期 ; E12-出苗期。M: DL 2 000DNA分子量标准 Fig. 4 RT-PCR detection of different ially expressed genes(A-161; B-153; C-59; D-138;E-Atubulin control) at different stages during embryogenesis. E1-unfer- t ilized egg; E2-5min after fertilization;E3-40min after fertilizat ion; E4-multicellular stage; E5-morula; E6- blastula; E7-gastrula; E8- neurula; E9-tail bud stage; E10-heartbeat stage: E11- hatching; E12- larvae. M: DL 2 000 DNA molecular weight marker 3 讨论 原肠胚是胚胎发生中一个极为重要的时期, 在 中囊胚转换点后,合子核开始大量表达新的 RNA 和 蛋白质,参与指导胚胎的图式形成和胚层的分化、细 胞的定位和迁移以及细胞的分化,某些指导器官形 成和分化的基因也可能开始大量表达。虽然本实验 室已报道了银鲫胚胎发育中差异表达基因筛选的部 分结果[ 18 ) 22] , 但这些工作都着重于银鲫胚胎发育 后期参与器官形成的基因的筛选。本研究以银鲫原 肠期胚胎中大量表达的基因作为筛选对象, 主要筛 选一些在中囊胚转换点以后合子核开始大量表达的 基因,着重于筛选一些参与指导胚层分化、图式形成 和细胞定位的调节因子。 近年来, 在斑马鱼中已经鉴定和克隆了一些参 与胚胎早期发育的重要的调控因子[ 5 ) 11] ,但是对于 内胚层的分化和调节机制的研究才刚 刚起 步[ 4, 29) 30]。例如参与内胚层分化的 Nodal通路的信 号因子 Cas的上游基因迄今还未鉴定到[ 4] ; 鱼类胰 脏分化早期的标记基因还有待继续鉴定[ 29] ,鱼类肝 胰脏以及消化道的原基分化, 器官生成以及生长的 分子调节机制还需进一步的补充和完善[ 4, 29 ) 30]。 本实验采用的差别筛选方法由Kajiwara 等于1996首 次报道,利用这个方法, Kajiwara等成功克隆到多个 与突发中风相关的基因, 并证实突发中风与胞内钙 离子作用相关[ 23]。尽管应用差别筛选分离克隆目 的基因存在许多局限, 低丰度的 mRNA 很难用此法 检测出来[ 31] ,但是,差别筛选也有其优势, 即分离出 来的阳性克隆为全长 cDNA。而本实验室常用的抑 制性差减杂交技术虽然在筛选差异表达基因上具有 明显优势,例如其假阳性比率明显降低,同时低丰度 差异表达的基因在应用抑制性差减杂交技术时也容 易克隆到[ 19 ) 22] ,但是其克隆到的只是基因片段, 对 于银鲫这个多倍体物种而言, 再利用 3cRACE 和 5c RACE的方法去获得基因全长, 需要花费更多的精 力。当然,以多倍体物种为研究对象,进行大规模的 差异表达基因的筛选时, 本实验室根据多年的实验 ,认为最好的方法是将抑制性差减杂交的文库 标记为探针,筛选目的 SMART cDNA文库,这样低丰 度、差异表达的基因也容易筛选到,而且不需要利用 RACE的方法扩全长,只是需要筛选的克隆数量较大。 本实验筛选的差异表达的基因包括一些在银鲫 胚胎发育中起重要作用的基因, 大量的为参与转录 和翻译的调控因子和核糖体蛋白; 以及一些在胚胎 早期大量表达的参与脂类代谢的脂蛋白; 和一些不 知功能的新基因。如表 1中所示, 在胚胎发育早期, 表达丰度较高的基因, 主要是一些为满足鱼类胚胎 细胞快速分化而必须的调控因子和一些为了满足鱼 类胚胎发育而必需的一些卵黄蛋白代谢因子以及可 能的与胚层分化、细胞定位和迁移有关的调节因子。 对其中一些基因利用胚胎发育不同时期的 RT-PCR 检测进一步验证了其在胚胎发育过程中的表达差异 4期 刘静霞等: 银鲫原肠胚差异表达基因的筛选 363 (图 4) ,这同时也映证了利用差别杂交的方法能有 效筛选到差异表达基因。另外, 对于其中的一些基 因作者正在对其进行表达特征及其功能研究, 相关 结果我们将陆续报道。 参考文献: [ 1 ] Gui J F, Yi M S. 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In order to iden- tify some differentially expressed genes in early embryogenesis, two kinds of SMART cDNAs were respectively synthesized from mature eggs and gastrula embryos of Carassius auratus gibelio, and the gastrula embryo SMART cDNA library was constructed. Following this program, 131 positive clones were screened from about 1500 clones of the gastrula embryo SMART cDNA library by two rounds of do-t blot differential hybridizations using the synthesized SMART cDNAs as probes. Furthermore, 58 positive clones were selected for sequencing. Searching GenBank by the nucleotide sequences indicated that most of the sequenced cDNAs en- coded ribosome proteins and regulators involved in translation and transcription, and some encoded lipoproteins involved in the metabolism of fat. And, some unknown new genes were also identified from the screening. Moreover, we investigated the expres- sion patterns of 6 genes during embryogenesis byRT-PCR analysis, and confirmed their differential expression during embryogene- sis. Four different expression patterns, such as transcribing again at gastrula based on the maternal products, beginning to tran- scribe at blastula stage, beginning to transcribe at gastrula stage, and transcribing only during embryogenesis, were revealed in the analyzed genes. Through this study, we cloned and identified some genes expressed differentially at early stage during embryo- genesis, which will be a solid base for further researches on their functions and regulative mechanisms during embryogenesis. Key words:Carassius auratus gibelio; Gastrula; Embryogenesis; SMART cDNA library; Differential screening 4期 刘静霞等: 银鲫原肠胚差异表达基因的筛选 365