和对小鼠B16黑素瘤细胞黑素生成的影响

纯试剂等。 1．1．4仪器uV754型分光光度计(上海第三分析 仪器厂制造)，倒置显微镜(Nikon)，自动酶标仪(芬 兰The瑚。公司)，PcR仪[The珊oLifesbiences(HK) Ltd】，AllegraTM64R低温离心机(BeckmanCoulter)， uvi11vmination(UplandCA，U．s．A)，DYY一Ⅲ一4型稳 压稳流电泳仪(上海)，BiospectmmACImagingSys— tem(U．S。A．)，NikonCoolpix950digitalcamera等。 1．2方法 1．2．1墨旱莲乙醇提取物制备取墨旱莲生药在 烤箱中焙干，磨成粉末，用90％的乙醇100mL浸泡 中药粉末，密闭室温浸泡2周，每天摇动数次。2周 后取其醇溶液抽滤，滤去渣滓，①收集提取液，制成 每mL相当于O．1g原生药的溶液，用于豚鼠致色素 实验外涂用。②将滤液放入旋转蒸发仪，调整转速 和温度，使滤液形成稠膏或粉末状，称其重量，然后 溶于DMs0中，调整终浓度为10∥L。用1640培养 基稀释后用于细胞处理，使DMs0的终浓度在0．2％ 以下。 1．2．2动物致色素实验取棕黄色豚鼠6只，均于 背部两侧剃毛成3个分离的去毛区，将墨旱莲乙醇 提取液外涂，每日2次；并用乙醇作为阴性对照，用 8一MOP做为阳性对照，28d后取皮肤活组织，按文 献[4]方法进行观察。在用药物处理过程中，实验动 物始终饲养在阴暗的房间内。 1．2．3小鼠B16黑素瘤细胞的培养小鼠黑素瘤 细胞B16细胞株，用含10％小牛血清的1640培养 基(含两种抗生素：10万u／L青霉素、100mg／L链 霉素)，在37℃、5％cO：孵箱中常规培养，待细胞生 ChinJDeHnatoVenemlIntegTradWMed2006，V01．5No．1 长至近融合状态，o．25％胰蛋白酶消化，以每瓶约 105个细胞传代，每3d传代1次。 1．2．4小鼠B16黑素瘤细胞增殖活性的测定采用 四甲基偶氮唑盐比色(MTr)法，参照文献[5，6】，根据 预实验结果分别用20mg／L、10mg／L、2mg／L的墨 旱莲乙醇提取物作用于小鼠B16黑素瘤细胞株，同 时设定100斗mo讥、50斗m山，L、10斗mol／L的8一MOP 作为阳性对照，并设立对照组：单纯培养基组、空白 对照组(培养基和细胞组)和中药对照组(培养基+ 中药组)。取对数生长期细胞常规消化，调整细胞浓 度为5×104个／mL、取100灿接种于96孔板，37℃、 5％c0：孵箱中培养24h后，每孔加100止稀释好 的中药，每个浓度设立3个复孔。置于孵箱中作用 72h后，常规M，rr法测定细胞增殖率，选择460nm 波长，用酶标仪测定吸光度值@枷)，用A彻值表示 细胞增殖活性。即实验组的细胞增殖活性值=实验 组A圹中药对照组A彻，空白对照组细胞增殖活性 值=空白对照组A矿单纯培养基组A彻。 1．2．5rrYR活性和黑索含量测定参照文献[6，7】， 其中TYR活性和黑素含量均用其460nm波长时的 吸光度值表示，即实验组各指标值=实验组A枷一中 药对照组A枷，空白对照组指标值=空白对照组A—旷 单纯培养基组A彻。 1．2．6逆转录一聚合酶链反应(RT—PCR)测定TYR 及其相关蛋白1／2mRNA的表达参照文献[8】，采用 瞄zol(参照试剂说明书)提取用不同浓度墨旱莲处 理72h的B16鼠黑素瘤细胞株的总RNA。经紫外 分光光度计测得RNAA：。∥瑚为1．6～1．8，并有260 nm吸光度值计算出RNA浓度。引物：根据 TYR、TRP一1／2完整的cDNA序列设计(由大连宝生 物公司合成)，TYR：上游引物为acagatgagtacttg ggag昏c殍cac下游引物为t昏acttgggacattgttccattc ata，扩增片段长度为391bp；TRP一1：上游引物为ttc tcaatggaga对g昏ctgtgaatc下游引物为殍tgtattgcct 昏tatgtccaatagg，扩增片段长度为468bp；TRP一2： 上游引物为殍ggctccattattattct殍tcgaga下游引物 为agagaatctcga殍tccgactaatcag，扩增片段长度为 276bp。R11-PcR反应参照试剂盒说明操作：取3灿 总RNA，分别对TYR、TRP一1及TRP一2mRNA进行 逆转录(RT)反应，条件为55℃30min，99℃5min， 5℃5rnin，然后取出RT液3此进行PCR扩增反应， 各种样本PcR的反应条件为94℃3min，94℃30s， 57℃1min，72℃45s(23个循环)，70℃10min。 B一肌动蛋白(B—actin)作为内参，上游引物为gcatgg 万方数据 中国中西医结合皮肤性病学杂志2006年第5卷第1期 a酽cctg唔gcat下游引物为ctagaagcatttgcg斟gg， 扩增片段长度为326bp，其PcR反应条件为94qC2 111in，94℃45s，58℃45s，72cC45s(35个循环)， 72℃7min。PcR在含EB的2％琼脂糖凝胶中电 泳，在紫外灯下拍照．然后凝胶扫描成像系统分析， 读出各样本DNA荧光强度值，再与B—actin相比即 为其mRNA相对表达量。 1．3统计方法 全部数据均采用(孑招)表示，利用sPSsl3．0统计 软件，采用单因素方差分析的Dunnett检验进行分析。 2结果 2．1动物致色素作用 墨旱莲醇提液涂抹豚鼠皮肤后，在HE组织切片 中可见使皮肤出现不同程度的色素沉着，表皮基底 层及部分棘细胞中下层可见色素增加。与阴性对照组 相比较，Schmorl法染色可见豚鼠表皮基底层中含黑 素颗粒细胞显著增多(P锄．01)；DOPA一氧化酶染色可 见豚鼠表皮内DOPA阳性细胞明显增多(戍O．01)。与 ·3 · 阳性对照组相比未有统计学差异(乃0．05)，见表1。 表1墨旱莲对棕黄色豚鼠背部皮肤的致色素作用(孑±s) 注：与乙醇组比较，伙O．05，“PO．05)，而TRP—l和Ⅱ出一2rIlI州A 图3 TRP一2 图2 TRP一1 图1—4 TYR、TRP一1、TRP一2及p—actin的 mRNA的RT—PCR电泳结果 的表达量各组间差异无显著性(踟．05)，见表3。 表3墨旱莲乙醇提取物对小鼠B16黑素瘤细胞株的TYR、 TRP—l和TRP一2mRNA表达的影响(面如，凡=3)(％) 注：与空白对照组比较，’P<0．05 3讨论 墨旱莲是治疗白癜风中药方剂中常用的药物， 文献报道离体实验中具有促进TYR活性作用。为了 探讨中药墨旱莲在治疗白癜风中的作用机理，我们 选用棕色豚鼠作为动物模型，因其皮肤黑素细胞和 黑素小体分布近似于人类，其色素沉着接近黄种入 皮肤例，可进行药物对7rYR活性调节和黑素生成影 响方面的研究；并选择小鼠B16黑素瘤细胞株作为 万方数据 · 4 · 黑素细胞的替代模型，研究墨旱莲对细胞黑素合成 及其相关蛋白基因表达的影响。 豚鼠致色素实验结果显示出，墨旱莲乙醇提取 液外涂于豚鼠皮肤，表皮基底层及部分棘细胞中下 层可见色素增加，豚鼠表皮基底层中含黑素颗粒细 胞显著增多，DOPA阳性细胞明显增多。墨旱莲具有 促进离体rIYR活性作用，说明其促进黑素生成的作 用可能与TYR的激活有关。 墨旱莲乙醇提取物作用于小鼠B16黑素瘤细 胞结果显示出，可以通过促进细胞增殖及TYR活性 来增加黑素合成。分别与阳性对照不同浓度相比无 统计学差异(尸>0．05)。TYR、7rRP一1和TRP一2基因同 属于TYR基因超家族组成员，它们相互作用共同调 节黑素的生成【10】。RT—PCR结果表明，与对照组相比 较，墨旱莲具有上调TYRmRNA的作用。与之前做 的原位杂交结果相一致【儿j，与阳性对照8一MOP(100 ¨m01／L)相比无明显差异性。而对TRP一1／2mRNA 表达量未见有上调作用，阳性对照8一MOP的结果与 雷铁池等【12】结果相一致。说明墨旱莲通过上调TYR mRNA表达来增加TYR的量，从而促进黑素合成。 本实验中墨旱莲在动物体内实验、离体细胞实验及 分子生物学水平均显示出一致性结果，说明墨旱莲 具有一定的开发前景，值得进一步进行活性成分的 研究。目前国内外还没有对此种中药促进黑素合成 的相关基因水平的研究。 ·消．息· ChinJDe珊atoVenemlIntegTLadWMed2006，V01．5No．1 参考文献： [1]雷铁池，朱文元，夏明玉．89味中药乙醇提取物对酪氨酸酶活性 的上调作用阴．中华皮肤科杂志，1998，28(3)：147—149． [2]刘之力，涂彩霞，任风，等．56味中药乙醇提取物对酪氨酸酶活 性影响及动物致色素作用的研究【J】．中华皮肤科杂志，2001，34 (4)：284—285， [3]徐秋，吴可克，陈丽凤，等．旱莲草对酪氨酸酶激活作用的动力学 研究[J】大连轻工业学院学报，2000，19(1)：25—27． [4]Huang7r，zhongx．Experimentalstudyonthemelanogeniceffectof somecosmetics【盯．JApplCosmet，1998，16(1)：1—6． [5]刘栋，朱文元，谭城．皮质类固醇对培养cloudmans91黑素瘤细 胞株黑素合成的影响[J]．临床皮肤科杂志，2003，32(1)：3—6． 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准，中国中西医结合学会变态反应专业委员会组委会研究决定于2006年9月24～25日在天津举办“首届国际中西医结合变态 反应学术会议暨全国中西医结合变态反应第三次学术会议”同时举办“中西医结合变态反应诊断治疗提高班”。此次会议邀请 了20余位国外变态反应专家和同道讲座、交流，将带给大家国外变态反应科研临床新进展。拟参加本次会议请仔细阅读本通 知并按规定的时间和要求投稿。 会议

内容

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：变态反应疾病的基础与临床研究、病例

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等 会议形式：特别讲演、大会发言、分会发言、书面交流、院士论坛 来稿要求：来穰为中文全文和500字以内的中英文摘要各一份，请附软盘或发送电子邮件，会议提供多媒体和幻灯。 截稿日期：2006年7月1日 来稿请寄：天津市长征医院陈宏、周登远、王莹、刘雅君收(附注：会议征文) 邮编：300021 电话：022—27283090022—27332477 电子信箱：aicp印e爬vip．163．com 网址：www．aic2006tianjin．org舢 万方数据