骨髓源性神经干细胞去甲肾上腺素神经递质变化的实验研究

· 638· CHINESE JOURNAL OF CLINICAL ANATOMY VOL．22 NO．6 2004 骨髓源性神经干细胞去甲肾上腺素 神经递质变化的实验研究 陈剑荣， 徐如祥， 金 澎， 姜晓丹， 邹雨汐， 丁涟沭 (南方医科大学珠江医院全军神经医学研究所，广州I 510282) · 实 验 研 究 · 【摘要】目的：研究骨髓源性伸经干绷胞 体外培养 J支濡导分化条件下能否分泌去甲肾 1．腺素(NE) 方法：分离兔骨髓 质 咆(BMSCs)， {奉外j 用伸经干 胞培养液 和诱导分化 子使其分化为神经干 细胞及神经元样细胞，采用免疫细胞化 、 ：方’法进f 鉴定； 川高效液相色i普法(HPLC)柃洲其NE的含最 结果：BMSCs培养 7～14 d免疫细胞化学 定 Nestin抗 阳性 ；培养 20 d可见长突起神经厄样细咆，伸经 陔蛋门(NeuN)呈阳性表达；HPLC怆洲神经 }HI咆培养液 硬 L一02 细胞等阴性对照组及 BMSCs(O～5 d) 组未检测到 NE，骨髓源性神经丁细咆(培养 7 d、14 d)技伸经元样细咆(培养 20d)均可检测到 NE 随着培 养天数的增加，所 的 NE浓度也逐渐增加(P<0 01) 结论：在适宵条件下．，免 BMSCs可住体外分化成神 经干细胞及神经元样细胞，并合成和分泌 NE 【关键词】骨髓基喷细胞； 冲经十细胞； 玄甲肾卜腺索； 高效液相色谱法 【中图分类号】Q254；Q 421【文献标识码】A 【文章编号】l001～165x(2004)06—0638—03 The studyofnoradrenalinebiologicalactivityinneul~ stem cellsderivedfrombonemal'row CHENJian—rong,XU Ru—xiang．Jin Peng,et a1． Neuromedicine Institute ofChinese PLA．Zhujiang Hospital,Southern Medical University,Guangzhou 510282, ina 【Abstract】Objective：To study whether the neural stem cells derived from bone marrow stromal cells (BMSCs)could excrete neural biological activity material—noradrena¨ ne(NE)in vitro．Methods：Bone marrow stroma1 cells．which came from bone marrow of New Zealand rabbits，were induced and differentiated into neural stem cells and neuronal—like cells by neural stem cell—culture medium and induction factors in vitro，and then evaluated by immunocytochemical method and detected the content of NE by high performance liquid chromatograpy(HPLC)．Results：At the 7—1 4th days after cell culture BMSCs turned into magnus and round cells which presented Nestin—positive antigen，then changed into neuron—like cells with long processus further and presented NeuN —positive antigen at the 20th days following culture．Meanwhile，NE was detected in neural stem cells and their culture mediums，which were cultured for 7 days，1 4days and 20 days respectively，but no NE in BMSCs，neural stem cells—free culture medium and L一02 hepatocyte that were as negative controls under the HPLC check．Analysis of variance showed that the content of NE gradually increased following the elongation of culture time (P<0．01)．Conclusions：Under appropriate conditions．BMSCs of rabbit could proliferate and differentiate into neural stem cells and neuronal—like cells in vitro，which could synthesize and excrete NE as a kind ofneurotransmitter． 【Key words】bone marrow stromal cells； neural stem cells；noradrenaline(NE)； high performance liquid chromatograpy(HPLC) 近来已有许多实验研究从形态学及免疫细胞化学 的角度证实骨髓基质细胞 (bone ma~ow stromal cells 【收稿日期]2004—05—10 【基金项目】国家 j然科学基金(30270491)；全 医学科研“}五” 重大课题(OIZ054)：广东省同然科学基金项 ¨f 科基办 (2000)25]；广东 省科技计划项目[粤财企2001(367)] 【作者简介】陈剑荣(1969一)，女，硕_l|研究， ，’F要从事神经 于细胞 诱 导分 化和 神经 递质 捡；{j!lJ的 典验研 究 ，Tel：(020)335804l6，E—mail： www—usa@163．com。 【通讯作者】姜晓丹，敦授 ，Tel：(020)61643270，E—mail：iiangxiao dan@163．net BMSCs)能在体外诱导分化为具有伸经细胞特征的细 胞。然而，对 BMSCs来源的神经干经胞 (neural stem cells，NSCs)及其所分化的神经．厂L样细胞(neuronal—like cells，NLCs)的生物化学特性研究则罕见报道。本实验 通过对兔骨髓源性NSCs及其分化的神经元样细胞所 含去甲肾上腺素 (NE)神经递质的检测，进一步探讨 BMSCs来源的 NSCs的功能特性 1 材料与方法 1．1 实验动物 维普资讯 http://www.cqvip.com 啦啦JIl目髓耻 I l # 辟鲤-拈n 籼1'4 LI证 【5 Jl ‘ f】 ·a 1 fl～ j k 惝 ⋯ 川1『t总 ． 、 ‘ r一02 蛆仆tff I 'l[t1]~l,Jl 。q谢 J 2 ,Jk雌 ll¨ l¨(Iii,J、【)¨嫂漶川龅 蕾虢 L- n^ - 化 一 J 3 f m 被 II1、 蟾市 ~l!il 4啦『々 刊I I J川if Ⅲ 性 廿幽r^ ‘l们S J'l牲tdimI+l Hf 竹 i l c(iDNII RAI啦 t I札怍 N~t JlII ’，L特” 量 l_ f I NOUN 』 pt州 - M I(11” ． 惭书 f 此小m 1 i T f “ 竹也 }：hi苇 {嘶采 - 他眦 啊 -J、⋯ }f l帐书 lNII 31L 砷 If惜f1)jIHAl 脏川已n I nI I m州 }IllI( I^ Jfi附昔 “ 】 ~lilt『 lciMA 0iiJ rLDIA*IlJ II 【 制均 地 I 4 fsL s帕北 I盘 ’ ft 将 ．啦川缸 ¨ 哺 i l 1¨g r } 忤¨IIi Jlhm li'li~。 l J 曲 凼 L世 转 ’I：100o删}．islft'Il 毒‘ M~utundll r t n ．1I P Il 1 c川引晰 I‘I 7竹J晰Jt l l≈L¨2 10I~／llI Ttl f】 mh1)幢』K bMs‘s f1 l j 推 【⋯R I| ng mli f·DNll_ 【j ml H I 洲 晰 10l【¨I幢 』I 2儿ht¨ iii f J冲 f1fl地蚺嚣 ⋯ “情 f IfIiilf—I r,1．J 】 · " 奇 { t ( 例f l 挑 j 稼她螂 扪 廿圳 f墙雌 [4d mj 拓20 d rN~sl Jnf¨ NutiN常 钮崆 皿fE 雌． I 包研毓 ， - I¨ 脚 i,ll,i Ⅲf 1‘1 l 1：11 剐 n¨ 1洲 I 1 噬 T OSA 0 2I r~lll1)l／I I 11)JA【l22lill~⋯】I I II 2i l ．} ⅢI 4 ,it『 I( i111／inlll I I～L_1^ 、I 11 。『¨一、V．I n 川 }24I h fI，_【}0 7圳 q． ， l l n 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hepatic cells group at beginning after incubation Fig．7 Chromatogram of NE in rabbit BMSCs group at beginning after incubation Fig．8 Chromatogram of NE in rabbit NSCs group at 7d after incubation Fig．9 Chromatogram ofNE in rabbit NSCs group at l4d after incubation Fig．10 Chromatogram of NE in neuron—like cells group derived from rabbit bone ma~ow 3 讨 论 神经干细胞所具有的独特生物学特性使其成为修 复中枢神经系统(central nervous system，CNS)损伤或 退行性病变等功能缺损的理想细胞来源。然而，NSCs 仅有形态特性的成熟还不足以完成修复功能 ，还必须 具备分化后神经细胞的功能特性，如与周围神经组织 建立突触联系，能相互传递电、化学信息等。近年来的 研究证实，在发育胚胎和成年哺乳动物的 CNS存在着 具有多向分化潜能的NSCs或前体细胞 ]。胚胎 NSCs 在体外培养条件下可表现出不同的电生理特性【5l。Riaz ss等在进行人中脑腹侧胚胎前体细胞向多巴胺能神经 元调控转化的实验中，应用 HPLC检测到在胚胎前体 细胞向多巴胺能神经元转化过程中的培养介质中有多 巴胺(DA)及合成前体多巴(DOPAC)的表达，从而证实 转化细胞具有多巴胺能神经元的表型[6l。由于胚胎或成 体神经组织具有来源、免疫排斥及伦理道德的局限性 ， 在临床应用受到限制。近年来骨髓源性 NSCs的研究成 为热点。目前已有许多实验从形态学及免疫细胞化学 方面证实，不同种属来源的BMSCs能在体外诱导分化 为具有神经细胞特征的细胞 。本实验室也对 BMSCs 来源的NSCs及其分化后细胞的功能特性进行了初步 研究 ，但对骨髓源性神经元样细胞 (neuron．1ike cells， NLCs)的NE生物活性物质检测实验研究尚未见报道。 NE属儿茶酚胺化合物家族成员，很早就被证明为 交感神经的神经递质作用于交感神经支配的靶器官。 而 NE的生物合成仅分布在肾上腺髓质的嗜铬细胞和 交感神经元内。本研究 HPLC检测结果方差分析显示 BMSCs开始培养阶段未检测到NE，而经体外培养 7d 后则可检测到NE神经递质成分 ；随着培养天数的增 加 ，NE的含量也渐增加；培养 20 d后的 NLCs组 NE 含量明显高于其他各组(19<0．01)。这提示，BMscs在本 实验条件下是向着神经元方向发育分化的，而随着 BMSCs向神经元发育的成熟 ，NE在 NSCs中合成并以 高浓度贮存于NLCs，并部分分泌到胞外；加入诱导因 子培养的骨髓源性 NLCs所含的 NE浓度与基础培养 组比较无明显差异 ，提示特制培养基可诱导 BMSCs向 NSCs分化。 本研究从生物化学方面证明骨髓源性 NLCs具有 合成分泌NE神经递质的特性。结合培养 12 dNestin抗 原阳性；培养 20 d可见长突起 NLCs形成，NeuN免疫 细胞化学阳性进一步证实由BMSCs分化而来的 NLCs 具有成熟神经元的特征。 【参考文献】 ill Majumdar MK，Thiede MA，Mosca JD，et a1．Phenotypic and functional comparison of culture of marrow·derived mesenchymal stem cell(MSCs) and stromal cells．Journal ofCellularPhysiology，1998，1 76：57~66． [2]柯以铨，，徐如祥，陈长才 大鼠脑损伤‘ 期腑微血管 5．HT、DA含量变 化及其对外伤性脑水肿的影响 『J]．第 ‘0 医人学，学搬 ，1995，1 5 (4)：287～289 [3]Reynolds BA，Weiss S．Generation ofneurons and astrocytes from isolated cells ofthe adult mammalian central nervous system[J]．Science，1 992， 255(5052)：1707． (下转第65l页) 维普资讯 http://www.cqvip.com 中 国 临 床 解 剖 学 杂 志 2004年 第 22卷 第 6期 ·651． 运动神经元 ，促进神经运动功能恢复的作用 。本实验 旨在了解该因子在体情况下对感觉神经元的神经营养 活性。 神经元属终期分化细胞，本身不具备分裂繁殖能 力，一旦损伤无法通过再生恢复原有的细胞数量。正常 情况下，神经元胞体及其轴突作为一个整体通过轴突 的逆行运输将靶器官和雪旺细胞产生的营养物质传送 到神经元胞体以维持其存活并发挥生理功能。轴突损 伤后，逆行运输中断，神经元由于失去赖以生存的物质 基础而逐渐变性死亡，若在神经轴突切断后早期应用神 经营养因子，使受损神经元获得足够的营养支持，则能 使受损的神经元免于或减少死亡。本实验结果显示 SD 幼鼠神经根高位切断后 4周，没有接受 SDNF治疗的 动物，其背根节感觉神经元死亡达41．4％，存活的神经 元胞体明显萎缩，而早期局部应用 SDNF的动物，背根 节感觉神经元的死亡率明显降低，只有 8．2％，存活神经 元未见萎缩，而且断端轴突的生长也好于对照组。说明 SDNF对感觉神经元也具有明显的神经营养活性。 神经损伤早期给予神经营养物质使受损神经元获 得持续的营养支持，减少神经元的死亡，保存了神经纤 维再生的物质基础，将有可能提高神经功能恢复率。当 然，在 sDNF应用于临床前还需进行进一步研究如单 克隆抗体制备，氨基酸序列分析，受体的分布及作用机 理等。 【参考文献】 [1】Son YJ，Thompson WJ．Schwann cell processes guide regeneration of peripheral axons[J]．Neuron，1995，14(1)：125-132． [2】Liu LJ，Zhu JQ，Gu XF．Studies of neurotrophic activities of schwann cell derived neurotrophic factor and its resistant effect on nitric oxide neurotoxicity[J】．Chin J Microsurg，1998，21(4)：2164～266． 刘黎军，朱家恺，顾熊飞．雪旺细胞源神经营养因子的神经营养活性 及其对抗 一氧化氮神 经毒性 作用的研 究 [J]．中华显微外科 杂 志，1998，21(4)：264～266． 【3]Liu L1，Zhu JQ，Xiao JD．Protective effects of Sch warm cell 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