C_MYCsiRNA对急性淋巴细胞白血病Jurkat细胞凋亡的诱导作用

文章编号(Article ID):1009 － 2137(2011)04 － 0879 － 05 ·论著· C-MYC siRNA对急性淋巴细胞白血病 Jurkat细胞凋亡的诱导作用 刘庭波1，2，骆晓峰1，胡建达1，2，陈志哲1 1 福建医科大学附属协和医院，福建省血液病研究所，福建省血液病重点实验室， 福建福州 350001;2 福建医科大学医学技术与工程学院，福建福州 350001 摘要 本研究探讨 C-MYC siRNA对急性淋巴细胞白血病细胞系 Jurkat细胞的增殖、凋亡的影响。采取化学合成 法合成针对 C-MYC mRNA的第 1545 － 1565靶位点设计的 siRNA，经转染剂(HiPerFect transfection reagent)转染入 Jurkat细胞，观察细胞形态学变化;应用四唑氮化合物(MTS)法绘制细胞生长曲线;用细胞集落培养观察 C-MYC siRNA对 Jurkat 细胞增殖的影响;应用流式细胞术和 TdT 酶介导的末端缺失原位标记(TUNEL)法分析细胞的凋 亡。结果表明，不同浓度 C-MYC siRNA作用于 Jurkat细胞后，细胞的生长受到不同程度的抑制，抑制率随 C-MYC siRNA浓度的增高而增高。C-MYC siRNA对集落形成也有明显的抑制作用。TUNEL法、流式细胞仪均检测出细胞 凋亡，且随着作用时间的延长，其凋亡率也逐渐上升。结论:化学合成法合成的 C-MYC siRNA能明显抑制 Jurkat细 胞的增殖与集落形成，并可诱导 Jurkat细胞发生凋亡。 关键词 C-MYC;急性淋巴细胞白血病;Jurkat细胞;小干扰 RNA 中图分类号 R733． 1 文献标识码 A Apoptosis-inducing Effect of C-MYC SiRNA on Acute Lymphoblastic Leukemia Jurkat Cell Line LIU Ting-Bo1，2，LUO Xiao-Feng1，HU Jian-Da1，2，CHEN Zhi-Zhe1 1Key Laboratory of Hematology，Fujian Institut of Hematology，Fujian Medical University Union Hospital，Fuzhou 350001，Fujian Province，China;2College of Medical Technology and Engineering，Fujian Medical University，Fuzhou 350001，Fujian Province，China Corresponding Author:LIU Ting-Bo，Associate Professor． Tel:(0591)83357896． E-mail:liutb@ medmail． com． cn Abstract The study was purposed to investigate the effects of C-MYC siRNA on the proliferation and apoptosis of acute lymphoblastic Jurkat cell line． siRNA targeting the site 1545 － 1565 of C-MYC mRNA was designed and chemi- cally synthesized，then C-MYC siRNA was transfected into Jurkat cells by the transfer agent (HiPerFect Transfection Reagent) ，the morphological changes were observed under inverted microcope;the tetrazole compound (MTS)was applied to draw the cell growth curve;the cell colony test was used to detect the effect of C-MYC siRNA on the proliferation of Jurkat cells;the flow cytometry and TUNEL method were used to analyze the apoptosis of Jurkat cells． The results showed that after Jurkat cells were treated with different concentrations of C-MYC siRNA，the growth of Jurkat cells was inhibited to various degrees，inhibitory rate was enhanced as C-MYC siRNA concentration increased． C-MYC siRNA also could obviously inhibit the cell clony formation． The apoptosis of cells could be detected by flow cytometry and TUNEL method，the apoptosis rate of cells increased along with prolonging of treatment with C-MYC siRNA． It is concluded that the chemically synthesized C-MYC siRNA can inhibit significantly the proliferation and induce the apoptosis of Jurkat cells． Key words C-MYC gene;acute lymphoblastic leukemia;Jurkat cell;small interfering RNA J Exp Hematol 2011;19(4) :879 － 883 基金项目:福建省高校新世纪优秀人才计划，编号 NCETFJ-0705 通讯作者:刘庭波，主任医师、副教授． 电话: (0591)83357896-8039． E-mail:liutb@ medmail． com． cn 2011 － 03 － 03 收稿;2011 － 03 － 28 接受 白血病是一类严重威胁人类身体健康的恶性疾 病，而且白血病发病有年轻化的趋势。目前，尽管人 们已采用化疗、移植治疗等多种方法治疗白血病，但 死亡率仍居高不下。白血病的发生是由于癌基因的 激活，抑癌基因的失活，导致细胞增殖异常、分化障 碍及凋亡受阻。因此，封闭癌基因的异常表达，促进 细胞的凋亡成为探寻白血病基因治疗的有效方法。 急性白血病等血液系统恶性肿瘤的发病机制主要是 由于造血细胞的增殖、分化和凋亡失控所致，受多种 基因和细胞因子的调控，其中 C-MYC 癌基因是重要 ·978·中国实验血液学杂志 Journal of Experimental Hematology 2011;19(4) :879 － 883 的基因之一。C-MYC 基因定位于 8q24 区，由 3 个 外显子，2 个内含子组成，外显子 1、2、3 共同编码相 对分子质量为65 000的蛋白质。C-MYC 蛋白包括 蛋白的二聚体化、转录活性区及其调节细胞内其它 基因表达的功能，在调控细胞增殖，抑制细胞向终末 期分化及抑制细胞凋亡方面有其重要的生物学功 能［1 － 2］。因此，封闭 C-MYC癌基因的异常表达成为 探寻白血病基因治疗的有效手段。 材料和方法 试剂和仪器 RPMI1640(Gibco 公司产品) ;胎牛血清(杭州四季 青公司产品)。RNAi Human /Mouse Starter Kit 和 HiPerFect Transfection Reagent (Qiagen 公司产品) ; CellTiter 96 AQueous 非放射性细胞增殖检测 (MTS)试剂盒和 Dead End Colorimetric TUNEL Sys- tem(Promega 公司产品)。Annexin-V-FITC /PI 凋亡 检测试剂盒(Becton Dickinson公司)。 细胞株与细胞培养 Jurkat细胞株(由本所细胞库提供) ;采用含 20%灭 活胎牛血清的 RPMI-1640 培养液培养，初始细胞浓 度为(1 － 5)× 105 /ml，2 － 3 天换液 1 次，7 － 10 天传 代 1 次，实验用细胞经 0． 4%台盼蓝染色，拒染率 ＞ 95%。细胞置于 37℃、5% CO2、饱和湿度的培养箱 内培养。 siRNA脂质体转染及转染效率的鉴定 通过 GenBank 检索出 C-MYC 的 mRNA 序列 NM_ 002467，以外显子 3 的第 1545 － 1565 的 5'-AAGTT- GGACAGTGTCAGAGTC-3'为目的序列，设计出的针 对 C-MYC的 siRNA，由德国 Qiagen公司设计出目的 序列的随机阴性对照 siRNA 并采取化学合成法合 成上述 siRNA干粉，同时使用由该公司合成的标有 荧光标记(Alexa Fluor 488)的通用随机阴性对照 siRNA，用于计算转染率。鉴定 siRNA 完整性，并测 OD值，计算浓度。细胞 － 20℃存储备用。本实验选 用 Qiagen 公司 HiPerFect Transfection Reagent，转染 方法及步骤参照产品说明进行。荧光显微镜计数: 转染标有荧光标记(Alexa Fluor 488)的通用随机阴 性对照 siRNA后 6 小时，取出部分细胞用计数板计 数，荧光显微镜下观察发绿色荧光的转染阳性细胞， 按下列公式计算转染率。 转染率 =发绿色荧光的细胞数 /细胞总数 (计数板的 4 个大格的范围内) MTS法检测 将对数生长期的 Jurkat细胞按 5 × 104 个 /孔接种于 96 孔板，siRNA的终浓度分别为 300、150、75、37． 5、 18． 75 nmol /L，终体积为 150 μl。同时设正常空白 对照组、转染对照组和随机阴性对照组，按 MTS 试 剂盒说明书，培养 48 小时，做 MTS 比色，量效关系 曲线分析计算 C-MYC siRNA 对 Jurkat 细胞作用 48 小时的半数抑制浓度(IC50) ，以 C-MYC siRNA 浓度 对细胞抑制率的对数值作线性回归，计算 IC50(IC50 值为使细胞存活率下降 50% 的 C-MYC siRNA 浓 度) ，并根据此值确定要检测的各指标的 C-MYC siRNA作用浓度。IC50 = lg － 1［Xm － i(ΣP － 0． 5) ］。 式中 Xm:设计的最大浓度的对数值;i:各浓度倍比 值的对数值;ΣP:各组生长抑制率之和。 细胞的增殖曲线的绘制 实验分组:取对数生长期的 Jurkat 细胞，接种在 96 孔培养板上，5 × 104 /孔，分成正常空白对照组、转染 对照组、随机阴性对照组、C-MYC siRNA 处理组。 每孔总体积为 150 μl，每组设 3 个平行孔。重复种 3 块板，用于 24 小时、48 小时、72 小时的 MTS试验。 细胞于 37℃、5% CO2、饱和湿度条件下培养。分别 于 0、24、48 和 72 小时 4 个时间点，实验结束前 4 小 时取出一板，避光条件下，将四唑氮化合物(MTS)和 吩嗪硫酸二甲酯(PMS)按 20∶ 1 的体积比混合成混 合液，每孔加 20 μl 的上述混合液，继续培养 4 小 时，震荡 10 分钟，充分溶解结晶物，在酶标仪上用单 波长 492 nm 测吸光度(OD 值) ，记录结果，以时间 为横轴，OD值为纵轴绘制细胞增殖曲线，并按下列 公式计算抑制率，实验重复 3 次。 细胞增殖抑制率(%)=［1 －(处理组平均 OD值 / 对照组平均 OD值) ］× 100% 细胞集落形成试验 浓度 1． 6%甲基纤维素 500 μl，加入上述细胞悬液 30 μl，补 20%胎牛血清的 RPMI-1640 培养液至 1 ml，在 24 孔培养板上培养，细胞分为正常空白对照 组、转染对照组、随机阴性对照组、C-MYC siRNA 处 理组，每孔细胞数为 200 个，同时做 3 个平行孔。轻 轻晃动培养板，使细胞均匀分散，置 37℃、5% CO2、 饱和湿度培养箱中培养，7 － 10 天时计数细胞集落 数，＞ 40 个细胞者为 1 个克隆，按下列公式计算集 ·088· 中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2011;19(4) 落形成率，实验重复 3 次。转染后细胞在培养状态 下，用倒置显微镜观察细胞生长状态和形态学改变。 集落形成率 =(集落数 ÷接种细胞数)× 100% 细胞凋亡的流式细胞术检测 按 Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit说明书操 作，具体如下:①收集经 C-MYC siRNA 作用 24、48、 72 小时及各对照组的细胞，离心沉淀后用 1 /15M的 PBS洗涤 2 次;②使用 1 × binding buffer调整细胞密 度为 5 × 105 个 /ml;③吸取 100 μl 细胞悬液至 1． 5 ml EP管，加入 5 μl Annexin V-FITC和 5 μl PI;④室 温下(20 － 25℃)避光轻摇孵育 15 分钟后，再加入 400 μl 1 × binding buffer;⑤1 小时内避光送流式细 胞室检测。 细胞凋亡率的 TdT 酶介导的原位缺口标记 (TUNEL)法检测 收集经 C-MYC siRNA作用 24、48、72 小时及各对照 组细胞，分别涂片。试剂盒为 Dead End Colorimetric TUNEL System，按其说明书操作，高倍镜下观察， DAB显色下凋亡细胞呈棕褐色。计数 200 个细胞， 计算凋亡率。 统计学处理 采用 SPSS 15． 0 软件分析，计量资料实验数据以均 数 ±标准差(mean ± SD)表示。 结 果 转染效果和转染率 荧光标记 siRNA转染 Jurkat细胞后 6 小时倒置荧光 显微镜下计数发绿色荧光的转染阳性细胞，计算转 染率为 67% ±2． 52%(n = 3) ，说明转染效果好。用 MTS法检测 Jurkat细胞对 C-MYC siRNA 的敏感性。 结果表明，不同浓度 C-MYC siRNA作用于 Jurkat细 胞后，细胞的生长受到不同程度的抑制，并在一定范 围内，抑制率随 C-MYC siRNA 浓度的增高而增高， 确立 C-MYC siRNA 对 Jurkat 细胞的半数抑制浓度 (IC50)约为 75 nmol /L(表 1)。 Table 1． Effect of C-MYC siRNA on Jurkat cells for 48 hours Group OD value(mean ± SD) Inhibity rate (%) Normal control 0． 778 ± 0． 017# — Transfection control 0． 761 ± 0． 013# — Random control 0． 786 ± 0． 012# — C-MYC siRNA 18． 75 nmol /L 0． 609 ± 0． 017* 21． 72 37． 50 nmol /L 0． 511 ± 0． 013* 34． 32 75． 00 nmol /L 0． 392 ± 0． 016* 49． 61 150． 0 nmol /L 0． 258 ± 0． 015* 66． 84 300． 0 nmol /L 0． 206 ± 0． 019* 73． 52 * p ＜ 0． 05，compared with control groups． # p ＞ 0． 05，comparison be- tween control groups． siRNA对 Jurkat细胞的增殖抑制作用 MTS法检测显示，转染 C-MYC siRNA 对 Jurkat 细胞 的生长有明显的抑制作用，24 小时的抑制率为 33. 48%，48 小时的生长抑制率为 50． 84%，72 小时 的抑制率为 63． 14%(表 2)。 C-MYC siRNA对 Jurkat细胞集落形成率的抑制作 用 细胞集落试验表明，转染 C-MYC siRNA可显著抑制 Jurkat 细胞集落的形成，正常空白对照组集落形成 率为 17． 3%，转染对照组集落形成率为 17． 7%，随 机阴性对照组集落形成率为 17． 0%，而 C-MYC siR- NA集落形成率仅为 2． 0%，与各对照组比较有显著 下降，而各对照组之间集落形成率无显著差异(图 1)。 Table 2． Inhibitory effect of C-MYC siRNA on proliferation of Jurkat cells (珚X ± SD) Group OD value 0 hour 24 hours 48 hours 72 hours Normal control 0． 221 ± 0． 011 0． 463 ± 0． 015 0． 775 ± 0． 016 1． 267 ± 0． 014 Transfection control 0． 208 ± 0． 012# 0． 485 ± 0． 018# 0． 788 ± 0． 012# 1． 253 ± 0． 012# Random control 0． 216 ± 0． 016# 0． 478 ± 0． 020# 0． 762 ± 0． 015# 1． 238 ± 0． 017# C-MYC siRNA 0． 202 ± 0． 010# 0． 308 ± 0． 012* 0． 381 ± 0． 013* 0． 467 ± 0． 019* ＊p ＜ 0． 05，#p ＞ 0． 05，compared with control groups． ·188·针对 C-MYC 基因的 si RNA 对急性淋巴细胞白血病 Jurkat细胞凋亡的诱导作用 Figure 1． colony formation of Jurkat cells treated with C-MYC siRNA． A:normal control;B:transfection control; C:random control;D:C-MYC siRNA group． 转染 C-MYC siRNA后细胞形态学变化 倒置显微镜下观察发现，转染 C-MYC siRNA 72 小时 后细胞集落明显减少，细胞皱缩，异形细胞增多，细 胞中颗粒增多，细胞碎片增多，出现典型的凋亡形态 学变化，核碎片形成，可见凋亡小体。各对照组细胞 呈悬浮生长，细胞轮廓清楚，悬浮成团，生长旺盛。 siRNA作用后 Jurkat细胞的凋亡 TUNEL法检测显示，C-MYC siRNA作用细胞 24、48、 72 小时后，各处理组均出现棕褐色的凋亡细胞，C- MYC siRNA组凋亡率 24 小时为 8． 5%，48 小时为 21． 5%，72 小时为 34． 5%，随着作用时间延长，凋亡 率逐步升高。而正常空白对照组为 0． 5%，转染对 照组为 0． 5%，随机阴性对照组为 0%，处理组与对 照组比较凋亡率有明显提高，而各对照组之间相比 无显著差异 (图 2)。 Jurkat细胞凋亡 流式细胞检测结果显示，C-MYC siRNA组凋亡率 24 小时为 14． 340%，48 小时为 25． 623%，72 小时为 39． 887%，随着作用时间延长，凋亡率逐步升高。而 空白对照组为 1． 113%，转染对照组为 1． 093 %，随 机阴性对照组为 1． 127%，处理组与对照组比较凋 亡率有明显提高，而各对照组之间相比无显著差异 (图 3)。 Figure 3． Apoptosis rate of Jurkat cells treated with C-MYC siRNA detected by flow cytometry． 1:normal control;2: transfection control;3:random control;4:C-MYC siRNA 24 hours group;5:C-MYC siRNA 48 hours group;6:C-MYC siR- NA 72 hours group． 讨 论 RNAi是生物进化过程中细胞的一种保护性机制，可 Figure 2． Morphological change of Jurkat cells treated with C-MYC siRNA detected by TUNEL (×400)． A:normal control; B:transfection control;C:random control;D:C-MYC siRNA 24 hours group． E:C-MYC siRNA 48 hours group;F:C-MYC siRNA 72 hours group． ·288· 中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2011;19(4) 避免外源性基因在宿主细胞内表达，同时对于细胞内 宿主基因的表达和细胞发育发挥重要作用。选择特 定的靶基因，合成特异序列的干扰片段并应用于靶 细胞内，尤其是恶性肿瘤细胞，可使肿瘤细胞的生物 学行为发生改变，逆转或发生细胞凋亡，达到基因治 疗的目的。Cioca等［6］利用 C-RAF 和 BCL-2 特异性 siRNA转染 HL-60、U937、THP-1、K562 等白血病细 胞系，结果显示可逆转白血病耐药、促进细胞凋亡。 C-MYC基因是参与调控细胞增殖、分化及凋亡 的原癌基因，是 MYC 基因家族的一员，它的表达与 正常细胞的生长、发育、分化和肿瘤细胞的发生、增 殖、分化及凋亡密切相关，而其表达量的变化将会导 致细胞性质的变化。C-MYC 基因以重排、扩增与高 表达方式，产生的磷酸化的 C-MYC 蛋白(P65)是细 胞增殖信号转导的必需因子，也是 G0 /G1 期到 S 期 的启动子［7］。研究表明:C-MYC基因表达失控在肿 瘤发生中起关键作用，而且 C-MYC原癌基因在多种 人类肿瘤细胞中均有异常表达。Collins 等［8］在 1982 年首次报道了 HL-60 细胞株和早幼粒细胞白 血病患者的白血病细胞中 C-MYC基因高表达，其通 过扩增活化或基因重排而异常表达，在其他调控机 制及多种癌基因协同作用下，通过促进 DNA合成与 转录，缩短细胞倍增时间，同时抑制细胞分化，促进 细胞增殖，使细胞信号传导和程序化死亡等正常功 能发生变化，最终导致白血病的发生。Weng 等［9］ 研究发现，C-MYC基因是急性 T 淋巴细胞白血病发 病机制中的重要且直接的靶基因。C-MYC 在白血 病的发生及发展中起重要作用，因此它是白血病基 因治疗理想的基因靶点。 本研究应用目前研究得最为广泛的 RNA 干扰 技术、脂质体转染法将化学合成法合成的针对 C- MYC靶基因的 siRNA 转染急性淋巴细胞白血病细 胞系 Jurkat 细胞。用 MTS 法观察到，转染 C-MYC siRNA后 Jurkat细胞生长显著受抑制，其增殖抑制 率于转染后 24 小时、48 小时、72 小时分别为 33． 48%、50． 84%、63． 14%，说明 C-MYC siRNA 对 Jur- kat细胞增殖抑制作用随时间延长而增强，其中增殖 抑制作用于 48 小时和 72 小时最为明显。集落形成 实验发现，转染 C-MYC siRNA 可显著抑制 Jurkat 细 胞集落的形成。细胞形态学观察发现，转染 C-MYC siRNA后 Jurkat细胞集落减少，细胞皱缩，出现大小 不均，形态多样，细胞中颗粒增多，细胞碎片增多，呈 现显著的凋亡特征，而各对照组细胞呈悬浮生长，细 胞轮廓清楚，悬浮成团，生长旺盛。TUNEL 法检测 细胞凋亡显示，C-MYC siRNA 转染 Jurkat 细胞不同 时间段的处理组均出现棕褐色的凋亡细胞;流式细 胞术分析也显示，不同时间段的处理组 Jurkat 细胞 发生明显凋亡，结果与 TUNEL实验结果保持大致一 致。细胞形态学观察、TUNEL 试验及流式细胞术均 说明了转染剂及随机阴性 siRNA未对 Jurkat细胞产 生毒性，未引起明显的细胞凋亡，且后 2 个实验说明 了随着 C-MYC siRNA作用时间的延长，处理组的细 胞凋亡率逐步升高。作者前期研究 证实，C-MYC siRNA可促进人髓系白血病细胞系 HL-60 凋亡，抑 制急性淋巴细胞白血病细胞系 Jurkat 细胞的 C- MYC、H-TERT表达［10，11］。本研究表明，应用特异性 针对 C-MYC基因的 siRNA 可明显抑制急性淋巴细 胞白血病细胞系 Jurkat 细胞增殖并诱导其调亡，这 为下一步研究 C-MYC siRNA 转染与化疗药物联合 应用，并诱导白血病细胞增强对化疗药物的敏感性 以及动物体内实验提供了理论及实验基础，为白血 病的生物治疗探索了一条新途径，在白血病治疗方 面开辟了新的思路，具有潜在的应用前景。 参 考 文 献 1 Palumbo AP，Boccadoro M，Ballaglio S，et al． Human homologue of moloney leukemia virus mtergration-4 locust (MLVI-4)located 20 kilobases 3' of the myc gene is reagrranged in multiple myelomas． Cancer Res，1990;50(20) :6478 － 6482 2 Mirranda P EI，Valles Ayoub Y，Hernandez Mendoza L，et al． Myc protein and proteins antigenically related with MYC in acute lympho- blastic leukemia． Rev Invest Clin，1991;43(2) :139 － 145 3 Fire A，Xu S，Montgomery MK，et al． Potent and specific genetic in- terference by double-stranded RNA in Caenorhabditfs elegans． Na- ture，1998;391(6669) :806 － 811 4 Tuschl T． Functional genomics:RNA sets the standard． Nature， 2003;421 (6920) :220 － 221 5 Aoki Y，Cioca D，Oidaira H，et al． RNA interference may be more potent than antisense RNA in human cancer cell lines． Clin Exp Pharmacol Physiol，2003;3(1 － 2) :96 － 102 6 Cioca DP，Aoki Y，Kiyosawa K． RNA interference is a functional pathway with therapeutic potential in human myeloid leukemia cell lines． Cancer Gene Ther，2003;10(2) :125 － 133 7 王子明，种铁，张鹏． C-MYC反义寡核苷酸对肾癌细胞的生长抑 制作用及对细胞周期的影响． 西安交通大学学报(医学版) ， 2003;24(6) :611 － 615，623 8 Collins S，Groudine M． Amplification of endogenous myc-related DNA sequences in a human myeloid leukemia cell line． Nature， 1982;298(5875) :679 － 681 9 Weng AP，Millholland JM，Yashiro-Ohtani Y，et al． C-MYC is an important direct target of Notch1 in T-cell acute lymphoblastic leuke- mia / lymphoma． Genes Dev，2006;20(15) :2096 － 2109 10 刘庭波，邹叔彪，陈志哲． C-MYC 小干扰 RNA 诱导人髓系白血 病细胞系 HL-60 细胞凋亡． 中国实验血液学杂志，2009;17(2) 331 － 334 11 刘庭波，骆晓峰，陈志哲等． 针对 C-MYC 基因的小干扰 RNA 对 急性淋巴细胞白血病细胞系 Jurkat 细胞的 C-MYC、h-tert 表达的 影响． 中国实验血液学杂志，2010;18(5) :1151 － 1154 ·388·针对 C-MYC 基因的 si RNA 对急性淋巴细胞白血病 Jurkat细胞凋亡的诱导作用