琼脂糖凝胶电泳的要点

琼脂糖凝胶电泳实验技巧 2010-04-05 10:50 摘要： 琼脂糖凝胶电泳是核酸常用的实验技术。虽然很多参考书上均有该方法的介绍El’ ，但实际操作中的一些技巧是无法从书本上获得的，本文介绍r琼脂糖凝胶电泳的实验技巧，这些源自多年的研究生教学实践，对初涉分子生物学实验者有一定的指导意义。 关键词： 琼脂糖凝胶；电泳；技巧 实用预防医学2006年8月 第13卷第4期Practical Preventive Medicine，Aug．2006，Vol 13，No 4 核酸分子是两性解离分子，在高于其等电点的电泳缓冲液中，其碱基不解离，而磷酸基团全部解离，核酸分子因而带负电荷，电泳时向正极迁移。琼脂糖主要从海洋植物琼脂中提取而来并经糖基化修饰，为一种聚合链线性分子，使用琼脂糖凝胶作为电泳支持介质，发挥分子筛功能，使得大小和构象不同的核酸分子的迁移率出现较大差异，从而达到分离的目的。琼脂糖凝胶电泳操作简单、快速，通过调整其使用浓度，使得分辨率达到大多数实验的要求，因此成为分离、鉴定、纯化核酸分子的常用方法。但操作过程中仍有不少要注意的问题。 1 凝胶制作 1．1 凝胶浓度 配制凝胶的浓度据实验需要而变 ，一般在0．8％ ～2．0％之间，如果一次配制凝胶100 ml，没用完的凝胶可以再次融化，但随着融化次数的增加，水分丢失也越多，凝胶浓度则会越来越高，导致实验结果不稳定，补水办法：一是在容器上标记煮胶前的刻度，煮胶后补充相应的水分至原刻度；二是在煮胶前称重，煮胶后补充水至原重量。粗略一点的方法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值。以保证凝胶浓度基本维持在原浓度。核酸染色剂溴化乙锭(ethidium bromide)可加在融化的琼脂糖中，终浓度为0．5 t*g／ml；也可在电泳结束后染色。 1、2 梳板的选用 一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，梳齿宽厚，形成的点样孑L容积较大，用于DNA 片段回收实验等；相反，梳齿窄而薄，形成的点样孑L容积就较小，用于PCR产物、酶切产物鉴定等。梳板的选择主要是看上样量的多少而定，一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。另外，每次制胶时都要注意梳齿与底板的距离至少要1 mm，否则，拔梳板时易损坏凝胶孑L底层，导致点样后样品渗漏。当然，点样孑L的破坏还与拔梳板的时间和方法有关，一般凝胶需冷却30 min以上方可拔梳板，应急的情况下可以将成型的凝胶块放4℃ 冰箱中冷却15 min 左右，拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中，然后垂直向上慢慢用力，因为有液体的润滑作用，梳板易拔出且不易损坏点样孑L。2 点样 点样需加上样缓冲液，因为上样缓冲液中加了甘油或蔗糖增加密度，使样品沉入孑L底；指示样品的迁移过程，上样缓冲液中一般加了两种指示剂，溴酚兰和二甲苯青(值得注意的是指示剂并非染色剂，DNA染色剂是溴化乙锭，而且要在紫外光的激发下才能看见桔红色荧光)。上样缓冲液储存液一般为6× (10×)，表示其浓度为工作浓度的六倍。使用时上样缓冲液应稀释到一倍浓度。点样方法是将移液器基本垂直点样孑L，用另一只手帮助固定移液器下端，移液器枪头(Tip)尖端进入点样孑L即可将样品注入孑L内，千万不可将Tip尖插至孑L底，并点上适合的DNA分子量标准，所谓适合是指样品DNA分子量大小应基本在DNA分子量标准范围之内。 3 电泳 将电泳仪的正极与电泳槽的正极相连，负极与负极相连，核酸带负电荷，从负极向正极移动。电泳槽中电泳缓冲液与制胶用电泳缓冲液应相同，电泳缓冲液刚好没过凝胶1 mm 为好，电泳缓冲液太多则电流加大，凝胶发热。电泳时凝胶上所加电压一般不超过5 v／cm(指的是正负电极之间的距离，而不是凝胶的长度)，电泳时间一般为3O～60 min，根据实验需要也可作适当调整，电压增高，电泳时间缩短，核酸条带相对来说不够整齐，不够清晰；相反，电压降低，电泳时间较长，核酸条带整齐清晰。另外，如果电泳后样品泳动很慢或者没泳动，请检查胶模两端的封口胶条是否已去掉。 4 结果分析 较成功的电泳结果是分子量标准条带整齐清晰，样品条带也整齐清晰，如果条带模糊暗淡，单从琼脂糖凝胶电泳角度来说，可能的原因：溴化乙锭的质和量怎样?溴化乙锭见光易分解，母液配制时间过长或保存不当(一般4℃ 避光保存一年内有效)，或者终浓度没达到0．5 vg／ml；电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓冲能力下降。特别是TAE缓冲液，一般用2～3次就要更换，TBE缓冲液则可使用10次左右。 实际工作中经常发现DNA 分子量标准小片段模糊不清，那足因为琼脂糖凝胶浓度一般不会超过2 0％ ，较小的核酸片段 在它的分辨范围之内，并且EB带正电荷，电泳时会向负傲移动，如果将凝胶置含EB(0．5#g／m1)的水溶液中30 min，较小的片段则可重新染色：另外，溴化乙锭(EB)是一种中等强度诱变剂，操作过程中要戴手套，并将加有EB的染色液作好标记、妥善保存 。。 [参考文献] [1 J萨姆布鲁克，D．w 拉塞尔著，黄培堂，等泽分子克隆实验指南[M ．第三版，385—396． [2]卢圣栋．现代分子生物学实验技术[M]．第二版，8O一96． 全文下载：http://www.bbioo.com/BBS/viewthread.php?tid=18710 DNA电泳常见问题分析： 1、 琼脂糖胶液的制备：称取1 g 琼脂糖，置于三角烧瓶中，加入100mlpH8.3Tris-硼酸EDTA缓冲液，瓶口扣上一小烧杯，于（110---115度）加8-10分钟，琼脂全部融化于缓冲液中。取出摇匀，即为1%琼脂。（也可加溴化乙啶2.5ul）     2、 凝胶板的制备     用橡皮膏将凝胶塑料托盘短边缺口封住，置水平玻板或工作台面上（须调水平，将样品槽模板（梳子）插进托盆长边上的凹槽内（距一端约1.5cm）。梳子底边与托盘表面保持0.5一1mm的间隙．待琼脂糖冷至65℃左右。取25mL小心地倒入托盘内，使凝胶缓慢地展开直至在托盘表面形成一层约3mm厚均匀胶层．液内不存有气泡．室温下静置0.5一lh。待凝固完全后，用小滴管在梳齿附近加人少量缓冲液润湿凝胶，双手均匀用力轻轻拔出样品槽模板（注意勿使样品槽破裂），则在胶板上形成相互隔开的样品槽．     3、 取下封边的橡皮膏．将凝胶连同托盘放人电泳槽平台上．用缓冲液先填满加样槽，防止槽内窝存气泡。接着再倒人大量 Ph8.3   Tris-硼酸—EDTA缓冲液直至浸没过凝胶面2—3mm。     4、加样       将酶解后的DNA样品液与溴酚蓝-甘油溶液以4：1的体积比混合，用微量注射器分别加人到凝胶板的加样槽内．每个糟加10ul左右。因此加样量不宜超过20ul，避兔因样品过多而溢出．污染邻近样品．加样时．注射器针头穿过缓仲液小心插人加样槽底部，但不要损坏凝胶槽，然后缓慢地将样品推进槽内让其集中沉于槽底部．     5、 电泳      加样完毕，将靠近样品槽一端连接负极．另一端连接正极（千万不要搞错），接通电源，开始电泳。在样品进胶前可用略高电压．防上样品扩散，样品进胶后，应控制电压降不高于5V／cm(电压值V／电泳板两极之间距离比)．当染料条带移动到距离凝胶前沿约lcm时，停止电泳。     6、染色            将电泳后的胶取出，小心椎至0.5ug／ml溴乙锭染色液中，室温下浸泡染色30min     7、 观察与拍照      小心地取出凝胶置托盘上，并用水轻轻冲洗胶表面的溴化乙锭溶液，然后再将胶板推至预先浸湿并铺在紫外灯观察台上的玻璃纸内，在波长254nm紫外灯下进行观察DNA存在的位置呈现橘红色荧光，肉眼可观察到清晰的条带．荧光在4一6小时后减弱，因此，初步观察后，应立即拍照记录下电泳图谱．观察时应戴上防护眼镜或有机玻璃防护面罩，避免紫外光对眼睛的伤害．      拍照时，照相机加上近摄圈和红色滤光铺头，用全色胶卷．56光圈，曝光时间根据条带，荧光的强弱进行选择，10—60s．将电泳图谱底片适当放大为照片．     8、制作测量分子量标准曲线      在放大的电泳照片上用卡尺测量出 ADNA l酶解各片段的迁移距离，以DNA酶解各片段分子量为纵坐标，它们的迁移距离为横坐标，在半对数坐标纸上连结各点划出曲线，即为DNA分子量的标准曲线． ：      （1）溴乙锭是DNA诱变剂，配制和使用EB染色液时，应戴乳胶手套，井且不要将该溶液洒在桌面或地面上．凡是沾污过溴乙锭的器皿或物品，必须经专门处理后．才能进行清洗或弃去．      （2）为了使DNA完全酶解．需要加入适量、足够的酶液。太少反应不完全，太多则很费．由于每次购进的酶浓度不可能相同．因此，酶和DN A加入的体积不能固定，合适的酶量应该通过预试验来定．      （3）DNA酶解过程中，使用的器具都应千净，并经消毒。配制试剂需用灭菌的双蒸水还要防止限制性内切酶被污染。      （4）加样量的多少决定于加样槽最大容积．可以采用大小不同样品糟模板以形成容积不同的加样槽．加人样品的体积应略少于加样槽容积．为此．对于较稀的样品液应设法调整其浓度或加以浓缩。 比较3种使用EB方法，采用（1）与（2）可与实验过程中随时DNA的迁移情况，极为方便。但是（1）的操作更需小心，防止实验用具及台面的EB污染。所以一般选用（2）。（3）的好处是电泳过程中DNA保持本来的状态，有利于凝胶图谱分析，更能准确地测定DNA分子量。因为在凝胶中有EB时，一定量EB插入DNA就会使双链线状DNA的迁移速度下降。 EB是强致癌剂，因此使用过程上要注意戴手套，及时用高锰酸钾处理污染物。具体的方法如下。 （1）加入足量的水使溴化乙锭的浓度降低至0.5mg/ml以下。 （2）加入1倍体积的0.5mol/L KmnO4，小心混匀后再加1倍体积的2.5mol/L HCl。小心混匀，于室温放置数小时。 （3）加入1倍体积的2.5mol/L NaOH，小心混匀后可丢弃该溶液。 以前曾广泛采用的用次氯酸处理溴化乙锭稀溶液的方法，效果不好。 此外，溴化乙锭在262℃分解在标准条件下焚化后也不再具有危害性。 4．溴酚蓝指示剂：常用的电泳上样缓冲液含溴酚蓝，有的还含有二甲苯青，这些指示剂可以指示电泳的速度，也可以利用其迁移率大致估计DNA的分子量。溴酚蓝在琼脂糖凝胶中移动的速率约为二甲苯青FF的2.2倍，而与琼脂糖浓度无关，以0.5×TBE作电泳缓冲液时，溴酚蓝在琼脂糖中的泳动速率约与长300bp的双链线状DNA相同，而二甲苯青FF的泳动则与4kb的双链线状DNA相同。在琼脂糖浓度为0.5～1.1%的范围内，这些对应关系受凝胶浓度变化的影响并不显著，但在聚丙烯酰胺凝胶中其对应关系受凝胶浓度影响较大（详见附录表三）。此外蔗糖使样品密度增大，使样品在点样时沉于点样孔底部，不扩散。上样缓冲液一般配成6倍的，加样时，加入点样量的1/6即可。