动物细胞培养和核移植技术（兴仁）

知识改变命运，学习成就未来 动物细胞培养和核移植技术 兴仁中学备课组 教学过程 教学 教学手段和方法 预期目标 1、 引言 2、学习新课： 一、动物细胞培养 (1)动物细胞培养的定义 (2)动物细胞培养的过程 (3)动物细胞培养的条件 (4)动物细胞培养技术的应用 二、动物细胞核移植技术和克隆动物 1、核移植定义 2、体细胞核移植的过程 3、体细胞核移植技术的应用前景 4、体细胞核移植技术存在的问题 三、布置作业 师：前面，我们学习了植物细胞工程，今天，我们开始了解动物细胞工程。首先，请回顾：植物细胞工程有哪些基本技术？ 生：植物组织培养，植物体细胞杂交。 师：那动物细胞工程又有哪些基本技术呢？ 生：动物细胞培养，动物细胞位移植，动物细胞融合，生产系克隆等。 师：通过阅读你应注意哪些？ 生：1.动物细胞培养与植物组织培养莫要混淆 2.动物细胞培养技术是动物细胞工程技术的基础。 师：请阅读材料，小组讨论解决 材料一：对于大面积烧伤的病人，自体健康皮肤非常有限，使用他人皮肤来源又不足，且会产生排斥反应。怎样才能获得大量的自体健康皮肤呢？ 材料二：单细胞产生的蛋白质很少，怎样才能获得大量的分泌蛋白呢？ 生：取相应细胞，大量培养，即通过动物细胞培养。 师：很好！对于细胞培养我们要了解两个问题。第一个问题：什么是动物细胞培养？ 生：动物细胞培养是从动物机体中取出相关的组织，将它分散成单个细胞，然后放在适宜的培养其中，让这些细胞生长和增殖。 师：第二个问题：怎样进行动物细胞培养？ 生：首先，将组织分散成许多单个细胞 然后，用培养液培养 师：动物细胞，培养过程中应注意哪些地方？ 生：1.用胰蛋白酶或胶原蛋白酶处理组织，使其分散成单个细胞。 2.培养皿或培养瓶的内面光滑、灭毒，易于贴附，以促成细胞贴壁生长，防止细胞的接触抑制。 3.贴满瓶壁的细胞塞重新用胰蛋白酶等处理，便于分瓶继续培养。 师：进行动物细胞培养时用胰蛋白酶分散细胞，表明细胞的物质主要是什么成分？用胃蛋白酶行吗？ 生：说明细胞间的物质主要是蛋白质。 不行，多数动物细胞培养适合的PH为7.2-7.4，而胃蛋白酶的作用的适合PH为2，PH大于6时，蛋白酶就会失去活性。胰蛋白酶的PH为7.6。 师：动物细胞培养过程中培养了几次？ 生：两次，原代培养和传代培养。 师： 动物 剪碎 细胞 原代培养 细胞贴 细胞 胰蛋白酶处理 悬浮液 满瓶壁 胰蛋白酶处理 10~50 核型改变 获得 分瓶传代培养 代细胞 继续传代培养 不死性 师：目前使用的或冷冻保存的正常细胞通常为10代以内,以保持细胞正常的二倍体核型。 师：体外培养细胞时需要一定的营养和条件。下面，我们来具体了解。 师：为了使体外动物细胞培养顺利进行，应营造怎样的环境？ 生：无菌、无毒的环境，培养液和所有培养具进行无菌处理。 师：动物细胞培养中，还不能出现培养基污染，那又该如何避免？ 生：培养液中添加一定量的抗生素。 师：很好！细胞培养的过程中会产生代谢产物，其结果会对细胞自身造成危害，那又该怎样避免呢？ 生：定期更换培养液。 师：植物组织培养的培养基中有哪些物质？ 生：水、无水盐、植物激素等 师：那么，动物细细胞培养的培养液中含有哪些物质呢？ 生1：糖、氨基酸、促生长因子、无机盐、微量无素等。 生2：还有血清、血浆等。 师：上述营养物质按其种类和所需数量严格配制而成的培养基，称为合成培养基。 师：植物组织培养时需加入激素，而动物细胞培养中也需要激素，培养基中却未直接加入，其可能在哪种物质？ 生：血清中。 师：据此来看添加血清，是否仅提供动物激素？ 生：不是，还有蛋白质、氨基酸、葡萄糖等 师：很好，除此之外还需要适宜的温度和PH，以及气体环境，具体范围如何？ 生：对哺乳动物而言，温度多以36.5±0.50C为宜，而PH多为7.2—7.4。 细胞培养所需气体主要有O2和CO2，O2是细胞代谢所需的，CO2主要维持培养液的PH，具体而言，动物细胞培养中将培养皿或松盖培养瓶置于95%空气加5% CO2的混合气体的培养箱中进行培养。 师：动物细胞培养又有何用途呢？请从书中寻找。 生：1.大规模生产有重要价值的生物制品，如病毒疫苗，干扰系、单克隆抗体等。 2.用于基因工程和检测有毒物质，判断物质的毒性。 3.用于生理、物理、药理等方向的研究，如筛选抗癌药物。 师：上述中为什么说动物细胞培养可用于基因工程？ 生：动物细胞是基因工程技术中常用的受体细胞。 师：同学们，请回顾植物组织培养的原理是什么？植物组织培养的结果又如何？ 生：植物细胞具有全能性。结果：形成完整的植株。 师：那么能否用类似的方法，使动物细胞发育成一个完整的个体呢？ 生1：可以，例如克隆羊“多莉”采用的克隆技术。 生2：不可以，因为高度分化的动物细胞的全能性受到抑制。 师：究竟哪一个正确呢？ 高度分化的植物组织仍保持着全能性，但动物细胞与植物细胞不同，动物细胞全能性会随着动物细胞分化程度的提高而逐渐受到限制，分化潜能逐渐变弱。目前还不能用类似植物组织培养的方法获得完整的细胞个体，用动物细胞克降的动物，实际是通过核移植来实现的。 师：我们一起回顾克隆羊“多莉”的形成过程： 甲：白面母绵羊 乙：黑面母绵羊 乳腺细胞 卵细胞 ⊙ ⊙ • O 核移植 离心、振动、电刺激 ⊙ 动物细胞培养 胚胎 胚胎移植 丙绵羊子宫 “多莉” 从上述过程，请归纳动物核移植定义。 生：动物核移植是将动物的一个细胞的细胞核，移入一个已经去掉细胞核的卵母细胞中，使其重组并发育成一个新的胚胎，这个新的胚胎最终发育为动物个体。 师：对于哺乳动物而言，核移植可以为哪几类？ 生：胚胎细胞核移植和体细胞移植 师：胚胎细胞与体细胞分化程度高低如何，全能性大小如何？ 生：胚胎细胞分化程度低，全能性较高 师：因此，动物体细胞核移植的难度也就明显高于胚胎细胞核移植。虽然体细胞移植难度较大，但随着科技的发展，我国已成功地克隆了牛、羊等多种哺乳动物。下面，我们就以克隆高产奶年为例，来说明体细胞核移植的大致过程。 生：（电脑操作：提供体细胞核移植过程中的各图和箭头，请学生用鼠标拖动，按序排列组合） 师：此过程中为什么选用MII期（减数第二次分裂中期）卵母细胞呢？ 生：此时细胞核的位置靠近第一极体，便于用微型吸管将细胞核和第一极体一起吸出。 师：目前去核的方法是显微操作去核，如梯度离心、紫外光短时间照射、化学物质处理等。这些方法是在没有刺破透明带或卵母细胞质膜的情况下，去除细胞核或使卵细胞核DNA变性，从而达到去核目的。 师：核移植中，怎样促进供体细胞核与去核的卵母细胞融合？ 生：通过电刺激。 师：最后产生的犊牛其遗传基础为什么与供体奶牛相同？ 生：因遗传物质主要位于细胞核中，而融合细胞的细胞核仅由供体奶牛提供。 师：该犊牛的表现型与供体奶牛完全相同吗？为什么？ 生：不，因为融合细胞的细胞质基因来自MII期卵母细胞（线粒体）。而表现型受核基因和质基因共同控制，同时又受到环境的影响。 师：书中提到在体细胞的细胞核移植到受体卵母细胞之前，必须先去掉受体卵母细胞的核，这是为什么呢？ 生：这样是为了使核移植的胚胎或动物的遗传物质全部来自有重要自用价值的动物提供的体细胞，在供体细胞的细胞核移植至受体细胞之前，必须将受体细胞的遗传物质去掉或将其破坏。 师：同学们还有什么疑问吗？ 生：老师，在体细胞核移植过程中，用于核移植的供体细胞一般都选用传代10代以内的细胞，那是为什么呢？ 师：培养的动物细胞一般当传代至10~50代左右时，部分细胞核型可能会发生变化，其细胞遗传物质可能会发生突变，而10代以内的细胞一般能保持 正常的二倍体核型。因此，在体细胞核移植中，为了保证供体细胞正常的遗传基础，通常采用传代10代以内的细胞。 师：体细胞核移植技术的出现，将会有怎样的应用前景呢？ 请几位同学脱离书本，分别各从一个方面来复述一下？ 生1：在畜牧业生产方面：利用体细胞克隆技术可以加速家畜遗传改良进程，促进优良畜群繁育；在保护濒危物种方面：利用体细胞核移植技术增加这些动物的存活数量，挽救濒危物种。 生2：在医药方面：①利用转基因克隆动物生产珍贵的医用蛋白；②利用转基因克隆动物细胞、组织器官作为异种移植的供体，治疗疾病；③利用人的核移植胚胎干细胞经诱导分化，形成相应的组织、器官，用于组织器官的移植； 生3：在科研领域方面：①研究克隆动物和克隆细胞，从而更深入地了解胚胎发育及衰老过程；②利用克隆动物做疾病模型，使人们更好的追踪研究疾病的发展过程，从而治疗疾病。 师：有了体细胞核移植技术，就可以随时生产每个人自己的器官。如果这样，我们人是否可以像汽车那样坏了零件换一个，换掉生病的器官，从而使人长生不老呢？ 生1：不可以…… 生2:可以…… 师:下面我们看一看克隆羊“多莉”研究过程，出生后生活情况以及死亡的原因等相关材料。 材料一：克隆羊“多莉”的摇篮——英国罗斯林研究所曾进行过约３００例羊细胞克隆－移植实验。结果除“多莉”以外，其余克隆羊或胎死腹中，或以畸形问世，而且后者发生几率高达９９％。目前的体细胞动物克隆实验成功率都非常低，据哈里·格里芬所长称，小羊“多莉”是两百多个克隆胚胎中惟一的成功者。他说，在公开发表的研究里，克隆胚胎最终成活率大概是２％，实际成功率很可能比这还要低得多。许多动物在即将出生或出生后不久即死去，肺、肾、心血管系统等重要器官出现问题的风险很高。 材料二：1996年7月5日，苏格兰罗斯林研究所和英国PPL公司共同培育的克隆羊——“多莉”问世，1997年2月23日公布于众，引起各界的普遍关注。 2003年2月14日，罗斯林研究所证实“多莉”已死亡。“多莉”的尸体已解剖并制成标本，现存放于苏格兰国家博物馆。“多莉”的死亡再次引起世界的关注。 据介绍，绵羊通常能活到11~12年。但2002年1月科学家发现“多莉”羊的左右腿患上了关节炎这种典型的“高龄病症”，以后又得了老年羊常得的肺部感染疾病。研究人员不得不对其实施了“安乐死”。“多莉”羊的“英年早逝”，震惊了世界，引起了人们对克隆动物健康的关注，以及对克隆技术的发展前景的再思考。 师：从上述材料中同学们有何发现？ 生1：高度分化的哺乳动物体细胞的细胞核仍具有全能性 生2：“多莉”之死可能与克隆技术有关。从理论上讲，这种技术如果操作正确，卵细胞就可正常发育。但实际操作过程的不稳定性，其过程一点小缺陷都可导致严重的健康问题等。 生3：“多莉”早衰老性死亡。生命的长短取决于细胞分裂的次数。“多莉”羊之所以6岁多就出现早衰症状，是因为它的遗传物质取自于一头6、7岁的绵羊。如果加上用于克隆“多莉”羊的绵羊6岁的年龄，“多莉”羊也算寿终正寝了。 （注：其他合理解释也可。如：“多莉”患有进行性肺病，进行性疾病的特点是症状不断加重，患有状况不断恶化的疾病，最终无法治疗等等。） 生4：体细胞核移植技术还存在诸多问题。 师：是啊。尽管体细胞核移植技术已经在许多种动物中获得成功，但其成功率仍然非常低，产下的活克隆动物占移植克隆胚胎的比率平均不到10%。克隆技术的各个环节也有待进一步改进。此外，绝大多数克隆动物还存在健康问题，许多克隆动物表现出遗传和生理缺陷。对克隆动物食品的安全性也存有争议。 总之，体细胞核移植技术的研究仍在继续深入，人类对克隆技术的应用还有许多问题需要解决。期待在不远的将来，克隆技术能更好地造福于人类。 今天，我们主要学习了动物细胞培养和核移植技术，着重探讨了动物细胞培养的过程及条件、用动物体细胞核移植技术克隆动物的过程，希望同学们课后再在复习中尤其要将上述两点把握牢固。 师：1.完成书本P50课后思考与探究的练习题 2.课后思考：（1）动物细胞培养过程中两次用到胰蛋白酶的作用一样吗？胰蛋白酶在作用时会否把细胞消化掉，为什么？ 3.请同学们收集基因工程的相关资料，了解基因工程的相关进展。 4．完成课后阅读，了解克隆羊“多莉”培育的相关知识。 附：课后阅读材料： 材料一：细胞核的吸取 吸核的方法不是将微吸管头刺入供体细胞内吸取细胞核，而是利用显微操纵台通过轻轻地来回转动千分尺外径，将一个细胞慢慢地吸入微吸管。必须注意微吸管的内径要比细胞小，这样能使被吸入的细胞由于吸力的作用而破裂，结果可以依靠目测，将细胞核和包在它周围的一部分细胞质一起吸入管内，避免细胞核直接与液体接触，以免受损。还应调节使供体细胞尽量靠近管口，避免注核时带入较多的手术液。 材料二：胚胎细胞核移植研究进展 在1981年， Illmensee和Hoppe将小鼠囊胚的内细胞团的细胞核移植到去核的受精卵内，获得了首批克隆的小鼠。这是世界上首次获得哺乳动物克隆成功，但其实验未被其他的研究人员所重复。 1983年Mcgrath和Solter首次利用显微操作技术和细胞融合技术，将单细胞期小鼠胚胎作为核供体进行核移植，得到了产仔，并建立了重复性很高的核移植程序，使得核移植效率大大提高。 1986年，Willadsen等用绵羊早期胚胎的卵裂球作供体，用去核的第二次减数分裂中期（Second Meiotic Metaphase, MII）卵母细胞作受体，并用电融合的方法代替了仙苔病毒诱导供体卵裂球与去核卵母细胞的融合，研究发现电融合方法比病毒融合法更有效，核移植胚胎的体外发育能力更强，重组胚移植后获得了核移植后代，这是首次在家畜上获得了成功。 Willadsen等在实验中阐明了哺乳动物胚胎细胞核移植中两个全新的观点：（1）作为核受体，卵母细胞比受精卵有更大的优越性；（2）绵羊桑椹胚的细胞核具有发育的全能性，并建立了以早期胚胎卵裂球为供体，MII期卵母细胞为受体胞质以及用电融合方法诱导供体细胞核和受体胞质融合这一整套技术。 材料三：几种哺乳动物胚胎细胞核移植 兔：Stice和Robl（1988）用电融合方法将8-细胞期的卵裂球移入去核的MII期卵母细胞内，获得了世界首批6只基因型完全相同的核移植兔。 猪：Prather等（1990）在研究发现，猪核移植胚发生了发育程序的重排，出现供体核膨胀，并认为核的膨胀程度与卵裂球的发育时期无关。2001年 4月，PPL公司宣布他们在去年得到体细胞核移植猪后，又通过体细胞核移植的方法得到了5头带有人类基因的转基因猪，这些猪可望减小与人体器官的免疫排斥反应，为人类提供可移植的器官。 羊：早在1986年，Willadsen用8-16细胞期的胚胎作为核移植供体，首次用去核的MII期卵母细胞作为核移植受体，并用电融合方法代替仙苔病毒来诱导供体卵裂球细胞与受体胞质相融合，获得了核移植后代。该方法成为以后核移植的常规方法，为以后其它家畜胚胎细胞核移植和体细胞核移植的成功奠定了技术基础。 开门见山，复习引入，形成对比 学生阅读P44第一段 学生阅读提炼 投影展示，学生阅读和讨论相结合。 师生一起阅读教材，学生自主性归纳，突出本节课重点。 学生讨论，思考并回答 教师，进一步突出重点 学生讨论、思考 学生看书 引导总结 学生阅读 学生讨论 呈现幻灯片 学生归纳 学生看插图，利用拼图 学生探讨 学生自主性阅读 学生讨论，各抒己见 幻灯片呈现相关资料 讲授 课内与课结合 延伸课外 承上启下，让学生将本节内容与上节内容形成有机联系。 提高学生阅读分析的能力。 自然过渡到本节学习内容，加深理解动物的细胞培养的使用前提 培养学生提炼信息，归纳知识的能力。 了解动物细胞培养中的操作原因 自然过渡 明析动物细胞培养的需环境 复习巩固植物组织培养 以上教学改变直白的教学方式，通过诱思，提高学生的思维能力。 提出问题，放导思考，培养思维的广阔性。 引导学生正确认识克隆实质 培养学生的归纳能力 自然过渡 培养学生合作解决问题的能力 调动学生的积极性，充分解惑 培养学生开放性思维 自然过渡 再次突出本节课的中心、重心所在，便于学生巩固 体现基础知识的准确应用。在运用中加深对基础知识的深层次理解。 调动学生学习生物学的兴趣 欢迎各位老师踊跃投稿，稿酬丰厚 邮箱：zxjkw@163.com 第 4 页 共 8 页