人参总皂苷对造血细胞红细胞生成素受体表达的影响

组既往实验表明，50mg／L 的鸭PG浓度可显著增强脐血造血细胞的集落形成 率【11，培养体系中加入不同浓度髑PG，其终浓度分 别是25，50，75和100mg／L，以不加聪PG组为对照 组，所有培养均在10mL培养瓶中，37℃，5％二氧化 碳及饱和湿度下培养24h后收集细胞，1％多聚甲 醛固定15min后，进行流式细胞仪检测，Elisa分析， 免疫组化染色观察各组脐血单个核细胞膜表面E— POR受体表达变化。 1．2．2流式细胞仪检查在重庆医科大学儿童医院 流式细胞仪检查室检查，直接荧光法标记，PBS洗去 荧光抗体，悬浮后以冰盒送检。 1．2．3细胞Elisa实验于96孔微孔板上进行，一抗 兔抗人EPOR抗体稀释度为l：500，二抗羊抗兔 I舡稀释度为l：300，TMB显色，硫酸终止显色，每 组复种3孔，以自动酶标读数仪(Bio—RadE2550 型，入=450nm)测定OD值。相同实验重复3次。 1．2．4免疫细胞化学收集各组细胞进行离心涂 片，按免疫组化染色试剂盒操作说明进行染色。一 抗为EPOR，按l：400稀释。以苏木素复染细胞核。 1．3统计学分析 数据以均数±标准差(互±s)表示，组间比较用 方差分析，P<0．05为差异有显著性。 2结果 余各药物分组平均荧光强度(Fn)除以对照组荧光 值得相对于对照组读数，可有效清除各样本之间的 随机误差，公式：相对对照组读数=FIl／】m。鸭PG 25～75mg，L均能提高EPOR脐血细胞膜表面的表达 量，以髑PG50mg／L提高幅度最明显，P=0．048，见 表l。 表1流式细胞学数据 (n=3)6±s) ，IsPG(蝉皿) 相对于对照组读数(道数) l-oD00±0．oooo l-2248±O．4528 1．3608±O．2858 1．4013±o-3376 1．2154±0．2439 注：流式细胞仪测得7网PG和脐血造血细胞膜表面EPOR数量 的关系，结果用sPss统计软件进行方差分析，50mg／L组的EPOR表 达数量较对照Omg几组相比有明显增强，P=o．048。 2．2细胞EIjsa分析 酶标仪设定吸光滤镜波长为450nm，E1isa所得 OD值通过以下公式校正，设髑PGO耻皿浓度下 的(OD值一O．032)／细胞数为一个基数l，其他各组 实验数据=(每孔OD值一0．032)／每孔的细胞数，0 mg，L浓度下实验数据值，见表2，实验结果显示 ，I’SPG50～75mg／L作用脐血造血细胞24h后，细胞 膜表面的EPOR表达量较对照组显著增高。 表2 E|isa数据(n：3)在±s) TsPG(mg几) 实验数据(单位：og) L0000±O．OOoo 1．5572±O．9460 14．1731±7．1346 43999±3．4689 2．0038±O．4694 注：1sPG剂量和单个核细胞膜表面EPOR数量的关系，结果用 SPss统计软件进行方差分析，50mg几组0D值较0m学儿组显著增 大，P=o．Ol。 2．3免疫组化染色 2．1 流式细胞仪检测TSPG对脐血造血细胞E— POR表达的影响 应用流式细胞术测定脐血造血细胞的平均荧光强度。以对照组的平均荧光强度(Fo)为基数l，其‘附f：釜墨耄薏筢墨黑嚣篙嚣‘毒器毛表达 ·1019· 帅筋卯硒瑚 呲笱 ∞ 竹 啪 吣笱 ∞ 竹 瑚 万方数据 中国现代医学杂志 第18卷 选来自不同产妇的单个核细胞分组后培养24 h，每张玻片选取3个视野(×1000)计数单个核细 胞数和免疫反应阳性细胞数，细胞核被苏木素染成 蓝色的单个核细胞计为一个，其边缘有黄色沉淀物 的为免疫反应阳性细胞，见表3、附图。结果显示： 1'SPG50m蜀／L组单个核细胞的EPOR表达阳性率 较对照组显著增高(P=O)。 表3TSPG0mg，L和50mg，L诱导的造血细胞EPOR表 达的阳性率(n=9)反±s) 髑PG(m舡) 阳性率 O 50 43．87％±4．09％ 65．31％±6．87％ 注：经sPss软件分析，用F检验，F=64．889，P=o，50mg几组阳 性率较对照组0m∥L显著加大。 ‘ ’L 3讨论 造血干／祖细胞膜上存在着造血生长因子的受 体，它接受相应因子的调节而定向增殖分化，机体的 造血调控主要在此阶段进行。就红系血细胞发生来 说，大量的研究表明，EPO与EPOR结合后，EPOR 形成同源二聚体，激活细胞质中蛋白酪氨酸激酶 JAK2(JanusKinase)，活化后的JAK2诱导EPOR 和其他蛋白酪氨酸残基磷酸化，如Shc，SH一阴Pl (SH2domaincontainingproteintyrosinephos— phatase，含SH2功能区的蛋白酪氨酸磷酸酶)， STAT5(si印al缸ansducerarIdactivatoroftmsc邱一 tion，信号传导和转录激活因子)等，EPORC一末端 酪氨酸残基磷酸化为胞质中含SH2(srcHomolo— g)r)功能区的蛋白质提供SH2泊位，进一步活化其 他信号分子，实现EPOR介导的促进红系祖细胞增 殖和分化的作用田。EPO导致的信号转导经30一60 min下降到基础水平，膜上与EP0结合的EPOR以 每分钟6％的速度内陷经泛素蛋白标记后被分子伴 侣引导至溶酶体和蛋白酶体中降解，还有一部分又 重新循环到细胞膜上来【4】。 EPOR在正常或转化的红系细胞表面含量极 低，表达量大约为1000个／细胞，而99％的EPOR 存在于造血细胞的细胞浆内四。EPOR主要表达于 CFU—E阶段，并随红细胞的成熟而递减，网织和成 熟红细胞表面缺乏EPOR嘲。笔者选择人脐血造血细 胞为研究对象，提取细胞总蛋白进行westemblot， 结果表明：不同剂量的，ISPG作用造血细胞24h后， 并没有明显改变EpoR的表达量阴，分析其原因，实 验观察到的这一现象是在提取细胞总蛋白后进行 West咖blot得出的结果，而起关键作用的细胞膜上 是否存在EPOR“量”和“质”的变化尚不能确定。 NEUMANN等【8】报道红细胞表面EPOR至多为每个 细胞1000个，大部分存在于细胞内。对白血病细胞 株EPOR表达的研究发现，白血病细胞株能表达功 能性的EPOR，但EPOR阳性率不与增殖反应相一 致，提示细胞对EPOR的敏感性是依赖于能将信号 从EPoR转导到细胞核的细胞内转导系统的存在与 否，而不单纯依赖于细胞表面EPOR的阳性率刚0】。 据此，笔者推测出现上述现象可能存在的因素有：① EPOR位置重塑：EPOR总量不变的情况下，位置发 生变化，胞浆中的EPOR转移到胞膜表达。②胞浆中 的EPOR转移到胞膜的同时，功能性EPOR数量增 加。③胞膜上功能性EPOR数量增加或活性增强， EPOR分布、数量不变。因此，要想弄清楚俗PG作用 于造血细胞表面功能性EPOR的分子事件，尚需笔 者更深入地研究。 本实验结果显示，造血细胞与鸭PG共培养24h 后，免疫组化显示造血细胞膜上EPoR表达阳性率 增高，流式细胞仪和细胞Elisa检测均显示在适当的 药物剂量(50mg，L)刺激下造血细胞膜表面的E— POR的表达量有显著增加，结合上述笔者以往的实 验结果，推测1’sPG可促使细胞内的EPOR转移到 细胞膜表面或者抑制细胞膜表面的EPOR内陷入细 胞内。细胞膜表面EPOR受体数量增加导致转导人 细胞内信号的增加，引起后续信号放大，从而提高造 血细胞的增殖分化能力。 因此，本实验从探讨人参总皂苷对造血细胞膜 表面EPOR表达变化的角度，来研究了人参提取物 促进血发生的现代生物学机制，并为其提供了新的 证据。 参考文献： 【l】王建伟，李荣，王亚平，等．人参总皂甙体外诱导c砜+造血干，祖 细胞增殖的作用叨．解剖学报，2006'29(4)：430-432朋9． 【l】WANG．rW，U民WANGYP，et8LThemleoftotalsaponi” 0fp矾ax酉n船ng访、，itr0iIlducedCD≯hematopoieticste册／pm一 鲫i嘧oenprolj白ation叨．Chine靶JmmlalofAmtomy，2006。29 (4)：430-432，449．Chinm 【2】GLUEKMANE， BROXMEYERHA， AUERBACHAD。 et a【． H删atopoieticreo叽stitutionillapatientw油FafIeoni’s卸elllia byⅡ瑚nsofuⅡll'出caI—c0捆b100d矗姗锄HUL-identicalsi挑flg (下转第1023页) ·1020· 万方数据 第8期 伍校琼，等：人静脉移植物eNOs和hN0s的表达 3讨论 在再狭窄的静脉移植物中，常常可观察到中膜 有毛细血管的出现【6J。笔者以前也曾对此作了报 道【7】。在正常大的静脉血管，其外膜上有小的血管， 营养物质可通过这些小血管弥散到中膜以营养中 膜。当静脉移植到动脉通路时，外膜小血管的连接遭 到破坏，中膜因而相对缺氧缺血。一般认为这种状 况是诱导中膜毛细血管生成的原因。大量研究表明 组织缺血、缺氧刺激eNOS的表达，提高和促进 eNOS的表达能使缺血组织毛细血管增多【81。笔者在 本实验中观察到中膜新生的毛细血管表达较高的 eNOS，同时具有生物活性。这些结果提示eNOS可 能在静脉移植物中膜毛细血管的生成过程中起了重 要作用。 笔者也观察到了在静脉移植物发展过程中 eNOS在管腔内皮细胞的表达变化，eNOS的表达模 式和新内膜的形成有一定的关系，内膜厚度增加的 部位，eNOS的表达呈低水平，由于NO能抑制平滑 肌细胞的增殖和移动，因此笔者推测eNOS表达的 下降可能参与了新内膜的形成。eNOs表达的变化 可能受血流切应力变化的调节。当静脉连接到高血 流的动脉通路上时，增强的血流切应力诱导静脉内 皮细胞表达高水平的eNOS，而长时问持续的血流 切应力又会使内皮细胞受损，因而内皮细胞功能受 到损害导致eNOs的表达下降。 本实验笔者揭示了eNOS在静脉移植物的表达 模式，提示eNOS在中膜毛细血管的生成和新内膜 形成过程中扮演了重要角色。 参考文献： 【1】PAIMERRM．FER砒GEAG，MONCADAS．Nitric埘【ideIel曲辨 acc蚴tsf矗tl】ebiologicalactivity0fendotIleli哪．‘1耐ved地k ingkt0栅．Natm，1987，327(6122)：524．526． 【2】MYERSPRMINORItL’JR，GUERRARetaLVasorela期nt propenies0ftlleendollleli岫矗商wdrebxingfact盯mo弛dl∞ely resembIes．血r0雠ystemth∞Ilitric商de田．NatlIle，19蛾345 06271)：16l—163． ‘- 【3】SCHMl明HH，wAmRU．Ⅳ0atwork饥．CdL1994'78(6)： 919—925． 【4】ZICHEM。MORBIDEULIL’MASINIE，eta1．Nitric∞jdeme— di砒鹤锄百ogen∞isin“v0and饥doth止alceU伊州h蛐dnli铲a— ti∞iIlvitr0印motedbysubstaIl∞P叨．JClinhvest。1994。94 (5)：2036—2044． 【5】PAPAPETRoPoULOSA’DESAIKM，RUDICRD，eta1．N嫡c o】【ide8)，llth雠inhibito埔attl：nuatetraIIsfbnlling-grow山．fbcto卜beta 1一stillluhtedcapilLaryorgaIli勰tioninvitro叨．AmJPath吐1997， 150(5)：1835—1844． 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