肾性贫血的治疗新进展-红细胞生成素受体促进剂

2004年第2卷第3期 肾性贫血的治疗新进展 一红细胞生成素 受体促进剂 杜晓霞 综述 李学旺 审校 摘 要 促红细胞生成素是治疗肾性贫血的有效药物，其缺点为不能口服，长期使用可能产生纯 红细胞再生障碍性贫血。两类小分子的EPO受体促进剂，包括 EPO模拟肽和 EPO非肽类模拟物，可能 将解决以上问题，目前正处于实验室研究阶段。本文简要介绍这两种EPO受体促进剂的分子结构和作 用机制。 关键词 贫血 肾性／再生障碍性 受体红细胞生成素 模拟肽 肾性贫血是慢性肾功能衰竭(chronic renaJ failure， CRF)的重要并发症之一，可由多种因素造成，有学者 认为，肾脏病患者肾小球滤过率(GFR)低于 30ml／min 时，必然出现贫血 ⋯，如不加以治疗，可导致机体缺 氧、心血管疾病、认知异常、月经周期改变、性功能障碍 等一系列并发症的出现，还可导致儿童患者生长发育 延迟。一般认为CRF患者贫血的主要原因是肾脏产生 促红细胞生成素(eLythmpoietin，EPO)不足，另外，铁和 叶酸的缺乏、失血、铝中毒、红细胞寿命缩短、严重的甲 状旁腺功能亢进、甲状腺功能，氐下、急慢性炎症、血红 蛋白病等因素均与肾性贫血有关。多年的临床应用已 证实，EPO能有效纠正患者的贫血及相关症状，提高患 者的生活质量。然而少数患者出现了与抗 EPO中和抗 体相关的纯红细胞再生障碍性贫血 pure red cell apla— sia，PRCA)，在某种程度上限制了EPO在临床上的进 一 步应用。科学家们试图研制一种新型药物，能充分保 持 EPO的完整生物学活性，而分子结构与EPO无同源 性，以避免抗 EPO抗体产生；同时可口服给药，达到高 效、安全、临床适应症更广的目的，更好的治疗肾性贫 血患者，提高患者的依从性和生活质量。其中部分学者 对 EPO的模拟肽类及非肽炎小分子进行了深人研究， 发现此类分子可洚为 EPO受 的促进剂，能有效的治 疗 EPO缺乏相关性贫血，现综述如下： 1 EPO的发现及应用 EPO早在 1906年就被科学家们发现，是一种唾 液酸性的糖蛋白激素，由 165个氮基酸残基组成，相对 分子量为34．4kD，其中 60％是蛋白质 (单个多肽链)， 院 作者单位 1．00730中国医学科学院 中国协和医科大学北京协和医 40％为糖类，含有 3个 N端糖基链和 1个 。端糖基化 链。EPO可通过促进红细胞增殖及分化来调节红细胞 生成。 成人 85％的内源性 EPO由肾脏合成。肝细胞、骨 髓中的巨噬细胞及中枢神经系统的星形胶质细胞也有 EPO的合成，此外，肝脏肿瘤、脑血管瘤、子宫肌瘤、卵 巢囊肿也有合成 】。 1985年人类利用基因工程技术，在中国仓鼠的卵 巢细胞中合成了重组人促红细胞生成素 (rHuEPO)I3 J， 其相对分子质量为 30．4kD，理化性质和生物学活性与 天然内源性 EPO相同。1988年 rHuEPO最早在法国投 入使用，用于治疗慢性肾功能衰竭的血液透析患者； 1989年获得美国FDA的批准文号，正式进人美国市 场，此后陆续应用到日本及其它亚洲国家。lO余年的 临床实践证明，rHuEPO治疗 肾性贫血，效果确切；除肾 性贫血外，还可用于慢性感染、失血及肿瘤患者放、化 疗唇贫血以及外科手术前红细胞生成的激活。 2 促红细胞生成素受体(EPOR) 促红细胞生成素受体 (EPOR)最先是 1986年 Sav,wer等H 从 Friend病毒贫血株 (FvA)细胞上鉴定出 来的，cDNA序列明EPOR是一种单链结构的跨 膜蛋白质，由508个氨基酸残基组成，分子量为 66kD， 属于细胞困子受体超家族的一个成员，其细胞外部分 保留着4个半胱氨酸和一个色氨酸一丝氨酸一任意 氨基酸一色氨酸一丝氨酸(WSXWS)的保守结构，可 表达于红系祖细胞、巨核细胞及多种神经细胞表面。 EPO通过与细胞表面的 EPOR结合而发挥生理 作用。在 EPO刺激下，EPOR迅速发生同源二聚化，形 成同源二聚体。二聚体的形成可导致受体的激活，是促 维普资讯 http://www.cqvip.com 2 国外医学移植与血液净化分册 发 EPO生理效应的必需条件。此后 EPOR连接胞浆蛋 白酪氨酸激酶Jak2，使酪氨酸磷酸化，通过第二信使信 号传导途径，促进靶细胞增殖分化，调控红细胞生成 【5】 。 如果有一种小分子，可以通过某种机制与EPOR 相结合，导致 EPOR同源二聚体化，就可能发挥与EPO 相类似的生物学活性；这种与 EPOR相结合的小分子 可以称为 EPOR的促进剂。针对 EPO模拟肽类及非肽 类小分子的研究正是以此为基础发展起来的。 3 EPO与纯红细胞再生障碍性贫血 rHuEPO应用于临床以来 ，肾性贫血的治疗取得 了突破性的进展。截止至 2001年，全球已有350万人 使用 rHuEPO，疗效显著。rHuEPO可通过静脉注射或皮 下注射给药，长期使用的并发症主要有高血压、血栓栓 塞、癫痫发作、注射点疼痛等。 纯红细胞再生障碍性贫血 (PRCA)是rHuEPO治 疗过程中的一个少见而严重的并发症，近年来逐渐为 人们认识。1998年以前，全世界仅报道 3例，分别来自 德国、西班牙和美国 。1998年后，达到近 200例。临 床表现为长期接受 rHuEPO治疗的慢性肾功能衰竭患 者，起初对 rHuEPO反应良好，随后出现严重的难以解 释的贫血：贫血为正细胞正色素性，网织红细胞数目减 低，白细胞和血小板数目不少。 rHuEPO导致 PRCA的病因目前尚不清楚，一般 认为与抗 EPO中和抗体 (neutralizing anti—erythropoi． etin antibody)的产生有关。近年来的文献报道，rHuEPO 继发性PRCA的患者体内可检测到高浓度的中和抗 体，可结合大量的EPO分子，抑制红细胞生成。rHuEPO 治疗中止后抗体滴度可逐渐下降 。Casadevall[¨ 于 2002年报道 21例慢性肾衰患者 ，接受皮下注射 rHuEPO治疗 3～64月后，出现PRCA。取患者的血清 与正常的骨髓细胞共培育，结果红细胞生成受到明显 抑制。所有患者血清中均检测到高滴度的抗 EPO中和 抗体。作者猜测中和抗体的产生可能与EPO的给药方 式有一定关系，认为皮下给药 的患者更容易出现 PRCA。 近来有研究认为以rHuEPO治疗的肾性贫血患 者，67％存在抗 EPO抗体，但出现PRCA的仅是极少 数。作者认为这些患者体内的抗 EPO抗体可能并非中 和抗体，或者与 EPO的亲和力很低 引¨，不足以导致 PRCA。 ScheUekens¨ 认为抗 EPO中和抗体的产生是自 身耐受机制遭到破坏的结果，并推测近年来 PRCA病 例明显增多的原因在于 rHuEPO的制作工艺发生改 变，EPO分子结构出现微小变化所致。 4 EPO受体促进剂 EPOR与 EPO结合后发生的同源二聚化，是目前 比较公认的EPO受体的活化模式。从理论上讲，能与 EPO特定位点特异性结合的抗体、短肽或非肽类小分 子等均可能引发受体的活化过程，从而触发 EPO相关 的生物学效应，达到治疗肾性贫血的效果。近年来以 EPO的模拟肽类及非肽类小分子作为EPOR促进剂的 研究，提供了口服药物治疗贫血的可能，成为肾性贫血 治疗中的一个新的亮点。在此类研究中，未发现有抗 EPO中和抗体的产生。 4．1 EPO模拟肽 1996年 Wrigl1ton等 ¨利用噬菌体随机肽库筛选 技术，得到了一种可与 EPOR特异性结合的环八肽， 并进而发现一组具有共同序列，而与 EPO分子无结构 同源性的环肽。它们能与 EPO分子竞争性结合 EPOR， 行使类似EPO的作用 (如诱发受体形成二聚体、传导 信号、触发生长和分化以及体内刺激网织红细胞的生 成)，从而奠定了小分子 “EPO模拟肽 (EPO mimetic peptide．EMP)”研究的基础。 同年 Livnah等[151合成了一种能有效的使 EPOR发 生同源二聚体化的环二十肽，命名为“EMP1”。EMP1是 一 种典型的EPO模拟肽，在体外和动物实验中均表现 出与 EPO类似的生物学特性。体内实验初步结果显 示：给正常小鼠皮下注射 EMP1，经流式细胞仪检测其 外周血网织红细胞增长 6％；另一种方法以低气压抑 制内源性 EPO产生，制造出低氧、红细胞增多症小鼠 模型，EMP1对其红细胞的生成也有明显促进效应。x 线晶体衍射分析显示，EMP1与EPOR形成的复合物是 一 种 T形对称结构，由两条多肽链和两个受体分子以 2：2比率结合而成。 尽管 EMP1是 EPOR的有效促进剂，在动物体内 的活力仍远低于 EPO[16i。研究表明，通过修饰肽链末 端可进一步提高短肽的生物学效应。实验表明，经聚乙 二醇(PEG)修饰后，EMP1与EPOR的亲和力明显提 高，刺激细胞增殖的能力也得到显著增强 ；Kuai L【】。】 等人发现 PAJ一1(Plasminogen activator inhibitor一1， PAI一1)可增强EMP的受体促进剂活性，他们将EMP 的编码序列插入PAI一1基因中，产生新的PAl一1／ 维普资讯 http://www.cqvip.com 2004年第 2卷第 3期 3 EMP(PMP)基因，然后用网织红细胞计数的方法评定 PMP活性，结果发现 PMP类的EPO活性较 EMP增长 了2500倍。 除EMP1外，科学家们又陆续发现了一系列可作 为EPOR促进剂的EPO模拟肽。Johnson等合成了一种 具有 EPO模拟活性的短肽，仅含 13个氨基酸，为发现 更小片段的EMP肽段提供了前景 19]。McConneH等 。’ 描述了一种 18氨基酸的环状模拟肽，称作 ERB1—7， 它与EBP的结合没有结构特异性，却具有完全的E- POR促进剂活性。Naranda等 1通过同源搜索的方法 确定了一种特殊的EPO模拟肽，称为 ERP，ERP可充 当受体二聚体的其中一个单体，与另一EPOR非竞争 性结合而转为受体活化状态，从而启动胞内信号转导 途径。 4．2 非肽类小分子模拟物 表1主要EPO模拟肽的组成 EPO模拟肽的研究已经取得了一定进展，但仍停 留于实验室阶段，未能发现一种真正具有与天然EPO 具有同样效力的肽类分子。另外，现有的EMP肽类分 子，分子量均在 1．5kD以上，在体内代谢快，口服生物 利用度较低，这必然限制了其作为临床治疗药的开发 前景。近年来在其研究的基础上，非肽类小分子模拟物 研究正逐渐形成新的热点。 与EMP分子相比，非肽类模拟物分子量更小，更 适合肠道吸收，生物利用度也高于 EMP，因而具有很 好的临床应用前景。Qureshi等 通过将受体拮抗剂转 变为促进剂的方法，获得 EPO的非肽类小分子模拟物 “化合物 5”。他们首先筛选出的 EPOR拮抗剂“化合物 1” ，可竞争性抑制 EPO与受体结合，IC 。为 59．5~mol／ L；而“化合物5”是由8个“化合物 1”分子围绕同一核 心组成的八聚体结构，经过修饰的八聚体 “化合物5” 与 EPO受体亲和力大为提高，转变为 EPOR的促进 剂，ICso为4~mol／L，在细胞增殖实验中可活化 EPOR， EC∞为5~ ol／L。“化合物 5”表现出很多类似于EPO 的生物学活性：如诱导受体形成二聚体；刺激具有 E． POR的细胞系增殖；激活具有 EPOR的BAF3细胞的 STAT依赖的报告基因等。但尽管如此，其最高活力仍 仅为 EPO的30％，不具备完全的 EPOR促进剂活性， 属于 EPOR的弱激动剂。化合物 5的分子量约 6．4kD， 不可能通过口服吸收，但它给非肽类小分子作为 EPO 模拟物提供了可能，为肾性贫血的口服药物治疗带来 新的曙光。 参考文献 1 Nissens0n AR．Am J~dney Dis，1998，32(Suppl 4)：S131—2 2 Nissenson AR．B10od 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亡在其中的作用受到人们的广泛重视，研究表明抑制 细胞凋亡可以减轻肾脏I／R损伤，保护‘肾功能。 1 细胞凋亡概述 细胞凋亡 (apoptosis)的概念是 Kerr等在 1972年 提出的，亦称程序性细胞死亡 (programmed cell death， PCD)，是由体内外因素触发细胞内预存的死亡程序而 导致的细胞死亡过程。其特征为细胞死亡但却维持细 胞膜结构的完整。细胞凋亡在个体发育过程中起着重 作者单位：100853北京，中国人民解放军总医院肾科 解放军肾病 中心暨重点实验室 要的作用，但是不适当的凋亡可导致许多疾病。 1．1细胞凋亡的形态学变化 凋亡的形态学改变主要有核固缩、核碎裂，细胞皱 缩、胞质凝聚，“凋亡小体”形成，磷脂酰丝氨酸外翻 等。凋亡小体上的磷脂酰丝氨酸作为信号，可使之被邻 近的健康细胞吞噬和清除。近来有研究表明，表达于白 细胞和巨噬细胞表面的粘附受体 CD31(血小板 一内皮 细胞粘附分子 1)在吞噬过程中起重要作用n 。 1．2细胞凋亡的分子生物学改变 DNA琼脂糖凝胶电泳是用于检测细胞凋亡的最 普遍的分子生物学方法。通常认为 DNA在核小体之间 断裂 (DNA梯状条带)是凋亡的特征性改变。凋亡时 DNA双链的降解是由内源性Ca ／Mg： 依赖的核酸内 切酶完成的，该酶特异性地在核小体之间裂解 DNA， 使之成为约180～200bp整数倍的寡核苷酸片段。DNA 片断化标志着细胞死亡已不可逆转，因为此时细胞生 存所需的蛋白已不能合成。尽管近年来相继发现了凋 亡过程中的几种核酸内切酶，但这些酶在凋亡过程中 是否必不可少目前仍不清楚。新近发现的两种凋亡内 切 酶 【caspase激 活 的 DNA酶 (caspase—activated DNAse，CAD)和核酸内切酶 G(end0nucJeaLse G，Endo 维普资讯 http://www.cqvip.com