在骨髓增生异常综合征中的表达及意义

均能明显减轻肾小球硬化和间质纤维化。Mizuno和NakamuraEls]7 观察链脲佐菌素所致糖尿病肾病模型。观察到HGF作用于靶 细胞系膜细胞，HGF抑制TGF—B。产生，减轻蛋白尿，改善肾 小球硬化和肾小管间质纤维化。HGF治疗可抑制糖尿病小鼠 肾功能不全。 6 总之，DN早期血HGF、肾局部HGF水平增高，后期降 低。HGF在DN发病中发挥重要作用。结合国内外有关研究 ． 分析认为早期HGF增高是一种保护机制，但同时参与启动肾 脏肥大。后期肾局部HGF水平降低可能是糖尿病肾病进展 ．。 的危险因素。检测血清HGF对糖尿病早期诊断、病程估计和 预后有一定意义。外源性HGF可能是糖尿病肾病的有效治 疗手段之一，具有广阔的前景。 11 参考文献 1 郭啸华。刘志红。李恒。等．高糖高脂饮食诱导的2型糖尿病大 鼠模型及其肾病特点．中国糖尿病杂志．2002，10(4)：290-294．12 2 MizunoS，MatsumotoK，NakamuraT．Hepatocytegrowthfactor suppreaaesinterstitialfibrosisinamonFJcmodelofobstructive nephropathy．Kidneyhat，2001，59：1304-1314． 13 3 MatsumctoK，NakamuraT．Hepatoeytegrowthfactor：．renotropic andpotentialtherapeuticsforrenaldisease．KidneyInt，2001，59： 2023—2038． 4 MillerSB，MartinDR，KissaneJ．cta1．Hepatocytegrowthfactor 14 acceleratesrecoveryfromacuteiachemicrenalinjuryinrats．Am JPhysiol，1994，266：129—134． 5 LiuY．HepatocytegTowthfactorandthekidney．CurtOpin 15 NephrolHypertens，2002，11(1)：23-30． 6 LiuY，TolbertEM，SunAM，eta1．Invivoand讯vitroevidence 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学和骨髓活检(部分病例)等检查确诊，其中男性18例，女性 12例，年龄39～8l岁，中位年龄56岁。对照组20例，包括特 发性血小板减少性紫癜lO例(血红蛋白均在正常范围)，自 细胞减少lO例．其中男性13例，女性7例，年龄28—70岁， 万方数据 · 130· 中位年龄50岁。 1．2 主要仪器和试剂 PCR仪(PE公司9700型，USA)，UVP凝胶成像仪(UVP 公司，USA)，紫外分光光度计(C,eneCompanyLimited公司。 USA)，DYY一Ⅲ型水平电泳槽(北京六一仪器厂)．稳压稳流电 泳仪(SavantPS250，USA)。Trizol(TaKaRa公司)；反转录酶和 TaqDNA聚合酶(Fermentas公司)；随机引物：OligodT(10) (Promega公司)；EPOR和13-actin的引物由北京奥科生物技 术有限责任公司合成。 EPOR：上游引物：5’—TcEATG从GGCTCGAAAGCA7r_3’． 下游引物：5'-GGCTGGGATAAGGCTGTYCTC一37．产物长度 299bp。 B—actin：上游弓I物：5’一GGAAATCGTGCGTGACATl、AAG一 3’。下游引物：5’-TGATGGAGTI'GAAGGTAGITrC一3’。产物长 度230bp。 1．3 RT-PCR方法检测 1．3．1总RNA提取：利用Trizolreagent提取MDS患者骨髓 细胞中总RNA。所提取RNA经紫外分光光度仪测定其260 nm和280nm处的吸光度(A)值，选取A洲。比值为1．8— 2．0者，以A坳计算出浓度。用于反转录反应。 1．3．2反转录反应：参照Fermentas公司生产的反转录试剂 盒进行操作。总反应体积为20斗l，反应体系为RNAl雌， randomprimer0．4trg，加DEPC水至ll山，70℃5min，5x buffer4一，10mmol／LdNTP2V,I，RNasin20U，25℃5rain， 200U，斗IM-MLV200U，25℃10min，42oC60rain，70℃10 rain，反应产物于一20℃冰箱冻存，作PCR扩增用。 l-3．3PCR实验：反应体系为25斗l，具体为eDNAl V,I，10x buffer2。5m，25mmol／LM薛121．5砖，10mmol／LdNTP2．5 V,I，TaqDNA聚合酶1．5U，20斗mol／L上游引物与下游引物各 l斗l，不足用去离子水补足25斗l。反应条件为95℃2rain， 95℃30s，60℃30s。72℃50s，共32个循环，72℃总延伸lO rain。为了排除PCR过程中可能出现的假阳性．每次扩增均设 立阴性对照(以去离子水代替目的eDNA)。 1．3．4PCR产物进行电泳鉴定，半定量分析：取PCR产物8 吵l与2斗l上样缓冲液混合，在2％琼脂糖凝胶中电泳，UVP 凝胶成像仪拍摄电泳图片观察结果。检测EPORmRNA扩增 带与B一肌动蛋白扩增带灰度值，以EPORmRNA与p一肌动 蛋白灰度值的比值作为EPORmRNA的相对表达量。 1．4统计学分析 试验结果均以；挡表示。MDS患者组与对照组间EPOR mRNA相对表达量的比较用两样本均数比较的t检验．使用 SPSSI1．0软件进行统计处理，P<0．05表示差异有统计学意 义。 2结 果 2．1 EPOR扩增产物琼脂糖凝胶电泳结果：EPOR经RT—PCR 扩增。扩增产物在琼脂糖凝胶均显示清晰的单一条带。内参 照为13-actin(见图1o 2．2 EPOR在MDS患者组及对照组的表达：30例MDS患者 和20例对照均表达EPORmRNA．MDS患者的EPORmRNA 相对表达量(0．42壬-0．10)明显低于对照组(O．48i-0．11)，两组比 较差异有统计学意义(t=2．221。P=O．03)。 M：DNAmarker；I一3：病例组；4-7：对照组：8：阴性对照 图l MDS患者EPORmRNA琼脂糖凝胶电泳图 3讨 论 MDS属于造血干细胞克隆异常性疾病．病变累及多能干 细胞，由此形成的异常克隆细胞。不能分化成熟，在骨髓形成 病态造血导致血细胞无效形成。MDS的糕床特征之一是贫血， 其产生的机制比较复杂。可能的原因包括骨髓中红系细胞的 减少、炎症因子水平升高对红系的抑制、肾脏合成EPO减少、 红细胞寿命缩短、铁利用障碍等都可能导致贫血的发生[2】。 EPOR与生长激素、集落刺激因子及一些白细胞介素的受体 同属造血生长因子受体超家族．主要表达于红系祖细胞川。成 熟红细胞表面EPOR的量非常少。并随着细胞成熟而逐渐减 少【“。EPOR有两种结构形式：截断性EPOR(truncated，E— POR-T)和全长性EPOR(full—length，EPOR—F)。EPOR—T在 不成熟的红细胞祖细胞上表达丰富。它是增殖和抗凋亡中 EPO信号的负性调节因子。EPOR-T的过度表达可形成低水 平的EPOR—T厄POR—F异源二聚体和高水平的EPOR—T同源 二聚体。从而抑制了EPO信号的传导。EPO与EPOR结合后 激活细胞内的信号通路维持红系造血．其胞内信号传导不是 单一的级联通路。而是多个通路交联互补，形成网络的传导过 程j虽然EPO最基本的作用是调节红细胞生成，但近年来的 大量研究表踢，EPO／EPOR在一些非造血组织和细胞，如血管 内皮细胞、神经细胞、B淋巴细胞、实体瘤、肝脏和子宫组织中 亦有表达川．其可能通过诱导细胞增殖和血管发生等机制加 速肿瘤发展。因此。对非造血组织中EPO和EPOR的研究对 确定重组人红细胞生成素的潜在治疗的有效性和它在体内的 信号传导作用是非常必要的。 Takeshita等[51报道60％的急性髓细胞自血病(AML)和 29％的急性淋巴细胞白血病(ALL)表达EPOR，且ALL的E— POR表达明显低于AML，既有EPOR表达又对EPOR有体外 增殖反应的患者比没有EPOR表达的患者缩短了完全缓解的 时间。国内有学者[6)应用特异性单克隆抗体，通过流式细胞仪 检测30例急性白血病(AL)患者白血病细胞EPOR的表达， 结果显示：所有白血病上均有EPOR表达，且表达水平较低。 与文献[7，8]的研究结果一致。EPO／EPOR介导的抗凋亡信号 在红系造血中发挥了最重要的作用。有资料显示EPOR—T在 EPO诱导的抗凋亡和红系分化作用中起着负调控作用．如 Shimizu等睁】用RT-PCR方法检测9例MDS患者的骨髓细胞． 其中共有7例表达EPOR—T的mRNA，在正常志愿者中无表 万方数据 中国药物与临床2008年2月第8卷第2期ChineseRemedi∞＆Clinics，February2008，V01．8，No．2 达；同时，体外实验发现同源性EPOR—T不能将EPO信号有 效传导至细胞核而对EPO的抗凋亡作用起负调控作用，由此 推测MDS的发病机制之一可能是EPOR-T和EPOR—F之间 的转换机制存在缺陷，使EPOR-T占优势。促进了MDS的红 系细胞凋亡。因此，MDS的无效造血被认为是由于细胞过度 凋亡所致。 本研究应用RT-I圯R方法检测了30例MDS患者均有 EPOR表达．但表达量低于对照组，本结果显示EPOR不仅表 达于红系祖细胞，而且是一种分布极为广泛的细胞因子受体， 其可能是导致MDS无效造血的原因之一。从而参与MDS的 发生、发展。已知EPO与红系祖细胞表面EPOR结合后。主要 通过JAK／STAT和RAS／MAPK激酶等信号传导途径来抑制红 系祖细胞凋亡．诱导其增殖、分化和血红蛋白合成[埘。其中 MAPK即丝裂酶原活化蛋白激酶途径包括Kas，Raf，MEKl以 及细胞外信号调节激酶1与2(ERKI，ERK2)，这一信号途 径是极其重要的生长调节通路。而EPOR在MDS中介导的信 号传导及相应的功能不同于正常红系造血祖细胞，MDS患者 MAPK途径处于异常活化状态中，导致贫血的发生。EPOR表 达水平降低可能是MDS红系凋亡过度和贫血的普遍机制。近 期有研究表明。在类风湿关节炎所致的慢性病性贫血(ACD) 中，肿瘤坏死因子(TNF吨)介导了骨髓红系的过度凋亡，抗 TNF吨抗体可拮抗其作用itll。MDS的红系凋亡是否涉及这一 机制还不清楚。此外，EPO／EPOR下游信号通路：包括EPOR 胞内结构及活化是否异常都值得迸一步研究。过去纠正MDS 相关贫血的主要措施是输血。输血见效快，但由于血源紧张。 且输血传播其他疾病的危险性较大并会引起许多不良反应． 现今临床上主要应用重组人红细胞生成素(rhEPO)治疗MDS 导致的贫血，疗效确切[12】。其主要通过非输血治疗形式促进骨 髓造血状况的改善，并可改善由化疗抑制骨髓引起的贫血．使 患者血红蛋白逐渐稳定地升高．从而纠正贫血。 参考文献 1 FarrellF．1eeA．Theerythropoietinreceptoranditsexpressionin tumorcellsandothertissues．Oncologist，2004，9(5)：18-30． 2 LudwigH，FritzE．Anemiaincgncerpatients．SeminOncol， 1998，25(17)：2-6． 3 Fontenay—RonpieM，BotmearyD。GuesnuM，eta1． Ineffective ·131· 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作者单位：030001太原，山西医科大学第二医院肾内科(姚舒营、 李荣山)，病理科(张小琴、卫建平) 可通过细胞凋亡的形式被清除⋯。肾小球内系膜细胞和浸润 的自细胞参与吞噬清除凋亡细胞的过程[2】。因此在肾小球增 殖性病变的形成和消散过程中．细胞凋亡在其中起着非常重 要的作用。本研究对不同类型IsA肾病肾小球内细胞增殖和 凋亡状态进行了观察和分析，探讨其与IrA肾病预后的相关 万方数据