耐受性树突状细胞体外培养的基本特征

中国组织研究与临床康复 第 13 卷 第 31 期 2009–07–30 出版 Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research July 30, 2009 Vol.13, No.31 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 6075 1Gannan Medical College, Ganzhou 341000, Jiangxi Province, China; 2Department of Blood, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China; 3Jiangxi Institute of Medical Science, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China; 4Department of Tumor, the First Affiliated Hospital of Gannan Medical College, Ganzhou 341000, Jiangxi Province, China Zhong Zhi-hong★, Master, Plysician, Gannan Medical College, Ganzhou 341000, Jiangxi Province, China 2004zhongzhihong @163.com Correspondence to: Chen Guo-an, Professor, Chief physician, Department of Blood, the First Affiliated Hospital of Nanchang University, Nanchang 330006, Jiangxi Province, China gachen0791@ 126.com Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No.30260039*; the Natural Science Foundation of Jiangxi Province, No. 2007GZY2599* Received: 2008-09-11 Accepted: 2009-04-13 (54200809110030/ WL•H) 耐受性树突状细胞体外培养的基本特征**★ 钟志宏1，陈国安2，袁利亚3，鄢 俊4，戎吉平3，俞 火3 Basic characteristics of tolerogenic dendritic cells cultured in vitro Zhong Zhi-hong1, Chen Guo-an2, Yuan Li-ya3, Yan Jun4, Rong Ji-ping3, Yu Huo3 Abstract BACKGROUND: Dentritic cells are the most important antigen presenting cells in vivo and play a double role of immune response and immune tolerance; in addition, the cells are significance for maintaining immune balance. OBJECTIVE: To study the culture method of tolerogenic dendritic cells in vitro, and observe the basic characters. DESIGN, TIME AND SETTING: A randomized grouping study based on cytology level was performed at the Central Laboratory of the First Affiliated Hospital of Nanchang University from September 2006 to February 2008. MATERIALS: Male Balb/c mice aging 8 weeks and weighing 20-25 g were used for separate and establish mononuclear cells of bone marrow. METHODS: Mononuclear cells derived from bone marrow were randomly assigned into 5 groups: blank control group (without any factors), dendritic cells group [granulocyte-macrophage colony stimulating factor (GM-CSF) + interleukin-4 (IL-4)], vasoactive intestinal peptide (VIP) group (GM-CSF + VIP), dexamethasone (DXM) group (GM-CSF + DXM), and VIP + DXM group (GM-CSF + VIP + DXM). MAIN OUTCOME MEASURES: Cell morphology was observed under optic microscope; CD80, CD86, CD40, and CD11c expressions were detected using flow cytometry; the capability to stimulate the proliferation of lymphocytes by dendritic cells was examined with MTT assay; IL-10 and IL-12 levels in dendritic cell supernatant were measured with enzyme linked immunosorbent assay (ELISA). RESULTS: ① The dendritic cells which could generate typical dendritic processes were cultured with GM-CSF, IL-4, VIP, DXM, and lipopolysaccharide in vivo. ② CD11c expression in the dendritic cells, VIP, DXM, and VIP + DXM groups was significantly higher than blank control group (P < 0.05). CD40, CD80, and CD86 expressions, proliferative activity of lymphocytes, and IL-12 level in the VIP, DXM, and VIP + DXM groups were significantly lower than dendritic cells group (P < 0.05). Density of 40 µg/L in the VIP group and density of 10 µg/L in the DXM group were decreased remarkably; in particular, VIP at the density of 40 µg/L and DXM at the density of 10 µg/L in the VIP + DXM group was the lowest (P < 0.05). ③ IL-10 level in the VIP, DXM, and VIP + DXM groups was significantly higher than dendritic cells group (P < 0.05); the increase was remarkable at the density of 40 µg/L in the VIP group and at the density of 10 µg/L in the DXM group; in particular, VIP at the density of 40 µg/L and DXM at the density of 10 µg/L in the VIP + DXM group was the highest (P < 0.05). CONCLUSION: ① Tolerogenic dendritic cells were generated from bone marrow precursors cultured with GM-CSF, VIP/DXM, and lipopolysaccharide. ② Compared to the common culture method, the tolerogenic dendritic cells were characterized by low expression of CD40, CD80, and CD86, and weak proliferation of lymphocytes, as well as low IL-10 but high IL-12 levels. ③ GM-CSF, VIP + DXM, and lipopolysaccharide are ideal factors to culture tolerogenic dendritic cells; in particular, 40 µg/L VIP and 10 µg/L DXM are the greatest. Zhong ZH, Chen GA, Yuan LY, Yan J, Rong JP, Yu H.Basic characteristics of tolerogenic dendritic cells cultured in vitro. Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu. 2009;13(31): 6075-6079. [http://www.crter.cn http://en.zglckf.com] 摘要 背景：树突状细胞是体内最重要的抗原提呈细胞，在免疫调节中扮演着免疫应答和免疫耐受的双重角色，对维持机体的免 疫平衡起重要作用。 目的：探讨耐受性树突状细胞的体外培养，观察不同培养条件下耐受性树突状细胞的基本特征。 设计、时间及地点：以细胞为观察对象，随机分组设计，于 2006-09/2008-02 在南昌大学第一附属医院中心实验室完成。 ：8 周龄的 Balb/c 纯系雄性小鼠，体质量 20~25 g，用于分离和制备骨髓单个核细胞。 方法：将小鼠骨髓单个核细胞分为 5 组在不同的培养体系中进行体外诱导培养：空白对照组(不加任何因子)、树突状细胞组 (粒-巨噬细胞集落刺激因子+白细胞介素 4)、血管活性肠肽组(粒-巨噬细胞集落刺激因子+血管活性肠肽)、地塞米松组(粒- 巨噬细胞集落刺激因子+地塞米松)、血管活性肠肽+地塞米松组(粒-巨噬细胞集落刺激因子+血管活性肠肽+地塞米松)。 主要观察指标：光镜下动态观察细胞形态，流式细胞仪检测细胞 CD80、CD86、CD40、CD11c 达，四甲基偶氮唑盐法 检测树突状细胞刺激淋巴细胞增殖的活性，特异性夹心酶联免疫分析测定树突状细胞上清液中白细胞介素 10、白细胞介素 12 的水平。 结果：①利用粒-巨噬细胞集落刺激因子、白细胞介素 4、血管活性肠肽、地塞米松、脂多糖等因子体外培养能生成具有典 型树枝状突起的树突状细胞。②树突状细胞组、血管活性肠肽组、地塞米松组、血管活性肠肽+地塞米松组 CD11c 的表达 高于空白对照组(P < 0.05)。血管活性肠肽组、地塞米松组、血管活性肠肽+地塞米松组 CD40、CD80 和 CD86 表达，淋巴 细胞增殖活性及培养上清液白细胞介素 12 水平均低于树突状细胞组(P < 0.05)，血管活性肠肽组以质量浓度为 40 μg/L、地 塞米松组以 10 μg/L 减低明显，其中血管活性肠肽+地塞米松组在血管活性肠肽质量浓度为 40 μg/L、地塞米松为 10 μg/L 条件下为最低，差异具有显著性意义(P < 0.05)。③血管活性肠肽组、地塞米松组、血管活性肠肽+地塞米松组细胞培养上 清液中白细胞介素 10 水平均高于树突状细胞组(P < 0.05)，血管活性肠肽组以质量浓度为 40 μg/L，地塞米松组以 10 μg/L 基础医学 钟志宏，等. 耐受性树突状细胞体外培养的基本特征 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 cn.zglckf.com 6076 www.CRTER.org 1 赣南医学院教务 处，江西省赣州市 341000；2南昌大 学第一附属医院 血液科，江西省南 昌市 330006； 3 江西省医学科学 研究所，江西省南 昌市 330006； 4 赣南医学院第一 附属医院肿瘤科， 江 西 省 赣 州 市 341000 钟志宏★，女， 1982 年生，江西 省南昌市人，汉 族，2007 年南昌 大学医学院毕业， 硕士，医师，主要 从事细胞移植的 基础及临床应用 的研究。 2004zhongzhiho ng@163.com 通讯作者：陈国 安，教授，主任医 师，南昌大学第一 附属医院血液科， 江 西 省 南 昌 市 330006 gachen0791@ 126.com 国家自然科学基 金 资 助 项 目 (30260039) *；江 西省自然科学基 金 资 助 项 目 (2007GZY2599)* 中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:1673-8225 (2009)31-06075-05 收稿日期：2008-09-11 修回日期：2009-04-13 (54200809110030/ WL•H) 升高明显，其中血管活性肠肽+地塞米松组在血管活性肠肽质量浓度为 40 μg/L、地塞米松为 10 μg/L 条件下为最高，差异具 有显著性意义(P < 0.05)。 结论：①小鼠骨髓单个核细胞体外经粒-巨噬细胞集落刺激因子、血管活性肠肽或/和地塞米松、脂多糖联合诱导培养生成致 耐受性树突状细胞。②与常规诱导培养树突状细胞方法比较，耐受性树突状细胞具有 CD40、CD80、CD86 表达低，刺激淋 巴细胞增殖弱的特点；耐受性树突状细胞培养体系上清液白细胞介素 10 水平高而白细胞介素 12 水平低。③粒-巨噬细胞集 落刺激因子、血管活性肠肽+地塞米松、脂多糖联合诱导培养生成耐受性树突状细胞效果较佳，其中以血管活性肠肽 40 μg/L、 地塞米松 10 μg/L 的培养条件为最好。 关键词：树突状细胞；免疫耐受；小鼠；细胞因子 doi:10.3969/j.issn.1673-8225.2009.31.016 钟志宏，陈国安，袁利亚，鄢俊，戎吉平，俞火.耐受性树突状细胞体外培养的基本特征[J].中国组织工程研究与临床康复， 2009，13(31):6075-6079. [http://www.crter.org http://cn.zglckf.com] 0 引言 树突状细胞是具有典型树突状形态、膜表 面 高 表 达 组 织 相 容 性 复 合 体 Ⅱ (major histocompatibility complex Ⅱ，MHC-Ⅱ)类分 子、能移行至淋巴器官和刺激初始型T细胞增殖 活化的细胞，是体内最重要的抗原提呈细胞， 在免疫调节中扮演着免疫应答和免疫耐受的双 重角色[1]，对维持机体免疫平衡起重要作用。 随着免疫学的发展，树突状细胞诱导免疫耐受 的作用越来越受到重视[2]。如何利用树突状细 胞诱导抗原特异性免疫耐受并维持其耐受状 态成为研究热点[3]，并因此提出耐受性树突状 细胞的概念。 实验利用粒-巨噬细胞集落刺激因子 (granulocyte-macrophage colony stimulating factor, GM-CSF)、白细胞介素、血管活性肠 肽(vasoactive intestinal pepide, VIP)、地塞米 松、脂多糖等因子体外培养耐受性树突状细 胞，观察不同培养条件下耐受性树突状细胞的 形态学，细胞表型及功能变化，旨在为耐受性 树突状细胞在免疫耐受中进一步研究和应用 打下基础。 1 材料和方法 设计：以细胞为观察对象，随机分组设计， 对比观察。 时间及地点：实验于2006-09/2008-02在 南昌大学第一附属医院中心实验室完成。 材料： 动物：8周龄的Balb/c纯系雄性小鼠，体质 量20~25 g，由南昌大学医学院动物实验室提供 (动物合格证号：医动字(赣)06-013)，饲养于清 洁环境。 实验过程中对动物的处置符合中华人民共 和国科学技术部2006年颁布的《关于善待实验 动物的指导性意见》[4]。 主要试剂及仪器： 实验过程: 骨髓单个核细胞的分离与制备：Balb/c小鼠颈 椎脱位处死，立即在无菌条件下取出双侧股骨， 以RPMI1640细胞培养液冲洗骨髓腔，制备骨 髓细胞悬液。用1.077 g/mL的淋巴细胞分离液 分离单个核细胞，RPMI 1640细胞培养液洗涤3 次，将骨髓单个核细胞调整适当的浓度备用。 细胞实验分组：实验分为5组，树突状细胞 组，血管活性肠肽组，地塞米松组，血管活性 肠肽+地塞米松组和空白对照组。 常规树突状细胞的培养：细胞培养体系为在含 体积分数为10%小牛血清的RPMI 1640细胞培养 液中，加粒-巨噬细胞集落刺激因子100 μg/L、白 细胞介素4 100 μg/L培养，细胞终浓度为1× 109 L-1，置于37 ℃、含体积分数为5% CO2的 细胞培养箱中培养，每周半量换液并补充因子， 第7天加入脂多糖1 mg/L，继续培养72 h后收获 树突状细胞。 血管活性肠肽-树突状细胞培养：细胞培养体系 为在含体积分数为10%小牛血清RPMI1640细胞 培养液中，加粒-巨噬细胞集落刺激因子20 μg/L 和不同质量浓度血管活性肠肽(20，40，80 μg/L)， 细胞终浓度为1×109 L-1，置于37 ℃、含体积分 试剂及仪器 来源 血管活性肠肽 北京博奥森生物技术有限公司 重组人粒-巨噬细胞集 落刺激因子 厦门特宝生物工程股份有限公司 脂多糖、重组人白细胞 介素 4、丝裂霉素 C 美国 Sigma 公司 地塞米松 武汉远程科技发展有限公司 胎牛血清 杭州四季青生物制品公司 淋巴细胞分离液 中国医学科学院血液学研究所 四甲基偶氮唑盐(MTT) Ameresco 公司 RPMI1640 细胞培养液 Gibco 公司 小鼠白细胞介素 10 ELISA 试剂盒、小鼠 白细胞介素 12 p70 ELISA 试剂盒 晶美生物工程有限公司 PE 鼠 抗 人 CD4/80/ 11c、 FITC 鼠抗人 CD25/40/86 BD 公司 钟志宏，等. 耐受性树突状细胞体外培养的基本特征 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 6077 www.CRTER.org 数为5%的CO2细胞培养箱中培养，每周半量换液并补充 因子，第7天加入脂多糖1 mg/L，继续培养72 h后收集 耐受性树突状细胞。 地塞米松-树突状细胞培养：细胞培养体系为在含体积 分数为10%小牛血清RPMI 1640细胞培养液中，加粒- 巨噬细胞集落刺激因子20 μg/L和不同浓度地塞米松(10， 50，100 μg/L)，细胞终浓度为质量1×109 L-1，置于37 ℃、 含体积分数为5%CO2的细胞培养箱中培养，每周半量换 液并补充因子，第7天加入脂多糖1 mg/L，继续培养72 h 后收集耐受性树突状细胞。 血管活性肠肽+地塞米松-树突状细胞培养：根据上述获 得的最佳培养条件，采用血管活性肠肽和地塞米松联合 诱导培养耐受性树突状细胞。 空白对照组：细胞培养体系为在含体积分数为10%小 牛血清的RPMI1640细胞培养液中，不加任何细胞因 子，细胞终浓度为1×109 L-1。置于37 ℃、含体积分数 为5%CO2的细胞培养箱中培养，每周半量换液，第7 天加入脂多糖1 mg/L，继续培养72 h后收获细胞。 形态学观察和细胞计数：倒置光学显微镜下动态观察 细胞的生长情况，或将细胞经瑞氏染色后观察，分别在 培养第0，1，3，5，7，10天取样，在血细胞计数器上 计细胞数，重复4次，求得平均值，并用锥虫蓝拒染法 观察细胞成活率。 树突状细胞表型分析：收集培养第10天的树突状细胞 悬液，流式细胞仪检测细胞CD80、CD86、CD40、CD11c 表达。 树突状细胞刺激淋巴细胞增殖活性测定：收集培养生成 的树突状细胞，四甲基偶氮唑盐法检测树突状细胞刺激 淋巴细胞增殖的活性。 细胞因子检测：收集树突状细胞培养上清液，特异性 夹心酶联免疫分析测定树突状细胞上清液中白细胞介 素10、白细胞介素12的水平。 主要观察指标：光镜下动态观察细胞形态，流式细 胞仪检测细胞CD80、CD86、CD40、CD11c表达，四 甲基偶氮唑盐法检测树突状细胞刺激淋巴细胞增殖的 活性，特异性夹心酶联免疫分析测定树突状细胞上清液 中白细胞介素10、白细胞介素12的水平。 设计、实施、评估者：实验设计为第二作者，干预 实施为第一、四作者，评估为第二、三作者，经过正规 培训，采用盲法评估。 统计学分析：由第一作者采用SPSS 11.5软件完成 统计处理，实验数据以x _ ±s表示，单变量两组资料均数 间比较用t 检验，P < 0.05为差异有显著性意义。 2 结果 2.1 倒置显微镜观察培养的耐受性树突状细胞形态 变化 倒置显微镜下观察结果： 倒置显微镜下观察： 培养第2天可见细胞生长良好，无污染，部分细胞聚集，除 空白对照组外，其他各组均有少量细胞形成边缘突起。 第4天边缘突起细胞数量增多，体积变大，并出现毛刺状细 胞，但毛刺短，分枝少。 第6天细胞由聚集状态逐渐分散，大部分细胞有形态改变， 毛刺状突起更加明显，典型细胞有树枝样突起，其中以血 管活性肠肽+地塞米松组细胞形态变化最明显。 经瑞氏染色的耐受性树突状细胞可见同样的形态改变。显 微镜下观察，耐受性树突状细胞与常规培养的树突状细胞 在形态上无明显差异，见图1，2。 细胞计数结果： 细胞计数： 各实验组细胞成活率均> 95%。 血管活性肠肽+地塞米松组培养第0天细胞数约为2×106/个。 第1天细胞数无增加，约2×106/个。 第3天细胞有明显增殖，约增殖至原来的1.3倍。 培养的第7~10天增殖最明显，第10天细胞数增加至原来的2 倍，细胞数约为4×106/个。 2.2 流式细胞仪检测培养第10天各组树突状细胞表 面标志的表达 各组细胞培养第10天表面标志的表达：见表1。 Figure 1 Morphological differences of tolerogenic dendritic cells cultured for 10 days under optical microscope (×200) 图 1 倒置显微镜下观察培养 10 d 耐受性树突状细胞的 形态变化(×200) Figure 2 Morphological differences of tolerogenic dendritic cells after Wright staining (×200) 图 2 瑞氏染色观察耐受性树突状细胞的形态(×200) 钟志宏，等. 耐受性树突状细胞体外培养的基本特征 P.O. Box 1200, Shenyang 110004 cn.zglckf.com 6078 www.CRTER.org 统计学分析结果： 与空白对照组相比： 树突状细胞组、血管活性肠肽组、地塞米松组和血管活性肠肽+ 地塞米松组CD11c的表达较高，差异有显著性意义(P < 0.05)。 与树突状细胞组相比： 血管活性肠肽组、地塞米松组和血管活性肠肽+地塞米松组 CD40、CD80和CD86表达均降低(P < 0.05)。 血管活性肠肽组以浓度为40 μg/L、地塞米松组以10 μg/L降低 明显，其中血管活性肠肽+地塞米松组在血管活性肠肽浓度为 40 μg/L、地塞米松为10 μg/L条件下为最低，差异具有显著性 意义(P < 0.05)。 2.3 各组树突状细胞刺激淋巴细胞增殖活性测定 结果见 表2。 统计学分析结果： 与树突状细胞组相比： 血管活性肠肽组、地塞米松组和血管活性肠肽+地塞米松组淋 巴细胞增殖活性均降低(P < 0.05)。 血管活性肠肽组以浓度为40 μg/L、地塞米松组以10 μg/L活性 降低明显，其中血管活性肠肽+地塞米松组在血管活性肠肽浓 度为40 μg/L、地塞米松为10 μg/L条件下为最低，差异具有显 著性意义(P < 0.05)。 2.4 各组树突状细胞培养上清中白细胞介素10、白细 胞介素12的表达 见表3。 统计学分析结果： 白细胞介素10： 血管活性肠肽组、地塞米松组和血管活性肠肽+地塞米松组细 胞培养上清液浓度均高于树突状细胞组(P < 0.05)。 血管活性肠肽组以浓度为40 μg/L、地塞米松组以10 μg/L升高 明显，其中血管活性肠肽+地塞米松组在血管活性肠肽浓度为 40 μg/L、地塞米松为10 μg/L条件下为最高 (P < 0.05)。 白细胞介素12： 血管活性肠肽组、地塞米松组和血管活性肠肽+地塞米松组培 养上清液浓度均低于树突状细胞组(P < 0.05)。 血管活性肠肽组以浓度为40 μg/L、地塞米松组以10 μg/L降低 明显，其中血管活性肠肽+地塞米松组在血管活性肠肽浓度为 40 μg/L、地塞米松为10 μg/L条件下为最低 (P < 0.05)。 3 讨论 3.1 耐受性树突状细胞来源和体外培养方法 目前体外 诱导树突状细胞扩增的方法较多，大部分采用细胞因子 联合刺激树突状细胞前体细胞增殖。它们的区别在于树 突状细胞前体细胞不同，以及刺激前体细胞的细胞因子 不同。树突状细胞的前体细胞主要来自脾脏、骨髓、脐 血和外周血等，大致可分为2种：单个核细胞和CD34+的 干细胞。不同来源的前体细胞所培养的树突状细胞功能 有一定的差异。Ratta等[5]发现由外周血CD34+树突状细 表 2 各组树突状细胞刺激淋巴细胞增殖活性 Table 2 Proliferation activity of lymphocytes in different groups (x _ ±s, n=4, A) Dendritic cells : lymphocytes Group 1:200 1:100 1:50 DC 0.553±0.028 0.575±0.021 0.590±0.024 VIP 20 μg/L 0.330±0.067a 0.358±0.025a 0.385±0.034a 40 μg/L 0.310±0.018a 0.333±0.038a 0.355±0.031a 80 μg/L 0.358±0.036a 0.371±0.010a 0.390±0.029a DXM 10 μg/L 0.300±0.016a 0.350±0.022a 0.368±0.048a 50 μg/L 0.360±0.014a 0.373±0.058a 0.385±0.034a 100 μg/L 0.372±0.014a 0.428±0.020a 0.437±0.029a VIP+DXM 0.280±0.045a 0.316±0.005a 0.334±0.004a Blank control 0.390±0.029 0.415±0.037 0.435±0.034 DC: dendritic cells; VIP: vasoactive intestinal peptide; DXM: dexamethasone; aP < 0.05, vs. DC group 表 1 各组树突状细胞培养第 10 天表面标志的表达 Table 1 Surface markers expression of dendritic cells at the first 10 days after culture in different groups (x _ ±s, n=4,%) Group CD40 CD11c DC 35.620±1.721 33.880±1.158a VIP 20 μg/L 20.050±0.784b 25.380±1.042a 40 μg/L 18.130±0.742b 25.790±1.679a 80 μg/L 21.560±0.507b 23.870±0.939a DXM 10 μg/L 12.980±1.050b 26.420±1.056a 50 μg/L 14.840±1.224b 25.400±0.830a 100 μg/L 15.220±0.330b 22.310±1.402a VIP+DXM 11.310±0.738b 29.900±1.218a blank control 29.140±1.053 2.560±0.788 DC: dendritic cells; VIP: vasoactive intestinal peptide; DXM: dexamethasone; aP < 0.05, vs. blank control group; bP < 0.05, vs. DC group Group CD80 CD86 DC 35.500±0.941 38.700±0.748 VIP 20 μg/L 27.600±1.083b 20.170±1.150b 40 μg/L 18.660±1.122b 17.560±0.440b 80 μg/L 23.550±0.621b 23.680±0.713b DXM 10 μg/L 20.170±1.150b 20.380±0.460b 50 μg/L 24.420±1.218b 23.050±0.463b 100 μg/L 24.180±1.003b 23.930±0.699b VIP+DXM 13.170±0.987b 14.350±1.143b blank control 30.520±0.719 27.950±0.681 表 3 各组树突状细胞培养上清中白细胞介素 10、白细胞介 素 12 的表达 Table 3 Interleukin-10 and interleukin-12 expressions in the culture medium of different groups (x _ ±s, n=4, A) Group Interleukin-10 Interleukin-12 DC 0.161±0.007 0.103±0.004 VIP 20 μg/L 0.379±0.009 0.086±0.006 40 μg/L 0.437±0.010 0.073±0.002 80 μg/L 0.371±0.010 0.082±0.003 DXM 10 μg/L 0.526±0.003 0.073±0.003 50 μg/L 0.461±0.008 0.081±0.005b 100 μg/L 0.402±0.008 0.079±0.005 VIP+DXM 0.586±0.003 0.061±0.002 Blank control 0.105±0.016 0.101±0.003 DC: dendritic cells; VIP: vasoactive intestinal peptide; DXM: dexamethasone; aP < 0.05, vs. DC group 钟志宏，等. 耐受性树突状细胞体外培养的基本特征 ISSN 1673-8225 CN 21-1539/R CODEN: ZLKHAH 6079 www.CRTER.org 胞前体细胞扩增得到的比骨髓来源的树突状细胞成熟更 早，而且刺激T细胞的增殖能力较骨髓来源的树突状细胞 强。因此实验用小鼠骨髓细胞作为树突状细胞前体细胞， 适合于培养未成熟的树突状细胞，而利用细胞因子体外 诱导未成熟树突状细胞是培养耐受性树突状细胞的基本 方法。此外，还有用免疫抑制剂(如糖皮质激素，1，25- 二羟维生素D3等)以及基因工程技术修饰来构建耐受性 树突状细胞。利用细胞因子体外诱导未成熟树突状细胞 和免疫抑制剂干扰树突状细胞成熟[6]，从而保持树突状细 胞的未成熟状态，使其具有免疫抑制性[7]。这些具有免疫 抑制性的树突状细胞称为耐受性树突状细胞。 3.2 细胞因子在耐受性树突状细胞培养体系中的作用 耐受性树突状细胞的基本特征：实验利用粒-巨噬细胞 集落刺激因子、白细胞介素4、血管活性肠肽、地塞米 松、脂多糖等因子的不同组合，从受体小鼠骨髓细胞分 离单个核细胞进行诱导分化，体外培养的各组细胞 CD11c的表达都较高，与空白对照组有明显差异，说明 培养的细胞具有树突状细胞的典型表型，形态学观察细 胞具有典型树枝样突起。血管活性肠肽组、地塞米松组、 血管活性肠肽+地塞米松组细胞CD40、CD80和CD86 低表达、刺激同种异型T细胞增殖能力弱，培养细胞的 上清液中白细胞介素10水平高、白细胞介素12的分泌水 平低。说明与树突状细胞组相比，血管活性肠肽组、地 塞米松组、血管活性肠肽+地塞米松组培养的细胞具有 低水平表达共刺激分子、大量分泌白细胞介素10，少量 分泌白细胞介素12的作用。上述结果与Rutella等[8]报道 的耐受性树突状细胞特征相符合。同时也表明实验体外 利用血管活性肠肽、地塞米松等因子联合培养成功诱导 典型形态和生物学特征的耐受性树突状细胞。 目前认为耐受性树突状细胞诱导免疫耐受的机制 主要为低水平表达MHC-Ⅱ类分子，不表达或低水平表 达共刺激分子(CD80、CD86和CD40)。由于在T细胞激 活过程中缺少了免疫应答所必需的第二信号，T细胞不 能被活化增殖，体外刺激T淋巴细胞增殖的能力较弱。 相反耐受性树突状细胞可诱导抗原特异性T细胞无能或 凋亡，从而诱导抗原特异性耐受。而常规树突状细胞在 脂多糖的刺激下发育成熟，能为T细胞活化提供所必需 的表面分子，因此刺激T细胞增殖的能力较强。白细胞 介素10能诱导Th0向Th2反应偏倚，并抑制白细胞介素 12合成。白细胞介素10是体内抑制性细胞因子，可下调 树突状细胞表面MHC-Ⅱ类分子、共刺激分子、黏附分 子及成熟树突状细胞特异性标志CD83的表达。白细胞 介素10还可促进单核细胞来源的树突状细胞诱导抗原 特异性CD4+和CD8+T细胞免疫无能[9]，表现为T细胞增 殖减弱，白细胞介素12、干扰素γ分泌降低。此类树突 状细胞主要对抗成熟信号，可抑制T细胞免疫应答，诱 导T细胞耐受或产生Treg细胞[10]。白细胞介素12是一种 具有免疫调节功能的细胞因子[11]，其功能是促进T细胞 向Th1型偏倚，诱导免疫应答反应[12]。实验中诱导培养 的耐受性树突状细胞低分泌白细胞介素12，高分泌白细 胞介素10，表明耐受性树突状细胞具有较好诱导T细胞 向Th2偏倚，而Th2细胞有诱导免疫耐受作用。 4 参考文献 [1] Adema GJ. 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