清香大曲及酒醅中地衣芽孢杆菌的分离鉴定

酿酒科技 2010年第 1期(总第 187期)·LIQUOR—MAKING SCIENCE＆TECHNOLOGY 2010 No．1(To1．187) 清香大曲及酒醅中地衣芽孢杆菌的分离鉴定 刘桂君 l'2，朱婷婷 2刘红霞：，闻泽喜 ，胡建华 ，郝文军 ，李兰英 (1．北京市辐射中心，北京 100021；2．北京顺鑫农业股份有限公司牛栏山酒厂，北京 101301) 摘 要： 从牛栏山酒厂清香大曲和酒醅中分离出23株芽孢杆菌，通过柠檬酸盐与丙酸盐利用、产酶、需厌氧、V．P、 酪素水解、酪氨酸水解、酸性培养基、耐盐性、生长温度、产酱香物质等生理生化实验进行综合鉴定，鉴定出12株为 地衣芽孢杆菌。 关键词： 微生物； 地衣芽孢杆菌； 牛栏山酒厂； 生理生化实验 中图分类号：Q93—3；TQ920；TS261．1 文献标识码 ：A 文章编号：1001—9286(2010)01—0031-05 Isolation and Identification of Bacillus licheniformis from Fen-flavor Daqu Starters and the Fermented Grains LIU Gui~un · ，ZHU Ting-ting~，LIU Hong-xia ，WEN Ze—xi ，HU Jian-hua2，HAO Wen-jun and LI Lan—ying~ (1．Beijing Radiation Center，Beijing 100021；2。Niulanshan Distillery，Shunxin Agriculture Co．Ltd．，Beijing 101301，China) Abstract：Twenty—three Bacillus strains were isolated from Fen-flavor Daqu starters and the fermented grains in Niulanshan Distillery．Through the operation ofa series ofphysiological and biochemical experiments such as using citrate and propionate，enzyme—producing，aerobic an d anaer- obic，V．P，hydrolyzation of casein and tyrosine，acidity culture medium，salt endurance，growth temperature，Maotai-flavor-producing etc．，1 2 strains were finally identifed as noc／／／／／$licheniformis． Key words：microbe；Bacillus licheniformis；Niulanshan Distillery；physiological and biochemical experiments 芽孢杆菌是大曲中常见微生物，也是重要类群之一。 地衣芽孢杆菌一直以来被认为是酱香型白酒高温大曲中 特有的微生物，本课题组研究发现，在牛栏山酒厂生产用 的多种清香大曲、出池酒醅中同样存在地衣芽孢杆菌，对 分离出23株芽孢杆菌进行生理生化实验，鉴定出 l2株 地衣芽孢杆菌，鉴定结果与中国食品发酵工业研究院分 子鉴定结果一致。本文主要介绍地衣芽孢杆菌的生理生 化鉴定实验方法，为地衣芽孢杆菌的鉴定提供比较完备 的一套方法。 1 材料与方法 1．1 材料 1．1．1 大曲、酒醅 牛栏山酒厂生产用清香大曲、酿酒车间酒醅。 1．1．2 分离用培养基 肉汁培养基：牛肉膏 O．3％，蛋白胨 1．0％，NaC1 0．5％，琼脂2．0％，pH 7．0~7．2，121℃，灭菌 30 min。 1．2 方法 1．2．1 分离方法 一 取大曲干粉或酒醅0．5 g，加入带有玻璃珠的无菌水 三角瓶中，摇床培养 30 min，于 60℃水浴 30 min，然后 收稿日期：2009—10—13 作者简介：刘桂君，女，助理研究员，主要从事微生物发酵及酿酒的研究。 用接种环蘸取，在肉汁培养基平板上划线分离。培养后挑 取单菌落继续划线分离，直到得到单菌落纯菌株为止。 1．2．2 地衣芽孢杆菌生理生化鉴定实验 根据上述分离培养基和分离方法，共计分离得到芽 孢杆菌 23株，编号分别为 1 、2 、3 、4 ⋯⋯22 、23 ，进 一 步对分离菌株进行筛选和鉴定。地衣芽孢杆菌鉴定参 考《伯杰氏细菌鉴定手册》及《常见细菌系统鉴定手册》 (东秀珠，蔡妙英等编著)方法，有所改进。 l-2．2．1 柠檬酸盐与丙酸盐利用实验 某些细菌能利用柠檬酸盐或丙酸盐作为唯一碳源， 并利用磷酸铵作为氮源，将柠檬酸分解为二氧化碳，则 培养基中因有游离钠离子存在而呈碱性。培养基配方： 柠檬酸钠 (或丙酸钠)0．2％、NaC1 0．5％、MgSO ·7H2O 0．01％、(NH~)2HPO4 0。1％、K2HPO4·3H20 0．1％、1％溴百 里酚蓝水溶液 10 mL，琼脂2％。以上成分除指示剂外， 其余加热溶解，调节 pH6．8~-,7．0，并加入指示剂，使培养 基呈草绿色，分装试管，灭菌后摆斜面。 取幼龄菌种接种于斜面上，适温培养 3～7 d，培养基 呈碱性(蓝色)者为阳性反应，不变者为阴性。只有地衣芽 孢杆菌可以利用丙酸钠，为阳性反应，而其他芽孢杆菌均 酿酒科技 2010年第 1期(总第 187期)·LIQUOR—MAKING SCIENCE＆TECHNOLOGY 2010 No．1(To1．187) 不能利用丙酸钠，为阴性反应，但很多种芽孢杆菌都可以 利用柠檬酸钠。 1．2．2．2 产酶实验 1．2．2．2．1 过氧化氢酶实验 过氧化氢酶又称接触酶，能催化过氧化氢分解水和 氧。将芽孢杆菌接种于肉汤培养基斜面上，适温培养 18～24h。取干净的载玻片，在上面滴 l滴 3％～5％的 H2o：，挑取 l环培养 18~24h的菌苔，在 1-1202溶液中涂 抹，若有气泡(氧气)出现，则为过氧化氢酶阳性 ，无气泡 者为阴性。也可将过氧化氢溶液直接加到菌种斜面上，观 察气泡的产生。 1．2．2．2．2 淀粉酶实验 某些细菌代谢产生淀粉酶，把淀粉水解为无色糊精 等小分子，或进一步水解为麦芽糖或葡萄糖。淀粉水解 后 ，遇碘不变蓝色。 培养基：在肉汤蛋白胨琼脂中添加 0．2％的可溶性 淀粉，分装三角瓶 ，于 121℃灭菌 20min备用。卢戈氏 (Lugo1)碘液：碘片 l g，碘化钾 2 g，蒸馏水 300 mL，先将 碘化钾溶解在少量水中，再将碘片溶解在碘化钾溶液中， 混匀 ，定容。 将灭菌后的培养基冷却到 50℃左右，倒成平板，凝 固后，取 18~24 h的纯培养物点于平板上 ，每皿可点种 3～5个菌株，适温培养 2～4 d，形成菌落后，在平板上滴 加卢戈氏碘液，以铺满菌落周围为度，平板成蓝色。如果 菌落周围有无色透明圈出现，说明淀粉已经被水解，实验 为阳性，否则为阴性。透明圈大小说明水解淀粉能力。 1．2．2．2-3 纤维素酶实验 采用刚果红染色法，如果有刚果红存在，刚果红可以 与纤维素结合成红色螯合物，培养基颜色为红色。如果培 养基中有能够产纤维素酶的细菌，将纤维素分解，不能形 成螯合物，在菌落周围形成透明圈。这样可以鉴定产纤维 素酶的细菌。 培养基的配制 ：CMC-Na 5～l0 g，酵母膏 l g， KH2PO 0．25 g，琼脂 l5 g，将上述物质溶解后，用蒸馏水 定容到 1000mL，加入 10mg／mL的刚果红溶液 5 mL， 于 121℃灭菌 20min，冷却倒平板，凝固后待用。取 18～ 24h的培养物点于平板上，每皿点种 3～5个菌株 ，适温 培养 2～4 d，形成菌落后，观察产生透明圈情况，产生纤 维素酶的菌落周围将出现明显的透明圈，否则为阴性。 1．2．2．2．4 明胶液化实验 明胶是一种动物性蛋白，明胶的水解是由于有些细 菌具有明胶酶，能将明胶先水解为多肽，进一步水解为氨 基酸，失去凝胶性质而液化。明胶培养基本身低于 20℃ 凝固，高于24℃则自行液化。明胶分解后，其分子变小， 即使在低于 20℃的温度下也不再凝固。 培养基：蛋白胨 5 g，明胶 120 g，蒸馏水 1000 mL，调 节 pH为 7．2'--"7．4，分装试管，培养基高度 4～5 cm，于 ll5℃灭菌 20 min。 挑取 18"--'24 h培养物，以穿刺法接种于试管中央， 于20~22℃培养。每天观察，液化为阳性，否则为阴性。 1．2．2．3 需厌氧实验 在培养基中加人还原剂，如巯基醋酸钠和甲醛合次 硫酸钠等，以除去培养基中的氧气或氧化型物质，使厌氧 菌能在有氧情况下生长。培养基：酪素水解物 20 g，NaC1 5 g，巯基醋酸钠 HS·CH2COONa 2 g，甲醛合次硫酸钠 HOCH2·SO2Na l g，琼脂 l5 g，蒸馏水 1000 mL，调节 pH 7．2，分装试管 121℃灭菌 20 min，培养基不摆斜面。 用 1环肉汤菌液，穿刺接种到上述培养基中，必须穿 刺到管底。于30℃培养 3～7 d观察结果。如细菌在琼脂 柱表面上生长者为好氧菌，如沿着穿刺线生长者为厌氧 菌或兼性厌氧菌。 1．2．2．4 乙酰甲基甲醇实验(V．P实验) 某些细菌在葡萄糖蛋白胨水培养基中能分解葡萄糖 产生丙酮酸，丙酮酸缩合 ，脱羧成乙酰甲基甲醇，后者在 强碱环境下，被氧化为二乙酰，二乙酰与蛋白胨中的胍基 生成红色化合物，称 V．P阳性反应。培养基：蛋白胨 5 g， 葡萄糖 5 g，NaC1 5 g，蒸馏水 1000 mL。调节 pH7．O～7．2， 分装试管，每管装4～5 mL，于 115℃灭菌 20min。试剂： 40％NaOH(或 KOH)，肌酸。 接种于上述培养液中，适温培养 4～6 d。如为阴 性 ，可适 当延长培养 时间。取培养液 (约 2 mL)和等量 的4O％NaOH相混合 ，加少量(0．5～1．0 mg)肌酸，充分 振荡 2～5 min，如培养液出现红色即为阳性。有时需放 置更长时间或在热水中稍加热，以加速反应进行。 1．2．2．5 酪素水解实验 牛奶平板的制备：取 5 g脱脂奶粉加入 50 mL蒸馏 水中 (或用 50mL脱脂牛奶 )，取 1．5 g琼脂溶于 50mL 蒸馏水中，将两溶液分开灭菌。待冷却至 45~50℃时，将 两液混匀倒于平板，即成牛奶平板。将平板倒置过夜，使 表面水分干燥，然后将菌种点接在平板上，每皿可点接 3～5个株菌。适温培养 3～5 d，菌落周围和下面酪 素是否已被分解而呈透明。配制该培养基时，切勿将牛奶 和琼脂混合灭菌，以防牛奶凝固。 1．2．2．6 酩氨酸水解实验 有些细菌具有酪氨酸酶，能使含酚类的化合物如酪 氨酸、酚等氧化成醌，再经脱水、聚合等一系列反应，最后 形成黑色沉淀物质。培养基：采用肉汤蛋白胨培养基加 0．1％L一酪氨酸，调节 pH为 7．0，分装后于 121℃灭菌 刘桂君，朱婷婷，刘红霞，闻泽喜，胡建华，郝文军，藿兰苤：溘壹 鱼 塑壁主 查茎丝盘董丝坌蛊鉴查 20 min后摆成斜面。接种后培养 3,--7 d，观察斜面有黑 就是产生酱香物质，这与其产生蛋白酶类有关，蛋白酶将 色素者为阳性反应。 蛋白质分解成肽类和氨基酸，经过发酵会产生酱香物质。 1．2．2．7 酸性培养基实验 本实验采用 3种培养基鉴定地衣芽孢杆菌是否产生酱香 培养基：蛋白胨 lO g，葡萄糖 20 g，蒸馏水 1000 mL， 物质。 调节pH 5．7，于 l15℃灭菌20 min。取菌液 1环，接种于 甘氨酸培养基：甘氨酸 5 g，葡萄糖 10 g，NaCI 3 g，蒸 上述培养基中，同时接种普通肉汤(pH 7．0)作对照。适温 馏水 1000 mL，pH 6～7，分装 50 mL到 100 mL三角瓶 培养 1～3 d，观察生长情况。该培养液要求十分澄清，pH 中，于 121℃灭菌20 min。营养肉汤培养基：牛肉膏 3 g， 必须准确，用pH计调测。 蛋白胨 1O g，NaC1 5 g，蒸馏水 1000 mL，pH 7．0~7．4，分 1．2．2．8 耐盐性实验 装50 mL到 100 mL三角瓶中，于 121℃灭菌 30 min。以 耐盐性实验是观察渗透压对细菌生长的影响。由于 上两种培养基均为液体培养基，取培养 18～24 h的菌种 不同菌类耐盐性不同，故常以此作为鉴别特征。一般可根 接入到液体培养基中，摇床 37℃培养48~60 h，取出，鉴 据不同种类的菌株，选择其适合生长的培养基，在其中加 定是否产生酱香物质。 入不同量的NaCI，接种后观察其生长与否，以判断其耐 麸皮培养基：麸皮 1000g，NaOH6g，蒸馏水 600mL， 盐性。 分装到 500 mL三角瓶中，于 121℃灭菌 40 min。接入液 根据鉴定需要，以肉汤培养液配成不同浓度NaCI 体培养菌种 l0％，恒温箱培养 3～5 d，取出，鉴定是否产 溶液，如2％、5％、7％、10％等。培养基要求十分澄清， 生酱香物质。 接种时应采用幼龄菌液接种，适温培养 3～7 d，与未接种 1．2．2．1 l 糖发酵实验 的对照管对比，目测生长情况。 糖发酵实验主要是看该种糖能不能被微生物利用， 1．2．2．9 生长温度实验 如果能够利用则会发酵产酸，培养基中的指示剂会由紫 细菌生长的最高、最适、最低温度，常常是某些细菌 色变黄色，同时可能伴有气泡产生，如果发酵产气则试管 鉴定的特征之一。测定细菌的生长温度，要求培养液十分 中倒扣的杜氏管中培养基会被排出，里面充满气体。本实 澄清(如营养肉汁培养基)，并采用液体菌种直接接种，放 验中糖发酵实验选取葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、乳糖、果糖、 置于恒温水浴培养。在指定温度下培养2～5 d，观察生长 甘露醇、阿拉伯糖、木糖等。培养基为：(NI-L)2HPO 1 g， 情况。若在接近 0℃的低温培养，则观察时间可延长 7～ MgSO ·7H2O 0．2 g，KC1 0．2 g，酵母膏 0．2 g，糖或醇类 l0 10 d或更长。培养 5 d能生长者按生长计算，否则按不生 g，蒸馏水 1000 mL，O．04％溴甲酚紫乙醇溶液 20 mL，调 长计算，可疑者需重新进行培养实验。 节 pH 7．0~7．2，分装试管，每管装 10 mL培养基，试管内 1．2．2．10 产酱香实验 放有杜氏发酵管，于 ll5℃灭菌 20min，排净杜氏管中的 地衣芽孢杆菌在酱香型白酒生产中的一个重要作用 空气。 表 1 盐、产酶实验结果 项目 _ _ 『_ — 1 _{ 丁 柠檬酸盐 + + + 十 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 丙酸盐 一 + 一 ～ + 一 一 十 一 + 一 一 + + 一 + + + + 一 + + 一 过氧化氢酶 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + 十 + + 淀粉酶 + + + + + + + + + 十 一 + + + + + + + + + + + + 纤维素酶 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 明胶液化 ． (蛋白酶) 厌氧生长 + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + + V．P实验 + 十 + + + 十 + + + + + + + + + + + 十 + 十 十 + + 酪素水解 + + + + + + + + 十 + + + + 十 + 十 + + + + + 十 + 酪氨酸水解 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 一 甘氨酸培养 产酱香 + + + + + + + + + + + + + + + + + + 十 + + + + 肉汁培养 产酱香 + + + + + + + + + + + 十 + + + + + + + + + + + 麸皮培养 产酱香 + + + + + + + + + + + + + 十 + 十 + + + + + + + 注：“+”表示能够利用该种物质或者能够产生该种物质，“一”表示不能利用该种物质或者不能够产生该种物质。 喳塑 垫 2010年第1期(总第187期)·LIQUOR—MAKING SCIENCE＆TECHNOLOGY 2010 No．!(To1．187) 注：“ 表示产酸，“一”表示不产酸。 以 18～24 h的幼龄菌种，接种 l环到上述培养基 中，适温培养 3----5 d，观察指示剂是否由紫色变黄，杜氏 管中是否有空气。 2 结果与分析 生理生化实验鉴定结果(见表 1～表 3)。 2．1 柠檬酸盐与 丙酸盐利用 柠檬酸盐与丙酸盐利用实验结果见表 1。23株菌株 均可以利用柠檬酸盐，这也与多种芽孢杆菌都可以利用 柠檬酸钠的特征符合。只有地衣芽孢杆菌可以利用丙酸 盐 ，2 、5 、8 、lO 、l3 、l4 、l6 、17 、18 、l9 、21 、22 这 12株菌株均可以利用丙酸盐，可以初步认为，这 12株 菌株为地衣芽孢杆菌，进一步进行其他的生理生化实验 验证。 2．2 淀粉酶实验结果 实验的23株菌株中，ll 菌株不能水解淀粉，未产 生透明圈。3 、7 、9 3株菌株产生的透明圈最大，几乎铺 满整个平板，其余菌株产生的透明圈大小不一。各菌株水 解淀粉的能力各不相同，3 、7 、9 3株菌株水解淀粉的 能力最强，在初步筛选出的 l2株地衣芽孢杆菌中，5 菌 株产淀粉酶能力较强，2l 产淀粉酶能力较差。透明圈见 图 l、图 2、图 3、图4、图 5和图 6。 2．3 酪素水解实验结果 牛奶的重要组成成分为酪蛋白，所以配制牛奶琼脂 培养基，如果菌株可 以利用酪蛋白则产生透明圈 ，观察显 示很直接。酪素水解实验结果见表 1。在实验菌株中，1 、 3 、7 、9 菌株产生的透明圈最大，其中接种 9 菌株的 平板完全变为透明的，说明水解酪素的能力最强。其余菌 株对酪素水解能力各不相同。 2．4 明胶液化实验结果 明胶液化实验结果见表 1。在明胶液化实验中，1 、 2 、3 、4 、7 、8 、9 、11 、l2 、16 、17 菌株液化 明胶的 能力最强，接种 7 d后将明胶全部液化。说明这些菌株产 生的类蛋白酶类丰富，使明胶水解迅速。在所有菌株中， 6 、19 菌株对明胶的液化能力最弱。 刘桂君，朱婷婷，刘红霞，闻泽圭 塑壅生 塑 芏 奎兰墓：溘查 堂 塑壁主些 茎 盘董 盆塞鳖查 图 1 3 菌株产透明圈平板 图2 5 茵株产透明圈平板 图3 7 菌株产透明圈平板 图4 8 菌株产透明圈平板 2．5 产酱香实验结果 地衣芽孢杆菌是酱香大曲中的重要微生物，能够产 生酱香物质，实验的23株菌株均是从清香大曲和酒醅中 图5 9 菌株产透明圈平板 图 6 21 菌株产透明图平板 分离得到的，因此对其是否产酱香进行确认。通过两种液 体培养基(甘氨酸培养基和营养肉汤培养基)和麸皮固体 培养基发酵培养，结果见表 l。结果表明，这些菌株虽然 能够产生酱香物质，但酱香气味不典型，不明显，而且每 个菌株产生的气味都各不相同。 耐酸性、耐盐性 、生长温度实验结果见表 2，糖发酵 实验结果见表 3。 2．6 分子鉴定实验 对以上经过生理生化实验筛选出来的地衣芽孢杆菌 进行分子鉴定。从地衣芽孢杆菌中提取 16S rDNA片段 ， 通过测序获得 16S rDNA序列信息，再与 16S rDNA数据 库或其他数据库进行比较，从而鉴定种类。本实验与中国 食品发酵工业研究院合作完成。 鉴 定 中用 到 的 两 对 细 菌 通 用 引 物 是 WBAC1／ WBAC2和341／534。DNA提取采用煮沸法和 TIANGEN 试剂公司的细菌基因组提取试剂盒两种提取方法 ，DNA 纯化使用上海申能博彩琼脂糖凝胶回收纯化试剂盒。采 用美国 ABI 9700型 PCR仪进行扩增。 由上海生工生化公司测序，将测定的序列处理后提 交到 NCBI的 Gene Bank进行序列 比对，与 Bacillus Lichen@rmis(地衣芽孢杆菌)的一致率达到 100％。鉴定 结果为地衣芽孢杆菌。 3 结论 3．1 从大曲和酒醅中分离微生物，于 6O℃水浴 30 min (下转第 38页) 酿酒科技 2010年第 1期(总第 187期)·LIQUOR—MAKING SCIENCE＆TECHNOLOGY 2010 No．1(To1．187) 包包大曲内通过系统分离和筛选出来的，具有非常突出 (3)：22—23． 的代表性。同时也印证了作为多粮浓香型酒厂的宜宾叙 [21徐占成酒体风味设计学[M¨E京：新华出版社，2000． 府酒业在长期生产和使用的偏高温大曲内有嗜热细菌存 [3】刘兴熙高温大曲的特性及作用[J]．食品与发酵工业，1996， 在。 (2)：79一 · 2-5．2 该嗜热细菌的 16S rDNA序歹Ij与其他近缘种的系 孟’等‘美拉德反 直与酱香型白 麒 统发育树可以得出：嗜热的 GWJ—IⅡ(GQ480504)细菌与 [5】 庸 ． '曲 生物分析与白酒香型初探[J】．酿酒科技，2o04， Lysinibacillus boronitolercms T-10a(T)聚在一簇的相似度 r ． R． 0 为 98％。其很可能是 Lysinibacillus属 的一个新菌种 ，很 [6] 东秀珠 ，蔡妙英．常见细菌系统鉴定手册【M】．北京：科学出版． 有必要深入研究。同时也预示着我国浓香型白酒酿酒微 [7]R．E．布坎南，N．E．吉本斯．伯杰细菌鉴定手册(第八版)[M t京： 生物区系中有大量的新分类单位菌株的存在。 科学出版社，1984． 2．5-3 从该菌的生理生化试验和微生物高温培养观察 [8]RaineyFA，NaomiWR，KroppenstedtRM．et al：Thegenus 来看 ，GWJ—III具有很强的淀粉水解能力和较强葡萄糖 №。ardiop represen拓 phylogeneticallycoherenttaxo“anda 氧化能力 ，这表明该菌在多粮浓香型 白酒发酵生产 、生 m m。 。 m。mYce 。 “eage：pmP。。 ofN。。ard。op ac。 。fam· 妻过程中起着非常大的作用。同时，其产HES的能力也 [9] ．InJ ， t 。 J S l y 1 s T t J B ， ’ G 08 。 8- 。 1 org 09 an 2． i i。 andpri。 似乎表明，其对于除去发酵产物中的“泥臭”亦有一定的 ～ mary cnⅡ℃ofa ribosomal A o口er。n盂mEscherichi coli 贡献。其出现在偏高温大曲中，可能与宜宾多粮浓香型 『J1．JMo1Bio1 ， 1981，148：107—127． 白酒酒体丰满，带有突出的“陈香”(或称酱香)有一定关 【l0】Chun，J．，Lee，J．-H．，Jun＆Y．'et a1．,EzTaxon：aweb-basedt0o1 系 。 for the identification ofprokaryotes based on 16S ribosomal 3 结论 RNA gene∞quenc。。【J】．Int syst Ev。l Mi。robi。l·2OO7， ， 2259-2261． 从多粮浓香型酒厂中的特级曲药中分离筛选得到一 fll1 KimuraM．A simplemethodforestimating evolutionary ratesof 株嗜热细菌，能在 65℃下正常生长繁殖，对其进行 16S base substitutionsthrough comparative studies ofnucleotide rDNA系统发育分析及生理生化分析，鉴定其为Lysini— sequences[J]．J Mol Evol，1980，16：1 1 l-120． bacillus属微生物 ，并很可能为该属的一个新种 。可能为 【12】 Ahmed I，Yokom A，Yamazoe A，Fujiwara T·，Proposal of 解析多粮浓香型酒白酒酒体形成原因提供一定的理论基 Lysinib “ mm M gen·nov．sp·nov．,andtran 础，亦有可能用于浓香型白酒生产。 Bac ill us ． 参考文献： Int J Syst Ev。1 Micmbi01 ． 2007 May；57(Pt 5)：1 1 17—25． 『1] 沈才洪，许德富，等 大曲“酒化力”的探讨fJ]．酿酒科技，2004， (上接第 35页) -+ 一+ -+ 一+ -+ -+ 一+ -+ -+ 一—— 一十 一—■一-— -+ -—+一 可以排除酵母、霉菌等的干扰，而芽孢杆菌也不会死亡， 所以该方法比较容易分离得到纯芽孢杆菌菌株。 3．2 只有地衣芽孢杆菌可以利用丙酸盐，所以是否利用 丙酸盐可以作为鉴定地衣芽孢杆菌的一个重要依据，但 是其他生理生化实验同样是必不可少的。 3．3 在产酶实验中 ，所有菌株均产生过氧化氢酶 ，这与 芽孢杆菌的性质相符合，但是分离得到的所有芽孢杆菌 均不产纤维素酶。产淀粉酶实验中，淀粉水解是逐步进行 的过程，与菌种产生淀粉酶的能力、培养时间、培养基淀 粉含量和pH等均有一定关系。培养基必须为中性或微 酸性 ，以 pH7．2最适。 3．4 地衣芽孢杆菌产酱香不典型，因为这些菌株都是从 清香大曲和酒醅中分离得的，所以在发酵过程中所起的 作用也各不相同，产酱香不典型的特征正好可以应用到 二锅头酒的生产中，不会将酒 的香型改变 ，而且还可以增 加酒体的醇厚度。 3．5 全部的生理生化实验都是与地衣芽孢杆菌的特征 相对应的 ，结合丙酸盐利用实验和一系列的生理生化实 验可 以基本鉴定地衣芽孢杆菌。本文为地衣芽孢杆菌的 鉴定提供了简便、易行的实验方法。 参考文献： [1】 中国科学院微生物研究所伯杰氏细菌鉴定手册翻译组译．伯 杰氏细菌鉴定手册 (第八版)[M】．北京：科学出版社，1984． 【2] 东秀珠，蔡妙英，等．常见细菌系统鉴定手册[M]．北京：科学出 版社 ，2001．