产氢产乙酸菌与产甲烷菌互养培养物的分离

© 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 名 年 月 中 国 沼 气 第 卷第 期 产氢产乙酸菌与产甲烷菌 互养培养物的分离 刘幸太 王大耗 中国科 一 学院微生物研究所 摘 要 从豆制品 废水厌氧发酵液分 离到氧化丁 酸盐 的 两 种细 菌的 互 养培养物 , 其 中 氧 化丁 酸盐 的产氮产 乙 酸细 菌与 已报道的 沃氏互 养单胞 菌 。。 二 州 相 似 。 细胞杆状 , 微弯 , 两端稍 尖 , 在 凹 陷侧 有 多根鞭毛 , 与其相伴 生 活 的 用氮菌 是在发 酵器 中与其共 同生存的一种产 甲烷球菌 。 随着沼气发酵微生物研究的发展 , 目前 人们普遍认为有机物厌氧发酵生成甲烷的过 程主要由三群细菌完成 。 第一群是水解产酸 细菌 。 它们把大分子的含碳化合物 碳水化 合物 、 脂肪 、 蛋白质 水解成小 分 子 化 合 物 。 这类细菌代谢上的特点是发酵性的 , 以 发酵的中间产物 为最终 电子受体 , 形成包括 各种脂肪酸 、 中性化合物 以及氢和二氧化碳 在内的多种终产物 。 第二群是严格质子还原 产乙酸细菌 。 这群细菌代谢 第一群 菌 的 产 物 , 主要是脂肪酸 、 醇类等生成甲烷前体 乙酸和氢 。 其代谢特点是 以质子还原作为唯 一的 电子受体 , 而质子还原的所产生氢的浓 度 , 影响反应继续进行的方向 , 从而对其本 身的生长有抑制作用 , 因此 , 必须与用氢细 菌 , 如产甲烷细菌 、 硫酸盐还原菌等共同生 活 , 才能完成其代谢作用 。 第三群菌是产甲 烷菌 。 它们利用第一群和第二群菌产生的甲 烷前体生长并产生甲烷 。 在发酵器 中甲烷前 体主要是乙酸 、 氢和二氧化碳 。 由于产甲烷 菌和产生甲烷直接有关 , 人们对产甲烷菌的 研究较前两群菌深入 。 迄今报道的产甲烷菌 近 个种 , 个属 。 对其生理生化特性也进 行 了广泛的研究 。 研究最少的是第二群菌 。 〔, 〕发现曾认为是纯培养 物 的 奥 氏 甲 烷 杆 菌 川 ‘ 胡 。。。 ‘助 娜 是两种菌的混合培 养 物 , 利 用乙醇产氢的 菌和用氢的产甲烷菌共 同代 谢 乙醇产甲烷 , 首先提出严格质子还 原菌的 概念 , 并在实验室 中成功地分离出了氧化脂 肪酸的严格质子还原细菌 。 “ 玲 。 〔 〕分离并定名 〔”〕为沃 氏 互 养 单胞菌 夕 山 ‘ 的氧化 丁酸盐严格质子还原产 乙酸菌 。 。 〔 〕报道了氧化丙酸盐的严格 质子 还 原 菌 , 沃林氏 互 养 杆 菌 夕。 夕 二 ￡‘ 。 他们的工作都是在 了 的实 验室进行的 , 证明了在厌氧消化系统中氧化 脂肪酸的严格质子还原菌的存在及其作用 。 了 〔 〕的 研究证明在厌 氧 消化过程 中 , 可生物降解的 , 约 一 半 生成丙酸和丁酸 。 我们实验室发酵过程的分 析也得到 了类似的结果 。 所以丙酸和丁酸的 分解代谢在厌氧发酵过程 中具有重要意义 。 等〔 〕报道的沃氏互养单胞菌 最初是选用脱硫弧菌 “ 公 该一 © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 第 期 刘幸太等 产氢产 乙酸菌与产甲烷菌互养培养物的分离 作为伴生的 用氢菌进行分离 、 培养的 培养 基 中加入硫酸盐作 为电子受体 , 并发现在 无硫酸盐的情况下 , 亨 氏甲烷螺菌 ” ”‘ 可代替硫 酸 盐还原 菌 。 我们 从豆制品废水厌氧发酵液分离丁酸 盐氧化 菌所 即的川氢菌是一 个甲烷球菌 。 下 边详细介绍其分离过程 及特征 。 温度降至 ℃以下 , 无氧分装小瓶 , ℃ , 。分 钟无菌 , 接种前加入次“ 、 “ , 及底物 , 最终 了 一 。 和方法 一 、 材料及富集培养 样品来 自实验室运转 者仁的豆制品废水 厌氧发酵液 , 无氧操作取样后 , 立即 小时 内 接科 毫 升样品到预先准备好的富集培 养基 中 毫升的小瓶装 。毫升培养液 , 丁酸盐浓度为功 , 并设无 丁 酸 盐 的 对 照 。 对数生长的后期转接 毫升培养物到装 有 毫升培养液的 小瓶 中 。 以此法连续转代 富集培养 , 经 一 天可得到生长后期的稳 定的富集培养物 二 、 培养基 富集用基础培养基成分如下 每升蒸馏 水含 ‘ , · , ‘ · , 酵 母 膏 了 , 胰酶酪素水解物 , 瘤 胃 液 , · 发酵上清液 , 微量元 素 溶 液〔 〕, , 维生素溶液〔 〕, · , 注 以 为气相的瓶 中 注入 。 最终 为 一 。 固体 培养基 中加入 克琼脂 。 实验用培养基 中增加半胧氨 酸 盐 酸 盐 。 除另作说明外 , 底物浓度都是 培养基制备过程 、 除 , 、 半眺 氨被 和 之外 、 其他成分依量加入盛有一 定量蒸馏水的烧瓶中 , 通入无氧氮气 , 煮沸 一 。分钟 , 停止加热 , 加入半脆氨酸 , ’ 待 三 、 菌的分离 纯化 、 用氢产甲烷菌的分离 。 分离培养基 成分同富集培养基 。 用对数生长中后期的富 集物的系列稀释浓作 为接种物滚管 , 底物为 一 , 大气压少 。 滚管后 , ℃培养 。 加天左右滚管 中长出有 荧光的产甲烷菌落 , 挑出菌落 、 稀释滚管 , 重复滚管几次 , 直到获得纯培养物 , 工作号 为菌株 。 、 氧化丁酸盐产 乙酸菌的分离 , 用丁 酸盐作底物 , 取对数生长 中后期的富集培养 物系列稀释作为接种物滚管 , 接 种 前 加 入 。 、 和 , 还要加入 毫升 处于对数生长中后期的菌株 的液体培养 物 。 并设无丁酸盐的对照管 。 滚管后 , ℃ 培养 一 周后 , 在有丁酸盐的滚管 中长 出对照管中没有的荧光菌落 。 将菌落挑出 , 按上法继续滚管 , 直到获得纯培养物 , 对照 管 中无任何菌落生长 , 在含糖营 养 、 培 养 基 中 , 有氧无氧都无生长物 。 四 、 气体分析 用北京分析仪器厂生产的 型 气相 色谱仪 、 热导 、 载体 一 、 碳 分 子 筛 一 目 、 载气 。 上海分析仪器厂生产的 型气相色谱仪 、 热导 、 载 体 一 、 载气 。 用带有密 闭阀的注射器注射定量的样品 气体 , 与标准气的峰高比较计算甲烷产量 。 试验结果 丁酸盐为底物的富集物为接种物 , 以丁 酸盐为底物初次滚管后 , 一 周左右 , 石 荧光显微镜下检查 , 在有丁酸盐的滚管 中 , © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net 第 期 刘幸太等 产氢产 乙酸菌与产甲烷菌互养培养物的分离 甲烷螺菌那样有效地帮助丁酸盐 氧 化 菌 生 长 。 多数 发酵系统 中不存在硫酸盐 , 在这种 情况下 , 即使 有硫酸盐还原菌 , 它们只是 以 化能异养菌的形式起作用 , 不可能作为用氢 菌与脂肪酸氧化菌共 同进行种间氢转移 。 在 发醉系统 中 , 优势的用氢产甲烷菌往往因环 境而异 , 所 以能有效娜三协助脂肪酸氧化菌生 长的用氢甲烷菌不仅限于甲烷螺菌 或个别 用氢能力强的产甲烷菌 。 因此进一步从各 种生态环境 中分离氧化脂肪酸的严格质子还 原菌 , 研究它们 与各种用氢产甲烷菌之间的 关系 , 将是阐明甲烷发酵机理的重要课之 一 。 深入研究它们的生理特性 , 对进一步提 高厌氧消化的效率将有重要意义 。 一 参 考 文 献 。 , 咚 乍 舫 ‘ 五交肠水撼 了 , 一 , 了盯 悦 几 一 朴 、 士 产 浅 子 甲沐 一 , , , 句 一 , , , 。 一 , , 、了、 钱泽 澎 , 阂 航 沼气发酵微生物学 , 浙江科学 技 术出版社 , 页 , , 一 , 刘舞太 , 玉大貂、 , 几 叮衅 一 环 。 , 《户冕沼气鱼, 峥够 , 费发 对 , 二 人 万 甲胆称 〕够血 一 于 盈 , , , 匕 一 份 丈 往皿 以 节 下 一 , , 一 , , , , 户为。二 , , 留 , 。 , 丫 一。。 一‘件 五 · , , 归 , 一 匕。 卜