分子流行病学的研究设计

F 复 uda 里 n 搪(1医M学ed版Sc)i 2005 Jan，32(1)Univ J ～’ 113 分子流行病学的研究设计 穆丽娜 俞顺章 姜庆五 蔡 琳 张作风 (复旦大学公共卫生学院流行病学教研室 上海 200032； 福建医科大学流行病学教研室 福建 350000； 美国加州大学洛杉矶分校流行病学教研室 洛杉矶 90095) 分子流行病学应用先进的分子生物学实验技术检测生 物标志物，从分子水平阐明疾病的病因、致病过程及发病机 制，打开了传统流行病学中的“黑匣子”，为病因学研究和预 防措施评价开辟了新的途径。而同时作为一门交叉学科，它 具有与传统流行病学不同的研究设计特点。因此，本文将主 要介绍如何在流行病学研究设计中应用生物标志物。 生物标志物的种类 应用生物标志物进行研究时，首先须确定标志物在从暴 露到疾病这一连续过程中所处的位置．如图 1所示，这些标 志物主要分为 3类 ，分别为暴露标志、疾病标志和易感性标 志⋯1。分子流行病学研究设计 中不仅要了解生物标志物分 类谱 ，还要正确选择生物标志物来检验研究假设 ，这是开展 分子流行病学研究 的基本前提。分子流行病学研究使我们 能对从暴露到疾病连续过程中的任何两个状态(从左到右) 的关系进行研究，对任何两个标志物间关系的研究以及该研 究在流行病学中可解决的问题如下所示【2 J： 研究的关系： 研究解决的问题： 暴露一内剂量 暴露标志物的有效性 内剂量一生物效应剂量 剂量估计 生物效应剂量一早期生物效应 剂量和效应之间的关系 早期生物效应一改变的结构／功能 效应的致病性 改变的结构功能一临床疾病 临床前指标的有效性 临床疾病一预后意义 预后指标的有效性 暴露一生物效应剂量 暴露指标的有效性 暴露一早期生物效应 暴露和生物效应的关联 暴露一改变的结构、功能 暴露和致病效应的关联 暴露一临床疾病 暴露和疾病的关联 暴露一预后意义 暴露和疾病严重性的关联 内剂量一早期生物学效应 剂量和效应的关联 内剂量一改变 的功能／坌占构 剂量和临床前效应的关联 内剂量一临床疾病 剂量和疾病的关联 内剂量一预后意义 剂量和疾病 的严重程度 生物效应剂量一改变 的功能／坌占构 剂量和临床前效应 的最好指标 生物效应剂量一临床疾病 剂量和疾病的关联，危险度指标 生物效应剂量一预后意义 剂量和疾病严重程度的指标 早期生物效应一临床疾病 疾病有关的效应指标的有效性 早期生物效应一预后意义 疾病严重程度效应指标的有效性 改变的结构 能一预后意义 装凄嚣砉蓑藿志物预测疾病严重 易感性指标 易感性指标作为效应修饰因子 Traditional Epidemiology Ex osure—●■一Disease M olecular Epidemiology M arkers of Susceptibility 图 1 分子流行病学研究的过程及标志物分类 Figl Continuum for molecular epidemiologic research and category of biomarkers 过渡研究(transitional study) 过渡研究是对生物标志物进行评价的研究 ，可以进一步 划分为：生物标志发展研究 、生物标志物特性研究和应用研 究。 生物标志物发展研究 (1)可信度：实验室检验结果的 可重复性在分子流行病学研究中极为重要，在实际工作中往 往由于样本量大或者研究经费等的限制被忽略。如果检测 结果在可接受的参数范围内能被重复 ，或可用标准参照值作 比较，也可作为评价的方法。但鉴于新的实验室检测常常没 有这样的标准，可采用重复性来评 价实验方法的可信度。 (2)测量误差：在无差异错分的情况下，测量误差可偏离研究 关联度的无效假设 ，在有差别的情况下则可支持错误的结 论。如HPV检测技术准确性的提高，使原来 V与宫颈异 常之间的比值比从3，7上升到20，1。现场研究前应充分考 虑实验室工作的可重复性，应用盲法重复检测标本并分析实 验中各种影响因素，必要时应该在不同实验室之间比较检测 结果。(3)标本采集和处理：选择生物材料时应考虑其可利 用性和易获得性两个方面。在此基础上，生物样本的检测结 维普资讯 http://www.cqvip.com 114 复旦学报(医学版) 2005年1月，32(1) 果还受许多因素的影响，如外周血检测受采血时间、防腐剂 的应用、抗凝剂的类型、采血到储存的时间、储存温度等因素 影响。由于分子流行病学研究的花费高，应采用最优化的标 本采集方L2-4 J。 生物标志物的特性研究 主要用于评价个体自身标志 物的变异情况，遗传或环境因素对标志物变化的影响。包括 估计标志物在人群中的频率、水平，鉴别生物标志物变化的 混杂因素和效应修饰因素 ，从而确定标志物检测中实验室差 异、个体内与个体问变异来源的构成。个体内和个体间变异 的比率对决定样本量的大小非常重要。 生物标志物的应用研究 用于评价标志物和它标志的 事件之间的关系(包括关联性、标志物的敏感度、特异度等)。 该类目的不在于建立或推翻一种暴露和疾病的病因联系，而 是期望评价这种相关是否可能存在以及是否足够强，可用于 详尽的流行病学研究[4,5j。常应用横断面研究和纵 向研究 的方法。 横断面研究应用横断面研究在特定的时间、特定的人 群中评价生物标志物和所研究因素间的关系，但该种研究设 计不能判断因果关系的顺序。横断面研究可作为生物标志 物特征研究的第一步，尤其在评价同期的外界暴露和内剂量 指标、生物有效剂量和早期效应等剂量一效应关系中非常有 效，如职业 PAH暴露和铸造厂工人 PAH加合物水平的研 究。评价修饰剂量与效应关系的变量，这些变量可以是其他 外部变量或者是自身因素，如与吸烟有关的4一氨基联苯血 色素加合物被乙酰化型修饰的研究：对生物标志物水平的 人El学等特征进行调整分析，如年龄；另外还可评价遗传易 感性标志物的基因型和表型之间的相关性。在横断面研究 的基础上，可以更好地选择适宜的生物标志物，进一步分析 混杂因素、效应修饰因子等。 纵向研究横断面研究提供生物标志物动态变化的信息 有限，纵向研究可直接评价标志物的动态变化。在纵向研究 中，首先将特定的研究人群按照暴露、不暴露或不同暴露水 平进行分组，对每个研究对象进行 2～3次的标志物水平检 测，从而估计内外部干扰因素对生物标志物水平改变的影 响。当生物标志物水平的改变能反映暴露情况时常选用纵 向研究，比如对工人职业暴露的研究。根据标志物的动态变 化，在工作开始、结束和工作期、假期里暴露的改变进行跟踪 随访，检测工人标志物水平，如苯的暴露和外周血细胞计数。 个体的暴露情况可由于个体主动或者被动干预而改变，如戒 烟使4一氨基联苯血色素加合物形成，控制血脂中 多不 饱和脂肪酸与血小板功能改变。遗传易感性标志物也可作 为暴露一标志物反应关系的效应修饰因子，如遗传基因不同 对饮食因素的修饰作用和血脂的变化。 纵向研究可对研究对象自身进行比较，从而控制了由于 不同的遗传基础对暴露与生物标志物反应的效应修饰。然 而由于在不同时间对个体的重复测量并不独立，若有背于统 计模型的假设时应采用另一些特殊的统计方法进行分析。 生物标志物研究可为病因学研究奠定基础：优化生物标 本的收集、处理和储存等程序：帮助选择合适的研究人群；为 把握度的计算提供资料和收集更丰富的信息对结果进行充 分的解释等。尽管这些基础研究不能计算生物标志物与疾 病危险关系的估计值 ，但却是建立研究假设和产生新的研究 假设中关键的一步。 病因学和干预研究 生物标志物可应用于疾病的病因学和干预性研究，研究 特定人群中疾病的决定因素，并将这些信息应用于疾病控制 和健康保健中。研究对象可以是健康人群，也可以是已患病 者。 观察性研究 生物标志物可应用在描述性研究、横断 面研究、病例 一对照研究和前瞻性纵 向研究 中，后两种类型 在病因研究中具有重要作用。 1．病例一对照研究：在经典的病例 一对照研究中，可把 生物标志物作为应变量将疾病进一步分组，或者作为独立的 危险因素变量，对暴露到疾病过程中的内暴露、外暴露、遗传 易感性以及疾病中间状态进行评价。此外 ，生物标志物可用 于筛检中定义病例和对照(如检测 HIV、胆固醇)。这样，疾 病的定义不再是传统的概念，而是用有效的生物标志物作为 应变量来定义病例了。 (1)定义病例：应用生物标志物可将疾病划分为更为匀 质的亚组，使暴露与遗传易感性的分析以及对筛检的评价更 准确。在癌症研究中此类设计较多地采用传统的组织学技 术 ，如吸烟和肺癌亚型的研究。新发展的分子技术可按照癌 基因或者抑癌基因的突变与否将肿瘤进一步分类，某些突变 可能特异地反映了外环境致癌物的暴露。如终生吸烟和肺 小细胞癌 p53的突变有很强的关联，在该研究中，把肺癌病 例p53突变与否作为一个二分结果变量，与吸烟、人El学以 及临床变量一起进入多变量模型中；在黄曲霉毒素污染地 区，肝细胞癌患者p53突变中DNA碱基对互换模式与黄曲 霉毒素引起的突变类型一致。在研究中把目标基因有否突 变和病例的暴露模式进行比较分析，所有研究的对象都是病 例的这种研究设计称为病例系列(case-~'ies study)研究。该 类研究用于测定病因的异质性和评估机体对环境暴露的生 物效应。在肿瘤分子流行病学研究中，生物标志物检测方法 相对比较复杂，组织标本采集受到一定的限制，因此病例系 列研究应用较广泛_6’ 。 (2)评价外暴露：化学、物理、生物学等外暴露的标志物 已经作为独立变量广泛应用于病例一对照研究中。应用暴 露的标志物时，除了考虑生物标志物的动态变化、持续性和 衰减以外，下面几个问题值得注意L2,4,8 J。 暴露时间：从病因暴露到发病的时间间隔，以及暴露是 在有限时间范围还是一直持续暴露。在病例 一对照研究中 暴露指标的有效性是关键的问题，尤其对于化学物质的暴 露。急性或者亚急性的疾病，如许多传染病、化学中毒引起 的疾病其发病时间短；而慢性病、如癌症、慢性感染性疾病和 多数的肺、心脏疾病等发病的潜隐期长。短潜伏期的疾病， 因为暴露发生在最有可能和疾病发生有关的时段内，应用暴 露标志物显然容易些，半衰期短的暴露指标可能更适用。 在慢性病的病例一对照研究中，暴露标志物的应用研究 是最具有挑战性的。暴露可能在临床发病前已停止了几年， 如职业或不连续的环境暴露，也可能在发病前一直存在某种 程度的持续暴露(如饮食、吸烟暴露)。已经停止对化学物暴 维普资讯 http://www.cqvip.com 穆丽娜，等．分子流行病学的研究设计 115 露的个体，在外周血等较容易获得的生物样本中暴露标志物 一 般不会持续存在，但可累积在其他组织中。有些抗体类型 在暴露停止很多年后尚会持续存在，可用这些免疫标志物进 行研究。一些可以持续存在的暴露标志(如饮食、吸烟、慢性 感染等生物标志物)现已被广泛应用于慢性病的病例一对照 研究中。 疾病对标志物的影响 ：疾病状态可以直接通过生理变化 而影响标志物。如果暴露一直持续到发病阶段 ，疾病状态可 影响暴露，暴露测量尤其是检测半衰期较短的标志物可产生 偏倚。在病例 一对照研究分析中应讨论暴露生物标志物应 用的局限性和疾病不同阶段对分析指标的影响，评价疾病进 展与标志物的关联。采用病例一对照研究设计研究临床病 例的局限性可通过临床前疾病(如大肠腺瘤、宫颈异常)的研 究，或者提高中间标志物检测的有效性而得到克服。 (3)评价遗传易感性：遗传流行病学应用家系研究和双 生子研究等方法对遗传因素在疾病发生中的作用进行评价， 在以人群为基础的研究中，传统上采用家族史调查方法。随 着现代分子生物技术的发展，现在可从功能、表型、DNA等 水平上对遗传易感性进行分析。在癌症研究中应用病例 一 对照研究方法可对前致癌物代谢酶多态性进行评价，如 N一 乙酰基转移酶表型与膀胱癌、酶多态性和肺癌、潜在遗传易 感性表型的脂蛋白与冠心病易感性等研究。 表型标志物的应用：由于当前暴露对表型的修饰，暴露 状况往往不能反映个体一生的暴露模式，如细胞色素氧化酶 (p450)的诱导。病例一对照研究中可以有效应用那些和基 因多态性具有较高一致性以及不被暴露或疾病状态修饰的 表型。由于从少量的外周血 白细胞或者其他容易获得 的染 色体洲 A中可以检测基因型。常采用 RFLP和 PCR基因型 检测代替表型的检测。容易受近期暴露影响的表型指标较 难应用在病例一对照研究中，尤其在还未掌握暴露谱和它们 的表型改变的时候。如临床病人中影响表型的终生暴露模 式已不存在时 ，这个问题更为突出。表型标志物可应用在无 症状的早期病例研究中，因为这些研究对象的当前暴露模式 可能代表终生的暴露。 基因型标志物的应用：越来越多的基因型标志物已广泛 应用于病例一对照研究中，如 卜Ⅱ．A—DQ G链基因型在胰岛素 依赖型糖尿病病人中的分布，载脂蛋白B基因多态性在冠状 动脉初期病人中的分布，肺癌病人谷肮昔肋转移酶 mu位 点，膀胱癌 NA]r2基因型分布等研究。由于这些标志物不受 疾病状态和最近的暴露模式影响，可较好地应用于病例 一对 照研究中。 (4)交互作用的评价 ：分子流行病学最大的功能之一就 是评价外环境暴露和遗传易感性之间的交互作用，如酰化表 型和芳 香氨染 料职业暴露 的交互 作用 与膀 肮癌、石棉或 PAH的职业暴露与眯基四氢异喹胍代谢表型交互作用与肺 癌等。研究表明在暴露史相似的情况下，具有一定表型的个 体患病危险度高于那些无该表型的个体。 由于交互作用评价需要较大的样本含量，实际工作中常 常难以满足，而且对照组织样本很难获得 ，在这样的情况下， 可应用病例一病例研究方法。该方法和病例系列研究相似， 只应用病例组而无须对照组。采用病例一病例研究评价交 互作用所需样本含量大大减小，但需满足的前提假设是所评 价的基因和环境之间的交互作用是相互独立的 ’7j。 今后的研究中，基因型检测在病例一对照研究中将得到 更广泛的应用。因此，在可能的情况下，应获得并保存病例 和对照含有染色体 DNA的生物标本。由于目前能应用在病 例一对照研究中反映化学暴露的标志物有限，调查表仍是收 集暴露信息的主要工具。 (5)通过筛检探测病例：通过健康人群筛检可得到病例 一 对照研究中的病例，如采用宫颈涂片和S状结肠镜筛检探 测早期瘤，检出宫颈癌或大肠癌的病例。筛检得到的无症状 个体由于早期疾病对生理的影响比临床确诊的病例少 ，暴露 标志或易感性标志被歪曲的可能性减少。因为错分少 ，可用 于评价早期生物效应和疾病状态的关系，暴露指标和遗传易 感性的表型也易应用于这样 的研究 中。有预测价值的疾病 中间标志物将有助于在筛检人群中发现病例，尤其是那些在 暴露一疾病链中能代表早期暴露的标志物更有利于应用。 2．纵向研究(前瞻队列、现况队列)：纵向研究应用从暴 露到疾病过程中的所有生物标志物，包括 目标位点或是易于 获得的替代标志物。纵向研究是最有说服力的分子流行病 学研究设计 ，但也最复杂、最花时间，花费最大。 纵向研究设计需考虑从暴露到疾病 的潜伏期和在研究 期间发生新病例的比例。收集所有研究对象在进入研究队 列时的生物标本并进行测量。在一些情况下，队列随访过程 中可进行重复采样和分析。 方法学问题：1)个体的重复测量和实验室结果随时间变 化之间的相关性。2)纵向研究进行的是期间评价，而不只是 点的评价。无论最初有无标志物，队列中的研究对象在随访 期间都可能发展或失去这些标志物。如果标志物是一个连 续变量，那么在不同的检测点其检测值可有变化。3)特定的 程序必须结合队列个体重复测量数据进行分析，如果忽略了 测量之间的相关性，将导致精确度评价的不一致。4)较长期 收集和分析的生物标志物，数据中显示的趋势可能会造成误 解，尤其在前瞻性研究中，研究对象并不可能按照随机的顺 序进入队列。通常实验室数据 的变化趋势可能是 由于研究 开始时进入队列的队员和在研究将结束时进入的队员的测 量值的长期浮动所造成的。 纵向研究尽管花费较多的时间和金钱，但仍然是对标志 物进行评价最可信的研究，这些研究可解决有关预测的问 题。北欧国家的一些研究者进行的一项纵向研究，对所有研 究对象进行细胞发生标志物的检测，尽管研究进行时间还较 短，但染色体畸变频率和癌症发生危险上升趋势间的关系已 受到注意。 3．巢式(嵌套)病例一对照研究和病例一队列研究设计 (交叉设计)：巢式病例一对照研究和病例一队列研究设计只 要求在较小的队列子集中收集暴露、协变量和生物标本，它 们在评价相对危险度时具有较高效力。病例一队列研究设 计是一种不匹配的巢式病例一对照研究，研究开始时在队列 中随机抽取一个子集作为对照组，而巢式病例一对照研究是 在病例被鉴别后选取对照，巢式病例一对照的研究设计在分 子流行病学研究设计中己被用于许多疾病的研究，对罕见疾 病如白血病等的评价效率高；如通过检测尿液中的黄曲霉毒 维普资讯 http://www.cqvip.com 116 复旦学报(医学版) 2005年1月，32(1) 素、代谢产物和 DNA加合物来评价黄曲霉毒素暴露和肝癌 的关系。当巢式病例 一对照研究样本的来源有限时，应用序 贯分析效率更高。序贯分析是一种统计方法，一旦获得期望 的精确度就可以结束实验。 干预实验研究 评价危险度：生物标志物最早应用在 队列中评价干预对癌症和心脏疾病发生危险度的影响。如 果标志物能预示癌症发生，而标志物减少能表示疾病得到控 制则可应用在癌症干预研究中。在进行该类研究前，首先评 价标志物对疾病的真实反应程度 ，而且该研究设计应该可保 证：只有当干预造成的差异明显超过临床上重要的特定值时 才能显示统计学上的显著性。 探测高危人群：将生物标志物应用于高危人群进行疾病 的早期检测。各种生物标志物都可用于这类研究，如膀胱癌 高危职业暴露人群的研究。应用生物标志物结合传统的流 行病危险因素分析，以判别函数区分高危状态的亚群。在此 基础上，区别筛检得到的不同疾病亚群，然后根据费效分析 (用于筛检的花费和控制疾病节省的费用的比较分析)提供 相应的干预措施。 干预实验中非常重要的是将干预效果同中间变量继发 的效果区分开来。如何将暴露产生的直接效应和通过中间 变量调节产生的效应区别开来是流行病学研究、尤其分子流 行病学研究中存在的问题。对中间变量进行调整是评价直 接效应常用的方法。Robbins和Greenland研究指出这种调 整也可发生偏倚，在干预研究中采用阻止中间协变量效应的 方法可将直接和间接效应区分开来。 混杂和效应修饰 混杂 分子流行病学研究应用暴露到疾病结局连续过 程中的变量，在此情况下，很难对混杂因素进行明确定义。 大多数学者认为：从暴露到疾病的病因链上的任何一步都不 作为混杂因素，因为暴露的影响是通过分子、生物学或生理 上的改变来调节的。相反，和标志物有关的其他病因如果同 时也和暴露有关，则被认为是混杂因素。混杂若存在且没有 被控制，可能导致过高或者过低地评价暴露和疾病的联系。 在某些情况下，错误变量可以被控制，对非混杂因素的控制 通常不会偏移效应的评价，而只是降低了研究精度。避免混 杂因素的影响要注意：1)在研究设计中对产生混杂的对象进 行随机分组，或将研究人群潜在混杂因素限制在较小范围并 进行控制；2)根据混杂因素匹配研究对象，在分析中将可疑 的混杂因素分层进行分析。 效应修饰 分子流行病学的主要优势之一是阐明效应 修饰作用，评价两个或者更多因素的相加或者相乘作用的效 应。分子流行病学的贡献在于统计中为计算层别效应提供 变量，暴露或者易感因素和生物学标志物为这些层的选择提 供了基础。发现和疾病有关的备选基因、表型和遗传标志 物，应用易感标志物作为效应修饰因子，从而阐明易感人群 的暴露具有高的疾病危险，而非易感人群或者非暴露人群的 危险度较低。单个基因与环境 的交互作用可能不是疾病的 惟一病因。虽然单基因效应不强，但和其他基因结合起来， 如果没有另外的基因或环境因素的抵消，则可能使疾病的危 险明显增强。所以在阐明基因和环境间交互作用的真实程 度时，应考虑多项易感因素。 发表偏倚 除了一般的流行病学研究中常遇到的选择 偏倚、信息偏倚外，发表偏倚在分子流行病学的研究中较为 突出。研究者或者杂志都倾向于对有显著意义的结果进行 报道，尤其当结果显示为期望的方向时。这样总体结果就成 为一个发生了偏倚的(阳性多于阴性或者无意义的结 果)。鉴于此，一些学者在近年来开始探索对阳性结果进行 评价的方法。比如学者们建议在汇报结果具有统计学上的 显著性时，不仅依赖于P值，还决定于先验概率和检验的统 计学把握度。此外，还应该考虑在研究结果在生物学上是否 有理，并排除可能的偏倚和混杂l9lI 。 【关键词】 分子流行病学；研究设计； 生物标志物 【中国图馆分类法分类号】 R 181．2 参 考 文 献 1 Perera FP，Weinstein IB．M0lecular epidemiology and carcinogen- DNA adduet det~tion：new approach~ t0 audies of human GRnc~ causat~n．J ChⅢ D／s，1982，35(7)：581 2 Schulte PA．Rothman N．Schottenfeld D．Design considerations Molecu Epidernblogy．M01ecular Epidemiology—— pn’ndpl~ and pmctic~．Academ#P ．1993．159 3 Holland NT，Smith MT，Eskenazi B，以a1．Biological samp1e coll~． fion and processing f0r molecul~ epidemi0Jogi cal studi~．Murat Res，2003，543(3)：217 4 李良寿，徐德忠．分子流行病学研究设计与分子流行病学方法． 见徐德忠．分子流行病学．北京：人民军医出版社，1998，32 5 To．oh P，Boffetm P，Shuk~ DEG，以a1．Application of bicsruark． ers in carlc~ epidemiology．Workshop repo~．IARC Sci Pub1． 1997，(142)：1 6 Zhang ZF，Cordon·Cardo C，Rothman N， a1．Methodological is． suesin the use of turnout markers in GRrlC~ epiderniology．IARC Sci Pubz，1997，(142)：201 7 俞顺章 ，蔡琳，穆丽娜，等．单纯病例研究方法在流行病学研究中 的应用．中华流行病学杂志，2003，24(5)：406 8 Pearce N。Boffam P．General issues of study d~ign and anlysis in the use of biomarke~ in ca／1cer epidemiology．IARC Sci Pub1． 1997，(142)：47 9 Boffam P，Tfichopo~os D．Biornarke~ in Cancer Epidmaiology． In：Adami HO，Hunter D，T^ chopolos D。eds．Textbook of CaDeer Epidemiology．New York Oxfo~ U ve商ty Press，2002，73 1O Wacholder S，Chanock S，G~cia．Closas M，以 a1．Assessing the pmbabili~ that a positive repo~is se：all approach f0r molecul~ 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