4免疫球蛋白

nullnull医学免疫学陈小军 chenxiaojun@tijmu.edu.cn 022-23542520 第四章 免疫球蛋白 (Immunoglobulin)第四章 免疫球蛋白 (Immunoglobulin)null概述 免疫球蛋白的结构 免疫球蛋白的异质性 免疫球蛋白的功能 五类免疫球蛋白的特性和功能 抗体的人工制备免疫球蛋白(Immunoglobulin , Ig)null目的要求 （一）掌握抗体和免疫球蛋白的概念；免疫球蛋白的结构；免疫球蛋白的功能；各类免疫球蛋白的特性与功能。 （二）熟悉免疫球蛋白的水解片段；多克隆抗体和单克隆抗体的概念。 （三）了解免疫球蛋白的异质性及抗体的制备方法。nullEmil von Behring, 1901, antitoxinsGeoreges Kohler and Cesar Milstein, 1984, monoclonal antibodySusumu Tonegama,1987, structure of Ig geneGerald Edelman and Rodney Porter, 1972, structure of antibodyPaul Ehrlich , 1908, production of antibodyNobel Prize winners与抗体有关的诺贝尔奖获得者与抗体有关的诺贝尔奖获得者null正常人血清电泳分离图Antigen概述 +-2白蛋白（Albumin）球蛋白（globulin）1IgGIgAIgMIgDnull 抗体(antibody，Ab): 是B细胞接受抗原刺激 后增殖分化为浆细胞所产 生的主要存在于血清 等体液中的具有 免疫功能 的糖蛋 白。基本概念: 免疫球蛋白(Ig)： 具有抗体活性或化学 结构与抗体相似的球蛋白。生物学和功能上的定义 结构和化学上的定义概述概述免疫球蛋白按存在形式分为 分泌型(Secreted Ig , SIg)：分泌入体液中，介导体液免 疫应答。 膜型(Membrane Ig , MIg)：构成B细胞膜上的抗原受体第一节 免疫球蛋白的结构 第一节 免疫球蛋白的结构 null一、基本结构——四肽链结构 免疫球蛋白分子的基本结构是一“Y”字型的四肽链 结构，由两条完全相同的重链(heavy chain, H)和两条 完全相同的轻链(light chain, L)以二硫键连接而成。 每条重链和轻链分为氨基端和羧基端。nullA four-chain unit of Ignull（一）重链和轻链1.重链（ heavy chain, H）：分子量50~75kD ，450~550个 Aa. 据H链C区氨基酸的不同将Ig分为五类，即 IgM，IgD，IgE，IgA，IgG μ δ ε α γ 同一类免疫球蛋白又可以分亚类：如IgG1-G4、IgA1-A22.轻链（ light chain, L ）：分子量25kD ，214个Aa. 轻链分为κ和λ链两种，据此可将Ig分为κ和λ两型 (type)。根据λ链恒定区个别氨基酸残基的差异，又可将λ分为λ1、λ2、λ3和λ4四个亚型。null（二）可变区和恒定区1.可变区（ variable region, V ）： 110个Aa，位于Ig 的 N 端，占轻链的 1/2 和重链的1/4或1/5。 该区的Aa的组成和排列顺序有较大变异，这种变异决定了抗原与抗体结合的特异性。2.恒定区（constant region, C ）： 位于Ig分子的C端，占轻链的1/2和重链的3/4或4/5。 该区的Aa组成和排列在同一动物种属中比较恒定。3.高变区（hypervariable region, HVR）： 重链和轻链V区（分别称为VH和VL）各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域。即Ab与Ag特异性结合的位置。又称互补决定区（complementarity determining region, CDR）。分别为CDR1、CDR2和CDR34.骨架区（framework region, FR）： CDR以外区域的氨基酸组成和排列顺序相对不易变化的区域。null对来自不同B细胞克隆的Ig轻链氨基酸序列进行比较，发现V区的变化主要集中在3个分别由6－10个氨基酸残基组成的狭小区域内。这3个区又被称作高可变区或互补决定区（CDR），参与抗原结合部位的组成。null免疫球蛋白V区和C区结构示意图 免疫球蛋白重链和轻链折叠形成的环形功能区为结构域， CDR为互补决定区，FR为骨架区nullnull（三）铰链区（hinge region） 位于CH1与CH2之间，含有丰富的脯氨酸，因此易伸展弯曲，而且易被木瓜蛋白酶、胃蛋白酶等水解。 绞链区能改变两个Y形臂之间的距离，有利于两臂同时结合两个不同的抗原表位。IgD、IgG、IgA有绞链区，IgM和IgE则无。null（四）结构域（功能区，domain）null（四）结构域（功能区，domain）2.Ig的二级结构——“三明治”状的“β桶状”结构 具有免疫球蛋白折叠结构的分子统称为免疫球蛋白超家族（immunoglobulin superfamily,IgSF）null“Ig-like Domain (Ig样结构域)”nullIg SuperfamilyIg分子超家族的成员多数为细胞膜表面分子。图中显示的是Ig分子超家族的一些主要成员及其分子结构。null（四）结构域（功能区，domain）3.各功能区的功能:(1)VH和VL — 抗原结合部位； (2)CH1～3和CL — Ig遗传标志所在； (3)CH2(IgG)、CH3(IgM) — C1q结合部位； (4)CH2～CH3(IgG) — 结合并通过胎盘； (5)CH3(IgG) — FcγR结合部位； (6)CH4(IgE) — FcεR结合部位。null二、Ig的其他成分nullnullnull三、Ig 的水解片段（一）木瓜蛋白酶水解片段（图）nullFabFcPapainnullpepsinF(ab`)2pFc`第二节 免疫球蛋白的异质性第二节 免疫球蛋白的异质性免疫球蛋白的异质性表现在： 1.不同抗原表位刺激机体产生不同类型的Ig,其识别抗原的特异性不同，其重链类别和轻链型别也不同； 2.不同抗原表位诱导的同一类型的Ig(如IgG)，其识别抗原的特异性不同。null一、Ig 的类型（四）亚型（subtype）null二、外源因素所致的异质性——Ig 的多样性 外源性抗原数目繁多（蛋白质、多糖、脂类等），多样性抗原的存在是导致Ig 异质性（即特异性）的外源因素，是Ig 异质性的物质基础。null同种型（isotype）：种属型标志，Ig C区 同种异型（allotype）：个体标志，Ig C区 独特型 （idiotype）：每个Ig分子所特有独特位（Id) HVR/CDR/Id三、内源因素所致的异质性——Ig 的血清型Ig分子上有三类不同的抗原表位null 1、同种型(isotype) ：存在于同种抗体分子中的抗原表位即为同种型，是同一种属所有个体Ig分子所共有的抗原特异性标志，主要存在于Ig的C区中，据H链C区的不同又分为五个大类，每一类又分若干亚类；按L链的不同分为两型，每型又分为若干亚型。nullnullnull2、同种异型（allotype) ： 同一种属中不同个体所产生的同一类型Ig,由于重链或轻链恒定区内一个或数个氨基酸（即遗传标志）不同而表现的免疫原性的差异 同种异型可以为同一物种的某些个体所共有，但绝不会为同一物种的所有个体所共有，是个体型标志。null3、独特型（idiotype) ：是指每一个B细胞克隆产生的特异性Ig分子上特有的氨基酸序列。因为每种特异性IgV区都不相同，故成为某种Ig分子独特的抗原决定簇或独特的标记。null第三节 免疫球蛋白的功能第三节 免疫球蛋白的功能null一、IgV区的功能——识别并特异性结合抗原二、IgC区的功能二、IgC区的功能（一）激活补体 IgM、IgG1-3与抗原结合活化补体的经典途径； IgA、IgE和IgG4的聚合物可活化补体的旁路途径。二、IgC区的功能（二）结合Fc受体 调理作用： IgG + 抗原(颗粒性) → FcγR（单核、巨噬细胞及中性粒细胞） → 促吞噬细胞吞噬； 抗体依赖的细胞介导的的细胞毒作用（ADCC)： IgG + 抗原(靶细胞) → Fc γR（NK 细胞）→ 杀伤靶细胞 介导Ⅰ型超敏反应：IgE为亲细胞抗体。二、IgC区的功能（三）穿过胎盘和黏膜nullnullnullnull第四节 各类免疫球蛋白的特性与功能第四节 各类免疫球蛋白的特性与功能 一、IgG一、IgG单体，血清和细胞外液中含量最高 四个亚类: IgG1 IgG2 IgG3 IgG4 半衰期长，约20～23天，再次免疫主要抗体 是治疗用丙球的主要成分（人工被动免疫） 主要的抗感染抗体（激活补体、调理、ADCC） 介导超敏反应 唯一通过胎盘的抗体（自然自动免疫）二、IgM二、IgM1.五聚体，分子量最大(900 kd)，又称巨球蛋白； 2.人类发育过程中最早合成的Ig； 3.体液免疫应答最先产生的 Ig — 感染早期免疫； 4.占血清Ig含量的5～10%； 5.半衰期5天 — 血清中特异性IgM 水平增高提示有近期感染； 6.激活补体； 7.IgM 不能通过胎盘 →脐带血或新生儿血清中IgM水平升高表 明胎儿有宫内感染； 8.膜表面IgM是BCR的主要成分，也是B细胞发育成熟的标志。 9.自身抗体 → 自身免疫病三、IgA三、IgA1.两种类型 2.半衰期：6天； 3.占血清Ig含量的5～15%； 4.粘膜局部抗感染免疫 血清型： IgA1，单体； 分泌型：IgA2，二聚体, 粘膜局部浆细胞合成； 分泌片由粘膜上皮细胞合成；四、IgD四、IgD1.单体分子 2.存在形式 分泌型 — 血清中，功能不清； 膜结合型 — B细胞表面, 3.意义 （1）是B细胞成熟的重要标志； （2）抗原受体； 4.占血清Ig含量的1%； 5.半衰期 3天。 五、IgE五、IgE1.单体分子； 2.血清中含量最低(占Ig的0.002%)； 3.半衰期：3天； 4.呼吸道和胃肠道浆细胞产生； 5.亲细胞抗体，介导Ⅰ型超敏反应； 6.过敏性疾病和某些寄生虫感染患者血清中特异性IgE水平增高。 第五节 人工制备抗体第五节 人工制备抗体 抗体技术的发展经历了三个阶段 第一代：多克隆抗血清 第二代：细胞工程抗体（单克隆抗体） 第三代：基因工程抗体一、多克隆抗体（pollyclonal antibody，pAb） 一、多克隆抗体（pollyclonal antibody，pAb） 体内存在千百种抗体形成细胞，每种细胞只识别特定的抗原表位，并在后者刺激下增殖分化，而来得细胞群称为克隆（clone）。 一种抗原物质可具有多种不同表位，每一表位可刺激机体一种抗体形成细胞产生一种特异性抗体。 多克隆抗体为第一代人工抗体，由多克隆细胞产生的多种抗体的混合物抗体产生的一般规律抗体产生的一般规律初次应答：机体初次接受适量抗原刺激后，经过一段相对较长的潜伏期后，才能在血清中出现含量较低、持续时间较短、以IgM为主的抗体，这种现象称为～。此时产生的抗体与抗原结合的强度较低，IgG出现的时间较晚。 再次应答：初次应答后，当抗体下降并恢复正常时，再用相同的抗原进行免疫，则抗体产生的潜伏期明显缩短，抗体含量明显上升，且维持时间更为长久，这种现象称为～，也叫回忆应答。初次和再次免疫应答示意图初次和再次免疫应答示意图null多克隆抗血清的制备 这是最经典、传统的制备抗体的方法，也是技术上最容易和最简单的。 ★免疫原 ▲细胞（cell) ▲蛋白质(MW>10000) ▲多肽(﹥15 amino acids) ★佐剂（Adjuvant） ★载体（Carrier） ▲KLH(keyhole limpet hemocyanin) ▲BSA(bovine serum albumin) null1.Mice 小、易掌握、经济，如果抗体需求量小，小鼠是最佳选择。一般从眼球取血能得到0.1～1.0ml。 2.Rabbits 100ml血清 3.Chichens IgY, 蛋黄，量多。 4.其它 羊、马等null多克隆抗体的 优点 1.价廉，低技术，能得到高特异性和高效价的抗血清。 2.能用无关抗原吸收而去除非特异反应。 3.多抗能用于依靠形成沉淀带的实验（如免疫扩散，火箭电泳等）。 缺点 1.不同抗体的混合体，用无关抗原去吸收效果不佳。 2.多抗批间差异大。 3.多抗目前极少用于治疗。二、单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb)二、单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb) 第二代人工抗体； 由一个B细胞克隆产生的、只作用于单一抗原表位的高度特异性抗体，称为单克隆抗体。其优点为：结构均一、纯度高、特异性强、效价高、少或无交叉反应、制备成本低。null(一 )基本原理 杂交瘤技术是利用肿瘤细胞容易体外培养和长期生存的性质，将肿瘤细胞和能分泌特异性抗体的B淋巴细胞进行融合制备杂交瘤细胞，后者继承了肿瘤细胞和B淋巴细胞的性质，即能分泌特异性抗体，又能长期生存。它是建立在杂交瘤细胞的选择培养系统基础上，采用的HAT选择性培养系统是在普通细胞培养液中加入次黄嘌呤（H，Hypoxanthine），氨基蝶呤（A，Aminopterin），胸腺嘧啶核苷（T，Thymidine）,它是根据细胞内嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的生物合成途经设计的，用于分离杂交瘤细胞的选择培养液。 null细胞的DNA的生物合成有两条途径。 1.主要途径（Main Pathways）； 由氨基酸及其他小分子化合物合成核苷酸，进而合成DNA。 2.应急或补救途径（Salvage Pathways）； 它是利用外源性的核苷酸的“前体”，如次黄嘌呤（H，Hypoxanthine）和胸腺嘧啶核苷（T,Thymidine），在次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖核酸转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（TK）的催化下合成核苷酸，进而合成DNA。 null HAT培养液中的氨基蝶呤（A）是一种叶酸拮抗剂，它可阻断细胞内DNA合成的主要途径，而HAT培养液中又提供了核苷酸的“前体”次黄嘌呤（H）和胸腺嘧啶核苷（T）。杂交瘤技术中常用的肿瘤细胞为Balb/c 小鼠骨髓瘤细胞系（Myleoma cell line）如SP2/0，NS-1及X63-Ag8等，均是人为使其缺乏HGPRT酶的细胞株。当细胞融合后，将细胞置于HAT培养液中进行培养时，Myleoma cells及其相互融合形成的同核体细胞的DNA合成的主要途径被氨基蝶呤阻断，同时又缺乏HGPRT，不能利用补救途径，故它们在HAT中不能生长。Spleen cells 不能在组织培养液中长期生长，它们一般在5-7天内也会死亡。只有Myleoma cells和Spleen cells相互融合的Hybridoma cells由于具有两种亲代细胞的染色体（基因组），故在HAT生存下来的是Hybridoma cells。 HAT selection systemHAT selection systemRNADNAA M I N O P T E R I NMain biosynthetic pathwaySalvage path wayHGRPThypoxanthinethymidineTKTK: thymidine kinase HGRPT: hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferasenullMyeloma cellNormal B cell Fusion cell Can not Live Salvage pathwaysurviveHGPRT -Can not live permanentlynullnull三、基因工程抗体(genetic engineering antibody)三、基因工程抗体(genetic engineering antibody)定义 按照研究者意愿，在DNA水平对Ig基因进行切割、拼接或修饰，导入受体细胞表达的新型抗体分子。null出发点都是为了解决单克隆抗体的的鼠源性问题null Thank You!