枸杞多糖对人树突状细胞成熟的影响

枸杞多糖对人树突状细胞成熟的影响 单铁英1 　刘晓霞1 　苏安英1 　唐军民2 11 河北大学医学院 (河北 邯郸 056002) 　21 北京大学基础医学院 (北京 100083) 　　摘要 : 目的 : 研究枸杞多糖对人树突状细胞 (DC) 面标志及功能成熟的影响。方法 : 通过密度离心法分离人 外周血单核细胞 , 采用细胞因子体外培养 7d 后 , 实验组加入枸杞多糖 (100ug/ ml) , 空白对照组加等量 RPMI1640 , 两 组分别同时作用 48h , 观察细胞的形态变化及用免疫细胞化学法检测其表面标志的表达。通过混合淋巴细胞反应检测 细胞提呈抗原的能力。结果 : 用枸杞多糖刺激的人 DC表达 MHC2Ⅱ、CD83、CD86 和促进 T细胞的增殖的能力比空白 对照组增加。结论 : 枸杞多糖可以促进体外培养的人 DC的成熟 , 促进 DC诱导的免疫应答启动。 　　关键词 : 枸杞多糖 　影响 　树突状细胞 　人 　　中图分类号 : R28515 　　文献标识码 : A 　　文章编号 : 1000 - 3649 (2009) 03 - 0044 - 02 　　枸杞多糖 (lycium bararum polysaccharides , LBPs) 是传统中药材枸杞的主要成分之一 , 由阿拉伯糖、 葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖等 6 种单 糖组成。近年来 , 对枸杞多糖的药理作用进行了广 泛的研究 , 发现枸杞多糖具有调节机体免疫、抗肿 瘤等功能[1～3 ] , 枸杞多糖的研究已成为当前的热门课 , 但是国内外还未见有枸杞多糖对人树突状细胞 活性和功能影响的报道。 树突状细胞 (dendritic cell , DC) 是一种重要的 专职抗原提呈细胞 , 对启动辅助性 T 细胞和细胞毒 性 T细胞的免疫应答具有重要作用[4～7 ] 。未成熟 DC 俘获和处理外源性抗原后变成熟 , 成熟后的 DC 迁移 至淋巴器官 , 通过主要组织相容性复合物 (MHC) 分子提呈抗原多肽和共刺激分子来激活 T 细胞 , 启 动特异性免疫应答。实验证明 , DC 的成熟状态与其 功能有关 : 未成熟 DC 有较强的抗原摄取和加工能 力 , 同时低表达 MHC2Ⅱ和共刺激分子。成熟 DC 摄 取抗原功能下降 , 但是 MHC2Ⅱ和共刺激分子高表 达。我们用LBPs 作刺激剂 , 研究其对人外周血来源 的 DC成熟的影响 , 为进一步研究 LBPs 调节特异性 免疫应答的机理提供理论依据。 我们用LBPs 作刺激剂 , 研究其对人外周血来源 的 DC成熟的影响 , 为进一步研究 LBPs 调节特异性 免疫应答的机理提供理论依据。 1 　材料与方法 111 　材料 　新鲜人外周血 , 购自北京市血库。RP2 MI21640 培养液 , 购自美国 GIBCO 公司。淋巴细胞分 离液 ( Ficoll , 11077/ ml) , 购自上海试剂二厂。胎牛 血清 (FCS) , 购自美国 HYClone 公司。重组人粒细 胞2巨噬细胞因子 (rhGM2CSF) 、重组人白细胞介素 2 (rhIL22) 和重组人白细胞介素 4 (rhIL24) , 购自德国 R&D 公司。尼龙毛 ( Scrubbed nylon fiber) diameter3 , 318cm , type200 , 购自 FENWAL USA。鼠抗人 MHC2 Ⅱ、鼠抗人 CD86、鼠抗人 CD83 , 即用型二步法生物 素检测试剂盒 (PV9000) 、FITC标记的第 Ⅱ抗体工作 液、磷酸缓冲液 (PBS , 0101M , PH712～714) 、多聚 赖氨酸、DAB、Triton2100 均购自北京中山生物技术 有限公司。HEPES , 购自 Sigma 公司。TRIZOL 试剂 盒 , 购自 Invitrogen 公司。枸杞多糖购自美国泛华公 司。 112 　方法 11211 　单核细胞、熟树突状细胞的获得及培养 　取 正常人新鲜外周血 200ml , 以淋巴细胞分离液分离外 周血单个核细胞 ( PBMNC) , 在 37 ℃和 5 %CO2 饱和 湿度条件下培养 2h , 取贴壁细胞即单核细胞 , 加入 RPMI21640 液、10 % 3 胎牛血清 ( FCS) 细胞因子 rhGM2CSF1000U/ ml ; rhIL24500U/ ml 于 37 ℃和 5 %CO2 饱和湿度条件下培养 7 天后 , 收获的细胞分为两组 : 实验组 : 加入浓度 100μg/ mlLBPs 组 ; 对照组 : 加入 等量的 RPMI21640 组 ; 两组分别同时作用 48h 后收集 细胞 , 观察树突状细胞的形态变化及用免疫细胞化 学法检测其表面标志的表达。 11212 　T 细胞的获得 　取同种异体的外周血 , 按上 述获得单核细胞的方法 , 收集非贴壁细胞即为淋巴 细胞 , 将 3 ×107/ ml 的淋巴细胞注入尼龙毛柱 , 放入 37 ℃, 5 %CO2 培养箱静置 1h。用预温的 37 ℃含 20 % 小牛血清 RPMI21640 培养液洗柱 , 洗下的即为 T 细 胞 , 加入 RPMI21640 液、10 %胎牛血清 ( FCS) 和细 胞因子 rhIL22500U/ ml 于 37 ℃和 5 %CO2 饱和湿度条 件下培养待用。 11213 　混合淋巴细胞反应 (MLR) 用 T 细胞培养液 悬浮上述 T细胞为 2 ×105 个 100μl , 以 100μl/ 孔加入 96 孔板 , 作为反应细胞。收集培养 7d 的上述两组 DCs , 以丝裂霉素 (25μg/ ml) 灭活 45min , 用 RPMI2 1640 洗 3 遍 , 作为刺激细胞。调整 DC 浓度 2 ×103/ 孔、1 ×104/ 孔、2 ×104/ 孔、分别与淋巴细胞混合 , 总体积 200μl/ 孔 , 每组设 5 个复孔。置 37 ℃, 5 % CO2 孵箱培养 120h , 于最后 18h 加入 10μlMTT (5mg/ ml) 。收集细胞 , 酶标仪检测 OD 值 , 结果以 5 孔平 均值表示。 ·44· 四 　川 　中 　医 Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine 2009 年第 27 卷第 3 期 Vol127 ,No13 ,2009 　 增值指数为 : 实验组 OD 值2反应细胞对照组 OD 值 - 刺激细胞对照组 OD 值/ 反应细胞对照组 OD 值。 11214 　数据处理 　所得数据经 SPSS1110 软件进行处 理 , 样本均数的比较采用 t 检验。 2 　结 　果 211 　正常人外周血经淋巴细胞分离液分离的 PBM2 NC , 经贴壁后得到的贴壁细胞即单核细胞 , 在培养 过程中 , 倒置相差显微镜下可见细胞体积逐渐增大 , 细胞形态逐渐由圆形变为逗点状、蝌蚪状、长梭形 或不规则形 , 并向四周伸出不规则状的突起。 免疫细胞化学检测 DC 细胞表面 : MHC2Ⅱweak + 、 CD86weak + 、CD83weak + 。 　　透射电子显微镜下观察 DC : 细胞的突起呈多样 化 , 有的呈丘状 , 有的呈粗短指状 , 有的细而长可向 四周呈放射状伸出 , 也可盘曲呈环状 , 细胞核呈肾形 , 较大 , 位于细胞一侧 , 细胞内可见有大量的吞饮泡。 212 　倒置相差显微镜下显示 　细胞悬浮生长 , 体积 较大 , 大小不等 , 呈圆形 , 细胞表面有突起 , 呈毛 刺样 , 细胞突起变细 , 变多 , 细胞突起在培养液中 可摆动或伸缩。细胞核为 1 个 , 居中。 　　免疫细胞化学检测 : 免疫细胞化学检测显示经 LBPs 诱导培养 2d 后的 DC 的表面标志及蛋白表达发 生变化 , MHC2Ⅱ+ 、CD86 + 、CD83 + , 阴性对照无阳 性信号。而经 RPMI21640 培养的 DC 分子表达与培养 前无明显变化。对照组与实验组培养的 DC 的分子表 达图像分析 (表 1) 。 表 1 　实验组和对照组培养 2 天后的树突状细胞 表面分子表达的图像分析结果 ( …x ±s) 表面标志 实验组树突状细胞 MOD ( n = 20) 对照组树突状细胞 MOD ( n = 20) 结　果 MHC2Ⅱ 012874 ±010145 010279 ±010163 P < 0105 CD86 011860 ±010046 010128 ±010032 P < 0105 CD83 011926 ±010038 010253 ±010019 P < 0105 　　透射电子显微镜观察显示 : 形态上基本相同 , 但 前者细胞器与后者相比更不发达 , 细胞中的吞噬泡较 少 , 经 RPMI21640 培养的 DC与培养前无明显变化。 　　扫描电子显微镜观察 : 扫描电子显微镜显示两 者无明显差别。 213 　T细胞增殖实验结果　在混合淋巴细胞实验中 , 经LBPs 诱导培养的 DC比经 RPMI21640 培养的 DC 激 发 T细胞的增殖能力进一步增强 ( P < 0105) (表 2) 表 2 　淋巴细胞增殖率 组别 DCs 浓度 2 ×103 1 ×104 2 ×104 实验组 01412 ±01019 01524 ±01016 01687 ±01012 对照组 01193 ±01011 01226 ±01013 01312 ±01009 　　注 : 与对照组比较 , P < 0105 3 　讨 　论 　　枸杞多糖已经很多实验证明具有调节免疫功能 和抗肿瘤的功能。已有文献报道了 LBPs 对巨噬细 胞、T 淋巴细胞、NK 细胞的影响[2 ,3 ,8 ] , 但 LBPs 对 DC的表型和功能的影响却未见报道。至今对髓系树 突状细胞的分化发育过程已基本清楚。树突状细胞 的分化发育过程概括为四个阶段 : ①树突状细胞的 前体 ; ②未成熟期树突状细胞 ; ③迁移期树突状细 胞 ; ④成熟期树突状细胞。未成熟的树突状细胞主 要分布于表皮和黏膜的上皮组织中 , 未成熟期树突 状细胞表达几种辅助分子较弱 , 如 MHC2Ⅱ、CD86、 CD83 , 而这些分子正是与树突状细胞抗原提呈作用 密切相关的分子 , 也是与树突状细胞对 T 细胞的激 活作用密切相关的分子。我们发现 DC 经过 LBPs 刺 激作用后 , MHC2Ⅱ、CD86、CD83 的表达增高 , 同时 混合淋巴细胞反应也证实 , 经 LBPs 培养后 DC 激活 同种异型的 T细胞能力也增强。这些都说明 LBPs 诱 导 DC成熟 , 同时刺激初始型 T细胞能力增强。 我们的实验从 DC形态、表面抗原、抗原提呈功 能方面来证明枸杞多糖对人骨髓树突状细胞成熟的 影响。提示LBP 调节免疫功能和抗肿瘤与其诱导刺 激 DC功能成熟有关。 参考文献 　　 [1 ] GON G H , SHEN P , J IN L , et al . Therapeutic effects of Lyci2 um barbarum polysaccharide (LBP) on irradiation or chemotherapy2induced myelosuppressive mice [J ] . Cancer Biother Radiopharm , 2005 , 20 (2) : 155 ～162 　　 [2 ] Gan L , ZHAN G S H , YAN G X L , et al . Immunomodulation and antitumor activity by apolysaccharide protein complex from Lyciumbarbarum [J ] . In t Immunopharmacol , 2004 , 4 (4) : 563～569 　　 [3 ] CAO Guangwen , YANG Wenguo , DU Ping. Observation of the effects of LAK/ IL22 therapy combining with Lycium barbarum polysaccharides in the treatment of 75 cancer patients [J ] . Chinese Journal of Oncology , 1994 , 16 (6) : 428～431 　　 [4 ] ZHU Kejian. Dendritic cell and autoimmune diseases [J ] . Journal of Zhe jiang University : Medical Sciences , 2003 , 32 (1) : 81～84 　　 [5 ] Banchereau J , Steinman R M. Dendritic cells and the control of immunity [J ] . Nature , 1998 , 392 (6673) : 245～252 　　 [6 ] L anzavecchia A , Sallusto F. Regulation of T cell immunity by dendritic cells [J ] . Cell , 2001 , 106 (3) : 263～266 　　 [7 ] LIU YL. Dendritic cell subsets and lineages , and their functions in innate and adaptive immunity [J ] . Cell , 2001 , 106 (3) : 259～262 　　 [8 ] HE Yanli , Ying Yi , XU Yanli , et al . Effects of Lycium bar2 barumpo lysaccharide on tumor microenvironment T lymphocyte subsets and den2 dritic cells in H222bearing mice [J ] . Journal of Chinese Integrative Medicine , 2005 , 3 (5) : 3742377 (收稿日期 　2008211215) ·54· 2009 年第 27 卷第 3 期 Vol127 ,No13 ,2009 四 　川 　中 　医Journal of Sichuan of Traditional Chinese Medicine