HPLC法测定多维片中痕量维生素D3的含量

HPLC法测定多维片中痕量维生素 D3 的含量 王乔飞 (江苏江山制药有限公司，江苏 靖江 214500) 摘要:建立了运用 HPLC法对痕量 VD3 进行含量测定的分析。实验中采用菲罗门硅胶(silica)柱，以异丙醇:正己烷 (0． 5:99． 5)为流动相，流速:2ml /min，紫外检测波长:264nm，柱温:30℃。实验明:VD3 在 0． 1μg /ml ～ 0． 8μg /ml 范围 内，其色谱峰面积与质量浓度呈良好线性关系，r = 0． 9999(n = 5) ，平均回收率为 99． 04%，进样精密度为 1． 26%。本法操 作简便、快速，准确，适用于痕量成分的含量测定。 关键词:维生素 D3 ;高效液相色谱 ;含量测定 中图分类号:R917 文献标识码:A 文章编号:1009 － 7961(2010)03 － 0082 － 03 Determination of Trace VD3 in Multi － vitamins with HPLC WANG Qiao － fei (Jiangsu Jiangshan Pharmaceuticals Co． Ltd．，Jingjiang Jiangsu 214500，China) Abstract:An analytical method is established for detecting trace vitamin D3 in multi － vitamins tablets with HPLC． In the experiment，the chromatographic column of Phenomenex silica is used，and hexane (0． 5:99． 5) is in the mobile phase;the flow rate is 2． 0ml /min，the UV detective wavelenth is 264nm and column tempera ture is 3 0 ℃ ． A good liner correlation is found between the peak areas and the concentrations in the range of 0． 1 － 0． 8 ug /ml of VD3(r = 0． 9999，n = 5)． The average recovery is 99． 04%;the precision is 1． 26% ． The method proves to be rapid，accurate and applicable for the determination of the trace in vitamin D3 ． Key words:vitaminD3;HPLC;determination 收稿日期:2010 － 05 － 21 作者简介:王乔飞(1970 －) ，男，江苏靖江人，执业药师和执业中药师。 多维片是综合营养保健品，其成份极其复杂， 不但包括各种水溶性和脂溶性维生素，还有多种 补充的微量元素，其中 VD3 是一种脂溶性维生素， 其含量极低，样品中仅约含 2． 5ug /g，且性质不稳 定，遇光和空气均易变质、降解，而且其它杂质对 其稳定性和检测都有影响和干扰，其含量测定一 直是个瓶颈难。 有关资料提供的方法，主要采用添加碱液进 行皂化反应，然后采用石油醚、乙醚多次萃取，再 用氮气流吹干处理。不但操作过程繁琐，而且样 品的回收率不稳定，操作的重现性很差。有的方 法在对样品中 VD3 充分溶出作了考虑，但在处理 过程中缺少抗氧、防吸附，减少干扰等措施，致使 成分仍有损失而回收率偏低。有文献报道，采用 反相色谱系统测定，但对于脂溶性维生素采用反 相系统，样品回收率不满意。 本文提供了一个实用、易操作的检测方法，无需 进行皂化处理和反复萃取等繁琐操作，而是针对 VD3性质不稳定，制剂成分复杂的情况，分别采取了 避光、抗氧，抗干扰分离手段，取得了较好效果。特 别适用痕量 VD3的准确测定。该方法未见报道。 1 仪器与试药 1． 1 仪器 Agilent 1200 HPLC系统，配紫外检测器。 1． 2 色谱条件 色谱柱:菲罗门 luna 5um silica 柱 250 * 4． 6 mm;流动相:异丙醇:正己烷(0． 5:99． 5) ;流速:2 ml /min;检测波长:264 nm;进样体积:75 uL。 1． 3 试药 对照品:VD3:USP standance，Cat no:13100， Lot:MOB157 第 19 卷第 3 期 淮 阴 工 学 院 学 报 Vol． 19 No． 3 2010 年 6 月 Journal of Huaiyin Institute of Technology Jun． 2010 试剂:正己烷、异丙醇、二甲亚砜为色谱纯;氯 化钠、抗坏血酸、吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(AP- DC)为分析纯。 2 实验方法与结果 2． 1 各试液的制备 对照品贮备溶液:精密称取 60． 0mg ± 0． 1mg 维生素 D3 对照品于一 250ml 棕色容量瓶中，立即 用正己烷溶解并稀释至刻度，此溶液浓度为 0． 24mg /ml。 对照品溶液:精密吸取上述对照品贮备 溶液用正己烷溶剂再分步稀释 500 倍后，得对照品 标准溶液。 样品溶液制备:取 5g APDC 和 1 g 抗坏血酸， 溶于 1000mL DMSO中，具塞，避光保存，作为萃取 溶液;取 20 片样品磨细，精密称取约 5． 0g 细粉于 一 200mL棕色具塞锥形瓶中，加 25mL 萃取液，上 述溶液于超声水浴机中 60 ± 3℃超声 15min，取出 放冷至室温，加入 25． 0mL正己烷，强烈振摇，再加 15mL18% NaCl溶液，缓缓摇动，具塞放冷。高速 涡旋混匀约 5min，再静置 5min，吸取上层液体于一 50mL离心管中，高速离心约 5min，取正己烷上清 液过滤后注入 HPLC液相色谱仪。 2． 2 系统适应性试验 分别制备对照品标准溶液和样品溶液，各取 75μL注入液相色谱仪，分别记录对照品标准溶液 和样品溶液色谱图(如下图所示) ，结果 VD3 和其 它杂质峰的分离度大于 2． 0，理论板数按 VD3 峰计 算大于 2500，表明该系统适应性良好。 图 1 对照品标准溶液色谱图 图 2 样品溶液色谱图 2． 3 线性关系 精密称取维生素D3对照品，配制浓度为 0． 1、0． 2、0． 4、0． 6、0． 8μg /mL 的溶液，分别进样， 记录色谱图，色谱峰面积分别为:9 ． 40，18 ． 64， 37． 81，57． 30，75． 77。对照品峰面积与进样浓度作 线性方程:A = 97． 521C － 0． 191，C 表示浓度，单 位:mg /mL。(n = 5，r = 0． 9999) ，样品溶液浓度范 围为 0． 1 ～ 0． 8μg /mL。其关系如图 3。 图 3 工作曲线 2． 4 精密度试验 2． 4． 1 进样精密度试验 取对照品溶液连续进样 6 次，记录峰面积，分 别为:48． 2，48． 3，48． 2，48． 0，46． 7，47． 7，计算精密 度，平均峰面积为 47． 85(n = 6，RSD =1． 26%)。 2． 4． 2 重复性试验 取本品，照样品溶液制备方法处理，进行含量 测定，重复测定 6 次，峰面积分别为 53． 86，53． 25， 53． 66，53． 45，54． 07，53． 59。平均峰面积为 53． 59 (n = 6，RSD = 0． 62%)。重复性试验表明，本法的 重复性较好。 2． 4． 3 中间精密度试验 在不同时间，由化验室同事照同法操作，用美 国 Waters 600 液相色谱系统进行检测，记录色谱 图，计算 VD 3平均含量，得 VD 3平均含量为 2． 540 ug /g，RSD为 0． 41%。 2． 5 溶液稳定性试验 取 2． 4． 2 项下样品溶液，在 0h、1h、2h、4h、6h、 8h时各进样一次，记录色谱图，得 VD3 峰面积的 RSD为 0． 36%，但杂质峰的总峰面积在 6 小时后 第 3 期 王乔飞:HPLC法测定多维片中痕量维生素 D3 的含量 83 有所增加。 2． 6 回收率 分别制备含 80%，100%，120%维生素 D3 的 样品，测试回收率。结果见表 1。 表 1 样品回收率结果 加入量(IU /g) 峰面积 测得量(IU /g) 回收率(%) 平均值% RSD%(n = 9) 80 38． 6 78． 72 98． 40 80 38． 8 79． 14 98． 93 80 39． 0 78． 52 99． 40 100 52． 6 100． 82 100． 82 100 51． 0 100． 02 100． 02 100 52． 0 100． 08 100． 08 120 56． 2 117． 68 98． 07 120 55． 2 117． 30 97． 75 120 55． 4 117． 44 97． 87 99． 04 1． 11 在配方量的 80% ～ 120%范围内，测定平均回 收率为 99． 04%，RSD为 1． 11%(n = 9) ，说明该测 定方法准确度较好。 3 结论 由于产品中 VD3 含量很低，能将其充分溶解 出来是实验成功的关键，本法采用万能溶剂二甲 亚砜，并进行超声水浴处理，保证其充分溶出。 针对 VD3 遇氧不稳定，准确测量痕量 VD3 含 量，提高其回收率，关键是处理过程中要增加稳定 手段，同时，由于组分复杂，为减少干扰损失，须采 取适当的分离方法。为此，本法采取了以下措施 方法:(1)加入少量抗坏血酸酸抗氧化降解;(2)加 入吡咯烷二硫代氨基甲酸铵(APDC)对杂质离子 进行络合，防干扰;(3)加入氯化钠溶液，使高分子 絮凝，减少吸附损失; (4)采用正已烷对其充分萃 取，起到较好的抗氧化保护作用。 通过实验显示:VD3 在低于 80℃时，对热稳 定。故本法可采用 60℃水浴加热。 由于 VD3 对光照不稳定，因此，在整个操作过 程中均用棕色容器，避光操作。 本法测定复杂组分中的痕量 VD3 含量，操作 简便易行，方法重现性好，回收率基本接近 100%， 结果准确。 参考文献: ［1］庄向平，唐伟虹． 高效液相色谱法测定蝉蛹冻干粉中 VB2、VD3 含量［J］． 宁波高等专科学校学报，2001，13 (3) :98 － 100． ［2］李青． VD3 测定方法的比较［J］．兽药与饲料添加剂， 2007，7(6) :21 － 22． ［3］胡晓文，裴元英． VD3 微囊制备及含量测定［J］． 中国 药房，2008，19(1) :41 － 42． ［4］国家药典委员会．中国药典二部［M］．北京:化学工业 出版社，2005． ［5］张玫，刘新宇． HPLC 测定维多宝泡腾片中 VD3 含量 ［J］．上海医药，1998 ，19(2) :36 － 37． ［6］历士旺，张亚锋，等． HPLC 法测定钙 － D 颗粒剂中 VD3 含量［J］．西北药学杂志，2003，18(1) :3 － 4． (责任编辑:毛善成) 84 淮 阴 工 学 院 学 报 2010 年