液_质联用法测定铁皮石斛和西洋参及制剂中多菌灵残留

液 2质联用法测定铁皮石斛和西洋参及制剂中多菌灵残留 吴永江　朱　炜　程翼宇 3 (浙江大学中药科学与学系 ,杭州 310027) 摘 　要 　用高效液相色谱 2质谱联用法定量检测铁皮石斛、西洋参药材及其制剂中的多菌灵残留。在酸性条 件下以甲醇提取中药材和制剂中的残留多菌灵 ,分析色谱柱为 D iamonsil C18 (4. 6 mm i. d. ×250 mm, 5μm ) , 以 4%四氢呋喃水溶液 2甲醇梯度洗脱 , 采用选择离子监测模式 ,以 m / z 192为检测定量离子。多菌灵出峰时 间在 27 m in左右 ,线性范围为 0. 22～33 ng,相关系数 0. 9993;检出限为 0. 015 mg/L;定量限为 0. 022 mg/L;平均回收率在 95. 6%以上。该方法灵敏、准确、可靠 ,定量范围宽 ,耐用性强 ,可作为中药中多菌灵残留 的可靠检测方法。 关键词 　高效液相色谱 ,质谱 ,多菌灵 ,农药残留 ,铁皮石斛 ,西洋参 　2005204209收稿 ; 2005207219接受 本文系浙江省重大科技项目资助 (No. 021103549) 1　引　　言 近年来 ,植物药在消费者心目中的地位不断提升 ,特别是针对一些慢性病、老年性疾病 ,人们寄希望 于天然药物或非药物治疗 ,这为中药的发展提供了契机。但是 ,由于农药的大量使用 ,致使药材中农药 残留量过高 ,严重影响其安全性和治病功效的发挥 ,给人民身体健康带来隐患 ,阻碍了中药现代化和国 际化。因此 ,对中药中农药残留的检测控制至关重要。 多菌灵 (Carbendazim, N H N NH C O O CH3 )又称苯并咪唑 44号、棉萎灵等 ,是一种高效低毒、广谱、内吸 性杀菌剂 ,是代替铜、汞类杀菌剂的理想叶面喷洒剂和种子处理剂 ,对菌核病、炭疽病、枯萎病等都有防 治效果 ,是中药栽培过程中常用的农药。多菌灵化学性质稳定 ,能通过作物叶片和种子渗入植物体内 ,耐 雨水冲洗 ,残效期长。因此 ,多菌灵在药材中的残留是影响产品质量的重要因素。 国内外对果蔬中的多菌灵残留量检测已有大量报道 ,但对中药材及制剂中多菌灵残留量的分析报 道较少 [ 1, 2 ]。果蔬中多菌灵残留量检测常用薄层扫描法 [ 3 ]、荧光分析法 [ 4 ]、紫外光谱法 [ 5 ]、气相色谱 法 [ 6 ]、胶束电动色谱法 (MEKC) [ 7 ]和伏安法 [ 8 ]等。其中 ,紫外光谱法、薄层扫描法及胶束电动色谱法灵 敏度低 ;荧光分析法操作比较繁琐且易受干扰 ,而气相色谱法需要对样品进行衍生化处理 ,前处理复杂。 一般的高效液相色谱法常用紫外检测器 [ 9 ] ,由于其选择性差 ,灵敏度受到限制 ,不同的样品必须采用不 同的色谱条件 ,且中药样品成分比食品更复杂 ,对检测干扰极大 ,方法的通用性和耐用性不强。为此 ,本 实验采用高选择性、高灵敏度的质谱检测器 ,以名贵药材铁皮石斛、西洋参及其制剂为研究对象 ,建立了检 测多菌灵残留的液相色谱 2质谱联用方法。本方法通用性强 ,可为制订中药中多菌灵残留提供依据。 2　实验部分 2. 1　仪器与试剂 1100型高效液相色谱 2质谱联用仪 (美国 Agilent科技有限公司 ) ,配在线脱气机、四元低压泵、自动 进样器、柱温箱、二极管阵列检测器、电喷雾四级杆质谱检测器 ,仪器控制和数据采集分析使用 ChemSta2 tion工作站 ; DSHZ2300型多用途水浴恒温振荡器 (江苏太仓市实验设备厂 ) ; R2200型旋转蒸发仪 (瑞士 Buchi公司 ) ;飞鸽牌 TGL216G高速台式离心机 (上海安亭科学仪器厂 ) ; METTLER2AE240型电子天平 (梅特勒 2托利多仪器 (上海 )有限公司 )。甲醇 (分析纯 ,用于样品制备 ,浙江临海浙东特种试剂厂 ) ,四 氢呋喃、甲醇 (色谱纯 ,德国 Merck公司 ) ; NaCl、NaOH、石油醚 (沸程 60～90℃)、二氯甲烷 (分析纯 ,杭州 第 34卷 2006年 2月 　　　　　　　　　　　　 分析化学 ( FENX I HUAXUE) 　研究简报 Chinese Journal of Analytical Chem istry 　　　　　　　　　　　　 第 2期 235～238 高晶精细化工有限公司 ) ;无水硫酸钠、HCl (分析纯 ,中国上海试剂总厂 ) ; M illi2Q纯净水 (M illipore公 司 ) ;高纯氮气 (99. 999% ,杭州电气集团气体有限公司 ) ;多菌灵标准品由浙江大学农药与环境毒理研 究所朱国念教授提供 ;铁皮石斛和西洋参药材及其制剂在杭州市场购买。 2. 2　实验方法 2. 2. 1　标准溶液配制 　准确称取标准品 ,用甲醇溶解配成浓度为 110 mg/L的标准储备液 ,储存于冰 箱。使用时用甲醇逐级稀释成浓度为 0. 022～3. 3 mg/L的标准溶液。 2. 2. 2　样品处理 　准确称取粉碎后的药材 5. 0 g于 100 mL具塞三角烧瓶中 ,加入 20 mL甲醇和 5 mL 0. 1 mol/L HCl,搅拌均匀 ,在 25℃的水浴中用振荡器振荡提取 2 h,用布氏漏斗抽滤 ,以少量甲醇清洗残 渣 ,合并滤液于 150 mL圆底烧瓶中 ,在 40℃水浴上浓缩 ,基本除去甲醇。将浓缩液转移至 125 mL分液 漏斗中 ,加入 5mL 0. 1 mol/L 盐酸和 25 mL 10% NaCl溶液 ,混合均匀 ,再加入 20 mL石油醚剧烈振荡。 静置分层后 ,弃去石油醚 ,水相用 2 mol/L NaOH溶液调节 pH至 6. 5～7. 0,用二氯甲烷萃取 3次 ,每次 20 mL。合并二氯甲烷 ,以无水硫酸钠干燥 ,将滤液转移至 150mL圆底烧瓶中 ,在 40℃水浴中减压蒸发 至干 ,最后用甲醇溶解定容至 1 mL。 2. 2. 3　高效液相色谱 2质谱条件 　色谱柱 : D ikma D iamonsil C18 ( 4. 6 mm i. d. ×250 mm , 5μm ) ; 流动 相 :采用 4%四氢呋喃水溶液 (A ) 2甲醇 (B )梯度洗脱 ( 0～30 m in,保持 30% B; 30～31 m in, B浓度从 30%升至 100% ,然后保持 16 m in) ,流速 0. 6 mL /m in,柱温 30℃,检测波长 282 nm ,进样量 10μL。在上 述色谱条件下 ,多菌灵出峰时间约为 27 m in。 质谱检测选择正离子选择离子检测 ( SIM )模式 ,以 m / z 192和 m / z 160为定性检测离子对 , m / z 192 为定量检测离子 ,干燥气为氮气 ,流速 10 L /m in,干燥气温度 350℃,毛细管电压 3500 V,裂解电压 100 V。 3　结果与讨论 3. 1　质谱方法建立 在农残分析中 ,由于所要分析的目标物含量很低 ,基体成分干扰很大 ,需要选择合理的检测方法来 进行分析。实验对药材提取液进行高效液相色谱分析后发现 ,用 DAD检测器在紫外波长 282 nm下进 行检测 ,多菌灵信号被掩盖 ,无法准确定量。而用灵敏度和选择性更高的质谱检测器在选择离子监测模 式下进行检测 ,多菌灵响应明显 (见图 1)。用扫描模式在 m / z 120～220范围扫描 ,总离子流图和相应 的多菌灵质谱图结果示于图 2。质谱中的准分子离子 m / z 192 [M + H ] + 为基峰 , m / z 160为 [M - CH3 O ] + , m / z 214为 [M +Na ] + 。因此 ,实验选取 m / z 192和 m / z 160作为监测离子对进行定性 ,将 m / z 192用于多菌灵的定量测定。 　图 1　紫外检测 ( a)和质谱检测 ( b, c)多菌灵的色谱图 　Fig. 1　Chromatogram s of carbendazim by ultraviolet detection ( a) and mass detection ( b, c) 　a21, b. 多菌灵标准液 ( carbendazim standard solution) : 1. 1 mg/L; a22, c. 样品溶液 ( samp le)。 3. 2　标准曲线绘制 将标准储备液用甲醇稀释成浓度分别为 0. 022、0. 044、0. 11、0. 22、0. 44、0. 88、1. 1、1. 43、1. 76和 313 mg/L的标准溶液。在相同的色谱及质谱条件下 ,测定多菌灵的峰面积。以峰面积对绝对进样量 ( ng)作图 ,得标准曲线 ,线性回归方程为 Y = 5. 0882 ×106 X + 2. 6187 ×106 ,相关系数 r = 0. 9993,该方法 632　　 分 析 化 学 第 34卷 线性范围为 0. 22～33 ng。 图 2　多菌灵标准溶液和样品提取液的总离子色谱 ( a, b)和质谱 ( c, d)图 Fig. 2　The total ion current chromatogram s ( a, b) and mass spectra ( c, d) of carbendazim standard solution and smap le extraction solution a, c. 多菌灵标准液 ( carbendazim standard solution) : 1. 1 mg/L; b, c. 样品提取液 ( samp le extraction solution)。 取空白药材提取液 ,加入一定量的多菌灵标准品 ,以信噪比的 3倍和 10倍来确定方法的检出限和 定量限分别为 0. 015和 0. 022 mg/L (RSD < 5% )。 3. 3　精密度、准确度和重复性 采用同一个药材供试品溶液 ,在相同色谱条件下 ,连续进样 5次 ,测定其峰面积 ,多次测定的峰面积 相对标准偏差为 2. 7% ,说明本方法有较好的精密度。 　　在已知多菌灵含量 ( 0. 06 mg/kg)的药材中准确 加入一定量的多菌灵标准品 ,按同样的操作步骤进行 提取、净化、测定 ,计算回收率 ,结果列于表 1。多菌灵 的平均加样回收率为 95. 6% ～104. 7% ;最大相对标 准偏差为 3. 3%。 取同一批药材样品 5份 ,按同样的方法进行提取、 表 1　多菌灵回收率测定结果 Table 1　Recovery of carbendazim in herbal medicine 加入浓度 (mg/kg) Sp iked concentration 回收率 Recovery ( % ) 相对标准偏差 RSD ( % , n = 3) 0. 066 104. 7 1. 6 0. 22 95. 6 3. 3 0. 58 97. 7 2. 2 　 净化、测定 ,结果样品中多菌灵平均残留为 0. 04mg/kg,相对标准偏差为 5. 6% ,表明方法重复性较好。 3. 4　方法应用 按同样的样品处理方法对 3批铁皮石斛、3批西洋参和 6批铁皮枫斗 (主成分为铁皮石斛和西洋 参 )进行了提取、净化 ,在相同的色谱条件下测定其中多菌灵残留量 ,结果如表 2所示。 表 2　不同批次铁皮石斛、西洋参和铁皮枫斗中多菌灵残留的测定结果 Table 2　The contents of residual carbendazim in D endrobium cand idum W all. ex L indl. , Panax qu inquefolium and Tie2Pi2 Fen2Dou drug 样品 Samp le 样品序号 No. 多菌灵含量 Carbendazim content (mg/kg) 剂型 Dosage form 批号 No. 多菌灵含量 Carbendazim content (mg/kg) 铁皮石斛 D endrobium candidum W all. ex L indl. 1 0. 29 含片 Troche 030805 0. 02 2 0. 09 胶囊 Collocystis 040311 0. 02 3 0. 05 胶囊 Collocystis 040201 0. 01 西洋参 Panax quinquefolium 1 0. 06 颗粒 Granule 041206 0. 03 2 0. 03 颗粒 Granule 040304 0. 01 3 0. 10 颗粒 Granule 040207 0. 02 3. 5　分析条件选择 (1) 多菌灵是一种两性化合物 ,在中性和偏碱性水溶液中溶解度低 ,微溶于丙酮、乙酸乙酯和氯仿 等有机溶剂。实验比较了在酸性条件下 ,甲醇和水提取多菌灵的效果。取空白药材 ,加入多菌灵标准溶 液 ,然后分别用水和甲醇提取 ,同前述方法净化。结果发现 ,甲醇 2盐酸法回收率高 ,而水提法回收率仅 为 22. 7% (见表 3) ,故选择醇提法。在甲醇中加入酸液使多菌灵成盐 ,用石油醚除去脂溶性杂质后调 高 pH,使多菌灵转成原形 ,再用有机溶剂萃取 ,从而纯化、富集多菌灵。本方法简单易行 ,大大缩短了样 品前处理的时间 ; (2) 以甲醇 2水为流动相洗脱时 ,多菌灵峰型宽而且拖尾。经过实验 ,选择了四氢呋喃 作为调节剂 ,使峰型得到改善 ; ( 3)与DAD检测器相比 ,质谱检测器采用 SIM模式后 ,检测灵敏度显著 732第 2期 吴永江等 :液 2质联用法测定铁皮石斛和西洋参及制剂中多菌灵残留 　　 提高 ,目标物在紫外光下无响应 ,但在质谱中有很 强的响应。同时质谱抗干扰强 ,检出限低 ,定量结 果更趋准确和真实 ,方法耐用性更强 ; (4) 通过药 材和制剂中多菌灵含量的比较 ,发现药材中多菌灵 的残留量普遍高于制剂 ,可能是由于在制剂生产过 程中部分多菌灵降解 [ 10 ]。 表 3　水和乙醇提取多菌灵效果比较 Table 3　Comparison of recovery of carbendazim obtained by using methanol and water as extraction solvent 提取溶剂 Extraction solvent 添加量 Added (mg/kg) 测定量 Determ ined (mg/kg) 回收率 Recovery ( % ) 甲醇 2盐酸 Methanol2HCl 0. 22 0. 21 95. 4 水 2盐酸 W ater2HCl 0. 22 0. 05 22. 7 　 References 1　Chen J ianm in (陈建民 ) , Xue J ian (薛 　建 ) , W ang Chunlan (王春兰 ) , L iu Huiling (刘惠灵 ). 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Carbendazim was detected in selected ion monitoring ( SIM ) mode with m / z 192 and m / z 160 for qualitative analysis and m / z 190 for quantitation. L inear p lot was obtained between 0. 22 and 33 ng with linear correlation coefficient of 0. 9993. The lim it of detection (LOD) was 0. 015 mg/L, and the lim it of quantitation (LOQ) was 0. 022 mg/L. The average recoverieswere 95. 6% ～104. 7%. The results indicate that the described method is sensitive, reliable and robust, and it can be app lied for the quantitation of carbendazim in herbal medicinal materials. Keywords　H igh performance liquid chromatography, mass spectrometry, carbendazim, pesticide residue, D end robium cand idum W all. ex L indl. , Panax qu inquefolium (Received 9 Ap ril 2005; accep ted 19 July 2005) 832　　 分 析 化 学 第 34卷