CAT高锰酸钾法

过氧化氢酶（CAT）的测定——高锰酸钾滴定法 植物在逆境下或衰老时，由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积。H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸，蛋白质等生物大分子，并使细胞膜遭受损害，从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除H2O2，是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此，植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。 1、 实验原理 过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。 R(Fe+2)+H2O2==R(Fe+3+OH－)  R(Fe+3OH－)2+H2O2==R(Fe+2)2+2H2O+O2 据此，可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量（反应过量）的H2O2溶液，经酶促反应后，用高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的H2O2 5H2O2+2KMnO4+4H2SO4 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4 即可求出消耗的H2O2的量。 2、 实验仪器 研钵；三角瓶50ml×4；酸式滴定管（10ml）；恒温水浴；容量瓶25ml×1。 3、 实验试剂 （1）10% H2SO4 10ml浓硫酸稀释至100ml （2）0.2mol/L磷酸缓冲液pH7.8 ①0.2mol/L的 NaH2PO4溶液：称取NaH2PO4 2.4 g,加重蒸水至100ml溶解。 ②0.2mol/L的Na2HPO4溶液：称取Na2HPO4 2.84 g,加重蒸水至1000ml溶解。 ③取NaH2PO4 8.5ml，Na2HPO4 91.5ml，混合 （3）0.1mol/L草酸 称取优级纯H2C2O4 ·2H2O 1.2607g，用蒸馏水溶解后，定容至100mL。 （4）0.1mol/L高锰酸钾标准液 称取KMnO4（AR）0.31605g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成100ml，用0.1mol/L草酸溶液标定； （5）0.1mol/L H2O2 市售30% H2O2大约等于17.6mol/L，取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1000ml，用标准0.1mol/ KMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定； 4、 实验步骤 （1） 酶液提取 取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转入容量瓶中，用同一缓冲液定容，4000rpm离心15min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。 （2）取50ml三角瓶4个（两个测定两个对照），测定瓶中加入酶液2.5ml，对照瓶中加入煮死酶液2.5ml，再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计时，于30℃恒温水浴中保温10min，立即加入10% H2SO4 2.5ml。 （3）用0.1mol/L KMnＯ4标准溶液滴定H2O2，至出现粉红色（在30min内不消失）为终点。 4、结果计算 酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示： 酶活(mgH2O2/gFW·min)= 式中 A—对照KMnO4滴定毫升数； B—酶反应后KMnO4滴定毫升数； VT—酶液总量（ml）； V1—反应所用酶液量（ml）; W—样品鲜重（g）； 1.7—1ml 0.1mol/L的KMnO4相当于1.7mg H2O2。 【注意】 所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定。