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葡萄籽提取物原花青素诱导胃癌细胞脱落凋亡

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葡萄籽提取物原花青素诱导胃癌细胞脱落凋亡 Therapeutic effect of pranlukast , a cysteinyl leukotriene receptor antagoist , on focal cerebral ischemia in mice XU Qiu2qin2 , WEI Er2qing1 , YU Yue2ping3 , ZHAN G qi3 , ZHAN G Shi2hong1 , ZHU Chao2yang1 (1. Dept of Pharmacology , School of Medicine , Zhejiang U...
葡萄籽提取物原花青素诱导胃癌细胞脱落凋亡
Therapeutic effect of pranlukast , a cysteinyl leukotriene receptor antagoist , on focal cerebral ischemia in mice XU Qiu2qin2 , WEI Er2qing1 , YU Yue2ping3 , ZHAN G qi3 , ZHAN G Shi2hong1 , ZHU Chao2yang1 (1. Dept of Pharmacology , School of Medicine , Zhejiang University , Hangzhou  310031 , China;2. Dept of Pharmacology , Medical School , Hangzhou Teachers College , Hangzhou  310012 , China;3. Dept of Pharmacology , Zhejiang Medical College , Hangzhou  310053 , China) Abstract : Aim  To determine whether pranlukast (ONO21078) , a cysteinyl leukotriene receptor antag2 onist , possesses therapeutic effect when administered after focal cerebral ischemia in mice. Methods  Per2 sistent focal cerebral ischemia was induced by middle cerebral artery occlusion. Pranlukast and edaravone , a positive control drug , were ip injected 1 , 6 and 24 h after ischemia. The neurological deficits were eval2 uated by neurological scores and inclined plane test 24 and 48 h after the surgery. Forty2eight h later , the brain slices were prepared for measurements of infarct volume and the ratio of ischemic/ non2ischemic hemi2 spheres. Brain sections were cut and examined for neuron densities in different regions of the brain. The effects of pranlukast and edaravone were evaluated by the changes of these variables. Results  Pranlukast (011 and 012 mg·kg - 1) and edaravone (3 and 10 mg ·kg - 1) significantly reduced the neurological deficits , infarct volume ( maximally 8213 %) , ratio of is2 chemic/ non2ischemic hemispheres , and attenuated the reduction of neuron densities in hippocampal CA1 region , cortex and striatum. Conclusion  Pranlukast possesses therapeutic effect on ischemic insults when administered after ischemia as effective as edravone , indicating a therapeutic potential in the treatment of ischemic stroke. Key words : cerebral ischemia ; brain edema ; cysteinyl leukotriene receptor antagonist ; pranlukast { ONO2 1078 , 42oxo282[ p2( 42phenylbutyloxy ) benzoyl2 amino ]222( tet razol252yl )24H212benzopyran hemihy2 drate} ; edaravone ( MCI2186 , 32methyl212phenyl222 pyrazolin252one) 葡萄籽提取物原花青素诱导胃癌细胞脱落凋亡 李  莹1 , 药立波1 , 韩  炯1 , 王立峰1 , 韩月恒1 , 刘新平1 , 林树新2 , 俞  强3 (第四军医大学 1. 生物化学与分子生物学教研室、2. 病理生理学教研室 ,陕西 西安  710032 ; 3. 中国科学院上海药物研究所 ,上海  201203) 中国图书分类号 : R 282171 ;R 28411 ;R 329125 ;R 7351202 文献标识码 : A 文章编号 :1001 - 1978(2004) 07 - 0761 - 04 摘要 : 目的  研究葡萄籽提取物原花青素诱导胃癌细胞脱 落凋亡的作用。方法  采用细胞形态学观察 、Annxin2V 和 PI 细胞染色实验和流式细胞仪检测方法观察原花青素对悬 浮培养的胃癌细胞生长状态和细胞周期的影响以及诱导脱 落凋亡的作用。结果  011 mmol·L - 1原花青素可抑制抗脱 落凋亡的胃癌细胞聚集成团 ,015 mmol·L - 1原花青素可阻 滞悬浮培养的不同胃癌细胞于不同的细胞周期 ,并诱导胃癌 细胞发生脱落凋亡。结论  原花青素可诱导胃癌细胞发生 收稿日期 :2003 - 12 - 31 , 修回日期 :2004 - 02 - 03 基金项目 :国家自然科学基金资助项目 ,No 30170465 ,No 30000067 ; 军队“十五”科研基金重点项目 ,No 01Z080 作者简介 :李 莹 (1968 - ) ,女 ,博士 ,讲师 , Tel :029283374516217 , E2 mail :liying @fmmu. edu. cn ; 俞 强 (1954 - ) ,男 ,博士生导师 ,研究员 ,研究方向 :肿瘤 化学生物学研究 , Tel :021250801790 , Fax :021250800885 , E2mail : qyu @sibs. ac. cn 脱落凋亡。关键词 : 原花青素 ;脱落凋亡 ;胃癌细胞  原花青素 (proanthocyanidins) 简称 PC 或 GSPE( Grape seed proanthocyanidins extract) ,是植物王国中广泛存在的一大类多酚化合物的总称。1961 年德国的 Karl 等从山楂新鲜果实的提取物中首次分离得到原花青素[1 ] ,以后人们又相继在葡萄、山楂、花生、银杏等植物中发现原花青素。近年来的研究显示 ,原花青素不仅可抑制乳腺癌、肺癌、慢性骨髓白血病等多种肿瘤细胞的生长 ,诱导多种肿瘤细胞凋亡[2 ] ,而且可以拮抗化疗药物对正常细胞的毒性作用[3 ] 。这个特性是其它抗肿瘤药物无法比拟的。因此原花青素在抗肿瘤治疗方面有着巨大的潜力。但相关研究非常缺乏 ,迫切需要对其进行系统的研究。本文利用我们前期实验中所获得的具有抗脱落凋亡特性的胃癌细胞株[4 ] ,采用细胞形态学、An2nexin2V 和 PI 细胞染色实验、流式细胞仪检测实验 ·167·中国药理学通报  Chinese Pharm acological B ulletin  2004 J ul ;20 (7) :761~4 观察原花青素对抗脱落凋亡的胃癌细胞生长的影 响 ,为寻找治疗肿瘤及抑制肿瘤转移的天然药物提 供有价值的线索。 1  材料与方法 1 . 1  材料和药品  人胃癌细胞株 B GC823 和 HGC27 购自中科院上海细胞库 ,SGC7901 由西安西 京医院消化内科全军重点实验室惠赠 , RPM I 1640 培养基 : Gibco 公司 ,新生牛血清 :杭州四季青生物 工程公司 , FACS Calibur 流式细胞仪 : B2D 公司 , DMSO :Sigma 公司 ,琼脂粉 :北京白灵克公司 ( Sig2 ma 分装) 。原花青素由西安市天行建生物制品有限 公司提供 ,从葡萄 V itis vi nif era L . 籽中提取 ,纯度 > 95 % ,用 DMSO 配制成 100 mmol·L - 1溶液 ,分 装 , - 20 ℃储存。 1 . 2  细胞培养  细胞采用含体积分数 10 %小牛血 清的 RPM I21640 培养基 ,置于 37 ℃含 5 % CO2 的细 胞培养箱中培养。体积分数 0125 %胰蛋白酶和 0102 % ED TA 消化、传代细胞。 1 . 3  脱落细胞培养模型的建立  参照 Qiang[5 ]的 方法 ,将 2 ml 10 g·L - 1溶于无水乙醇的 poly2HEMA 铺于 55 mm 的 Petri 培养皿中 ,室温干燥 ,重复上述 步骤 1 次。使用前用 1 ×PBS 洗 4 遍 ,紫外线消毒 , 将细胞接种于 55 mm polyHEMA 包被的 petri 培养 皿中。由于 poly2HEMA 为一种阴离子聚合物 ,铺在 平皿底部 ,细胞无法贴壁 ,只能在培养皿中悬浮生 长 ,借此模拟细胞的脱落培养状态。 1 . 4  细胞生长状态的形态学观察  调整单细胞浓 度 015 ×106·L - 1 ,接种于上述制备好的脱落培养皿 内 ,实验组加入原花青素 (011~015 mmol·L - 1) ,对 照组加入相同体积的 DMSO ,作用 12 h 以后 ,倒置 显微镜下观察细胞的形态学改变 ,拍摄 ( ×100) 。 1. 5  Annxin2V和 PI 染色检测细胞凋亡  调整单 细胞浓度 015 ×106·L - 1 ,接种于上述制备好的脱落 培养皿内 ,实验组加入 015 mmol·L - 1的原花青素 , 对照组加入相同体积的 DMSO ,作用 24 h 后收集细 胞 , PI , Annexin2V 双染细胞 ( Annexin2V 是一种 Ca2 +依赖性结合蛋白 ,能与翻转到膜外的 PS 高亲 和力特异性结合) ,流式细胞仪检测凋亡的细胞和死 亡的细胞。 1 . 6  流式细胞仪检测细胞周期和凋亡  调整单细 胞浓度 015 ×106·L - 1 ,接种于 poly2HEMA 包被的 培养皿中 ,同时加入 015 mmol·L - 1的原花青素与细 胞共同孵育 ,对照组加入同体积的 DMSO。培养 24 h 后收集细胞 ,离心1 500 r·min - 1 ×5 min ,吸弃上 清 ,PBS 洗 1 次 ,沉淀细胞后用含小牛血清的 PBS 重悬 ,加入无水乙醇 ,使小牛血清的终浓度为 3 % , 乙醇的终浓度为 70 % ,总体积为 1 ml ,于 115 ml EP 管中置 - 20 ℃固定保存。检测时 ,取 - 20 ℃固定的 细胞离心3 000 r·min - 1 ×1 min ,吸弃上清 ,再用 PBS洗细胞 2 次 ,吸弃上清 ,加入 012 ml RNase A , 37 ℃水浴消化 30 min ,再加入 013 ml PI 置暗处染 色 20 min 后上机检测。用 CELLQuest 软件获取单 个细胞20 000个 ,用 ModFit L T 软件细胞周期 及凋亡峰[6 ] 。 2  结果 2 . 1  原花青素对悬浮培养胃癌细胞形态学的影响  悬浮培养的 SGC7901 和 B GC823 细胞聚集成比 较大的细胞团 ,这种聚集现象是其保持存活的方式 之一[4 ] 。原花青素 (011~015 mmol·L - 1) 作用细胞 后 ,细胞聚集成团的现象受到抑制 ,药物浓度越高 , 作用时间越长 ,抑制现象越明显。但是两种细胞对 药物的敏感性并不相同 ,013 mmol·L - 1的原花青素 作用 B GC823 细胞 12 h 时 ,细胞聚集呈团的现象已 完全受到抑制。而 015 mmol·L - 1原花青素作用于 SGC7901 细胞 12 h 后 ,细胞仍然聚集成团 ,直至作 用 24 h ,细胞才呈现出单个散在的现象 ( Fig 1) 。结 果明 ,原花青素可影响悬浮培养胃癌细胞聚集成 团的性状 ,而且不同的细胞对药物的反应性是不一 致的。 2 . 2  原花青素对悬浮培养胃癌细胞周期的影响及 诱导脱落凋亡的作用  将 015 mmol·L - 1原花青素 分别作用于悬浮培养的 B GC823、SGC7901 和 HGC27 细胞 24 h。流式细胞仪 ( FCM) 分析细胞周 期发现 ,药物对悬浮培养的不同胃癌细胞系的细胞 周期的影响是一致的 ,均使这些细胞阻滞于 G22M 期。同时 ,FCM 还检测到细胞出现了不同程度的凋 亡峰 ,细胞凋亡的比例分别为 3104 %、15152 %、 2 2189 % ( Tab1) 。提示 ,不同类型的细胞对药物的 Tab 1  Proanthocyanidin affected cell cycle of suspended gastric cancer cells and induced anoikis Cell Group G02G1 / % S / % G22M / % Apoptosis / % BGC823 Control 62. 43 24. 76 12. 81 PC 66. 21 16. 74 17. 05 3. 04 SGC7901 Control 68. 7 15. 91 15. 39 0. 7 PC 59. 06 17. 4 23. 54 15. 52 HGC27 Control 70. 04 23. 96 6. 0 0. 94 PC 43. 02 42. 02 14. 96 22. 89   PC :proanthocyanidin ·267· 中国药理学通报  Chinese Pharm acological B ulletin  2004 J ul ;20 (7) Fig 1  Effect of proanthocyanidin on morphologic changing of gastric cancer cells cultured in suspension ( ×100) PC :proanthocyanidin Fig 2  Annexin2V and PI staining assay detected anoikis of proanthocyanidin on gastric cancer cells PC :proanthocyanidin 敏感性是不一致的 ,细胞对药物的敏感性依次为 : HGC27、SGC7901、B GC823。   将上述原花青素作用的细胞用 Annexin2V 和 PI 染色后 ,FCM 分析细胞凋亡 [第 1 象限代表细胞 收集过程中出现的损伤细胞 (An - PI + ) ,第 2 象限 代表晚期凋亡细胞和坏死细胞 (An + PI + ) ,第 3 象 限代表正常细胞 (An - PI - ) ,第 4 象限代表早期凋 亡细胞 (An + PI - ) ]。结果表明 ,与对照组相比 ,原 花青素组出现了较多凋亡和死亡的细胞 , 其中 HGC27 细胞组凋亡和死亡细胞的比例多于其它两 株细胞 ( Fig 2) 。实验结果同 FCM 检测的结果。 3  讨论 肿瘤细胞的抗脱落凋亡特性是肿瘤发生转移的 基本要素之一[7 ] 。脱落凋亡为我们深入研究细胞 存活、死亡和肿瘤转移提供了一个很好的研究模型。 原花青素一般存在于果实的皮及植物的木实部 ,其 主要作用是保护植物中易氧化的成分 ,是迄今为止 所发现的最强有效的自由基清除剂之一[8 ,9 ] 。因此 大部分研究都集中于原花青素的抗氧化活性方面。 近年的研究显示原花青素不仅可以抑制乳腺瘤、肺 癌、前列腺癌等多种肿瘤的生长 ,诱导肿瘤细胞凋 亡 ,而且可以拮抗化疗药物对正常细胞的毒性作 用[3 ] 。因此有可能成为目前最有希望的低毒、高效 的抗肿瘤药物。但是 ,原花青素抗肿瘤作用方面的 ·367·中国药理学通报  Chinese Pharm acological B ulletin  2004 J ul ;20 (7) 研究报道还非常有限 ,需要对其进行系统而广泛的 研究。本实验以我们前期实验中所筛选到的 3 株胃 癌细胞为研究对象[4 ] ,观察了原花青素对悬浮培养 胃癌细胞生长的影响。 具有抗脱落凋亡特性的 3 株胃癌细胞悬浮培养 时 ,聚集成团[4 ] 。这种现象可能是细胞避免凋亡 , 保持存活的基础。其可能的机制是 ,肿瘤细胞脱落 以后 ,细胞表面的粘附分子表达水平升高 ,有助于这 些细胞粘附在一起 ,通过细胞与细胞之间的相互作 用来激发存活信号 ,从而继续生存。原花青素作用 于细胞后 ,细胞聚集成团的现象受到抑制 ,作用时间 越长 ,药物浓度越高 ,抑制现象越明显。提示 ,原花 青素可能影响了与细胞粘附相关的信号分子的改 变 ,导致细胞表面粘附分子的表达水平下降 ,抑制了 细胞相互聚集。这亦可能是原花青素抑制细胞增 殖 ,诱导细胞脱落凋亡的机制之一。形态学观察还 发现 ,不同细胞对药物的反应性是不一致的 ,原花青 素抑制 SGC7901 细胞聚集成团的作用比 B GC823 细胞较弱。我们的流式细胞仪检测、PI 和 Annexin2 V 细胞染色实验结果都证实 ,原花青素可使这些悬 浮培养的胃癌细胞阻滞于 G22M 期 ,同时诱导它们 发生不同程度的脱落凋亡。从药物诱导细胞凋亡的 比例来看 ,细胞对药物的敏感性是不同的 ,依次为 HGC27、SGC7901、B GC823。此结果似乎与形态学 观察的结果有所矛盾。我们进行细胞凋亡检测时 , 检测的是药物作用细胞 24 h 时细胞凋亡的比例 ,此 时 3 种细胞均已成为单个散在的状态 ,所以从时间 点来看前后实验的结果并不矛盾。另外 ,我们推测 , 虽然从形态上来看 ,SGC7901 细胞在原花青素存在 的早期维持着聚集状态 ,并不表明这部分细胞不是 凋亡的细胞 ,这有待于进一步实验的证明。我们的 实验结果表明 ,原花青素可诱导抗脱落凋亡的胃癌 细胞发生脱落凋亡 ,而且不同的胃癌细胞对药物的 敏感性是不同的 ,那么药物引起的不同类型肿瘤细 胞的信号转导途径和信号网络的反应方式必将也不 相同。其确切的作用机制有待于我们进一步深入的 研究。 参考文献 : [ 1 ]  Fine AM. Oligomeric proanthocyanidin complexes : History , structure , and phytopharmaceutical applications [ J ] . A ltern Med Rev , 2000 ,5 (2) :144 - 51. [2 ]  Mitsunaga T. Anti2caries activity of bark proanthocyanidins[J ] . Basic L if e Sci , 1999 ,66 :555 - 73. [3 ]  Bagchi D , Bagchi M , Stohs S ,Ray SD et al . Cellular protection with proanthocyanidins derived from grape seeds[J ] . A nn N Y Acad Sci , 2002 ,957 :260 - 70. [ 4 ]  李 莹 ,韩 炯 ,王立峰 ,林树新 et al . 人胃癌细胞株抗脱落凋 亡特性的分析[J ] . 第四军医大学学报 , 2003 ,24 (6) :485 - 8. [ 5 ]  Wei L , Yang Y , Yu Q. Tyrosine kinase2dependent , phos2 phatidylinositol 3′2kinase ,and mitogen2activated protein kinase2 independent signaling pathways prevent lung adenocarcinoma cells from anoikis[J ] . Cancer Res , 2001 ,61 (6) :2439 - 44. [ 6 ]  董 波 ,陈肖华 ,张 浩 ,张军权 et al . 一种改进的用于测定细 胞周期的细胞制备方法[J ] . 军事医学科学院院刊 ,2002 ;26 (2) :124 - 6. [7 ]  Grossmann J . Molecular mechanisms of “detachment2induced apoptosis2Anoikis”[J ] . A poptosis , 2002 ;7 :247 - 60. [ 8 ]  Bagchi D , Garg A , Krohn RL ,Bagchi M et al . Oxygen free radi2 cal scavenging abilities of vitamins C and E , and a grape seed proanthocyanidin extract i n vit ro[J ] . Res Com m un Mol Pathol Pharmacol , 1997 ,93 :179 - 89. [9 ]  凌智群 ,张晓辉 ,谢笔钧 et al . 原花青素的药理学研究进展 [J ] . 中国药理学通报 ,2002 ,18 (1) :9 - 12. Induced anoikis of gastric cancer cell l ines by proanhocyanidin derived from seed of Vitis vinifera L. L I Ying1 , YAO Li2bo1 ,HAN Jiong1 ,WAN G Li2feng1 ,HAN Yue2heng1 ,L IU Xin2ping1 ,L IU Shu2xin2 , YU Qiang3 (1. Dept of Biochemist ry and Molecular Biology , 2. Dept of Pathophysiology , the Fourth Military Medical U niversity , Xi ä an 710032 , China ;3 . S hanghai Institute of M ateria Medica , Chinese Academy of Sciences , S hanghai  201203 , China) Abstract : Aim  To investigate the inductive effect of proanthocyanidin derived from seed of V itis vi nif era L . on anoikis of gastric cancer cells. Methods  Cell morphology observation , Annxin2V and PI staining assay and flow cytometry ( FCM) assay were used to study the inductive effect of proanthocyanidin on cell growth condition , cell cycle changes and anoikis rate of the gastric cancer cells cultured in suspension. Re2 sults Proanthocyanidin (011 mmol·L - 1) could in2 hibite the gastric cancer cells resistant to anoikis f romforming cluster. Proanthocyanidin (015 mmol·L - 1 )could arrest the different suspended gastric cancercells in different cell cycles and induce the gastric can2cer cells to anoikis. Conclusion  Resveratrol can in2duce anoikis of gastric cancer cells.Key words : proanthocyanidin ; anoikis ; gast ric canercells ·467· 中国药理学通报  Chinese Pharm acological B ulletin  2004 J ul ;20 (7)
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