原花青素对宫颈癌Hela细胞livin和caspase_3基因表达的影响

第17卷第19期 中国现代医学杂志 Vol.17No.19 2007年10月 ChinaJournalofModernMedicine Oct.2007 原花青素(proanthocyanidins,PC)是植物王国 中广泛存在的一类多酚化合物的总称。近年研究 明[1,2],原花青素不仅可以抑制乳腺癌、肺癌、慢性骨 髓白血病等多种肿瘤细胞的生长,诱导多种肿瘤细 胞的凋亡,而且可以拮抗化疗药物对正常细胞的毒 性作用。但其分子机制尚不完全清楚,本研究用原 花青素处理宫颈癌Hela细胞,体外观察原花青素对 宫颈癌 Hela细胞 livin和 caspase-3基因表达的影 文章编号: 1005-8982(2007)19-2349-05 ·论著· 原花青素对宫颈癌Hela细胞livin和 caspase-3基因表达的影响 黄雪坤,李光仪 (广东省佛山市第一人民医院 妇产科,广东 佛山 528000) 摘要:目的 探讨原花青素对宫颈癌Hela细胞livin和caspase-3基因表达的影响。方法 用不同终浓度原 花青素(0～600μmol/L)处理宫颈癌 Hela细胞 24h,采用 MTT比色法分析细胞存活率,Hoechst33258-PI荧 光染色法检测凋亡,RT-PCR 检测 livin、caspase-3mRNA表达变化,Westernblot检测 livin、caspase-3P17 蛋白表达的变化,用比色法检测 caspase-3相对活性。结果 随着原花青剂量的增加,宫颈癌 Hela细胞存活率 降低,凋亡明显增加,livinmRNA表达和蛋白表达水平逐渐减少,而 caspase-3逐渐增加;随原花青素浓度从 75~600μmol/L增加,caspase-3相对活性增加(P<0.05),在 600μmol/L原花青素时 caspase-3相对活性达最 大值。结论 原花青素可剂量依赖性的减少 livinmRNA和蛋白表达;原花青素可剂量依赖性的增加 cas- pase-3mRNA、蛋白表达和增加caspase-3活性。 关键词: 原花青素;Hela细胞;livin;caspase-3 中图分类号: R737.33 文献标识码: A Effectsofproanthocyanidinsontheexpressionofgene livinandcaspase-3incervicalcancerhelacell HUANGXue-kun,LIGuang-yi (DepartmentofObstetricsandGynecology,theFirstPeople′sHospital ofFoshan,Foshan,Guangdong528000,P.R.China) Abstract:【Objective】Tostudytheeffectofproanthocyanidins(PC)ontheexpressionoflivinandcaspase-3in cervicalcancerHelacell.【Methods】AftertheHelacellsweretreatedwithPC(0～600μmol/L)for24h,Cellsur- vivalratewasevaluatedbyMTTassay,andapoptosiswasanalyzedbyHoechst-PIfluorescencestaining.mRNAex- pressionsoflivinandcaspase-3weredetectedbyRT-PCR.ProteinexpressionofLivinandcaspase-3P17were detectedbyWesternblot,andcaspase-3relativeactivitieswasdeterminedbycolormetricassay.【Results】PCina dose-dependentmannerreducedthesurvivalrateandincreasedtheapoptosisofHelacell,decreasedthemRNA andproteinexpressionoflivin,increasedthemRNAandproteinexpressionofcaspase-3.TheactivityofCaspase-3 increasedwith75～600μmol/LPC(P<0.05),anditreachedthepeakin600μmol/LPCgroup.【Conclusions】The mRNAandproteinexpressionoflivingeneweredecreasedbyPCinadose-dependentmanner.PCincreasedthe mRNAandproteinexpressionofcaspase-3gene,andalsoincreasedthecaspase-3relativeactivitiesinadose-de- pendentmanner. Keywords:proanthocyanidins;helacell;livin;caspase-3 收稿日期:2007-03-20 2349· · 附表 不同剂量的原花青素对宫颈癌Hela细胞存活 率的影响 注:1)与正常对照组比较,P<0.05; 2)与正常对照组比较,P<0.01 响,并进一步探讨其作用机制,为宫颈癌早期治疗提 供新的依据。现如下: 1 材料与方法 1.1 材料来源 人宫颈癌 Hela细胞购自美国 americantype culturecollection(ATCC);原花青素购自 Fluka公 司(纯度 >95%,溶于 DMSO,平均分子量为 2000); DMSO及Hoechst33258均购自Sigma公司;RT-PCR 试剂盒购自Qiagen公司;兔抗人多克隆Livin抗体、 兔抗人多克隆Caspase-3P17抗体和β-actin鼠抗 人单克隆抗体为美国SantaCruz公司产品;M-MLV 逆转录酶、TaqDNA聚合酶、Oligod (t)、RNAsin为 Promage公司产品;引物为上海生物工程公司合成。 1.2 方法 1.2.1 细胞培养与处理 将 Hela细胞以 1×106/L 接种于96孔培养板,培养24h,加不同浓度 (0～ 600μmol/L)的PC,继续培养24h。收集细胞进行实 验。每次实验均分对照组(溶剂对照)和实验组,每组 至少重复3次。 1.2.2 MTT法检测细胞存活率 96孔培养板每孔 加入MTT(5g/L)20μL,继续培养4h,加入MTT裂 解液(20%SDS+50%DMF)100μL,孵箱中孵育8h,用 酶标仪检测各组细胞的 570nm和 450nm吸光值, 以 A570nm/A450nm比值代表细胞活力,并以对照 组细胞生长率为 100%,其余各组按:生长率 =(各 组吸光值/对照组吸光值)×100%与之比较,作表。 1.2.3 细胞荧光染色观察 在培养 24h的 Hela细 胞里加入不同浓度 PC(0~600μmol/L),每个浓度 作4个平行孔,继续培养24h。每孔加Hochest33258 至终浓度为 5mg/L和 PI至终浓度为 50mg/L,孵育 30min,于荧光显微镜下观察并拍照。 1.2.4 流式细胞术检测 在培养 24h的 Hela细胞 里加入不同浓度PC(0～600μmol/L),继续培养24 h。收集细胞,用PBS洗3次,用 70%乙醇溶液固定 过夜,用 PBS洗 1次,每孔加 PI至终浓度为 50 mg/L,37℃避光孵育30min,过滤后上机检测。每组 重复3次取平均值。 1.2.5 RT-PCR检测 livin和 caspase-3基因 mR- NA的表达 按Trizol试剂盒说明提取总 RNA。引 物设计参照文献或用PrimerPremier5.0设计。liv- inα [3]:(上游)5'-TGGGACCCTGGGAAGAACCG- 3',(下游)5'-CCGCACGGCACAAAGACGATG-3', 扩增产物 275bp;livinβ[3]:(上游)5'-TGGGACCCT GGGAAGAACCG-3',(下游)5'-CCGCACGGCACA AAGACGATG-3',扩增产物 221bp;GAPDH[3]:(上 游 )5'-CTCAGACACCATGGGGAAGGTGA-3',( 下 游)5'-ATACTGTTGTCGGAGTTCAGTA-3',扩增产 物480bp,为内参照。caspase-3:(上游)5'-TATC- CTGAGATGGGTTTA-3',(下游)5'-TTGTCGGCAT- ACTGTTTC-3'(扩增产物 566bp);β-actin:(上 游 )5'-GTGGACATCCGCAAAGAC-3',( 下 游 ) 5'-AAAGGGTGTAACGCAACTAA-3',扩增产物 302 bp,为内参照。按逆转录反应按试剂盒操作。 RT-PCR产物用2%琼脂糖凝胶电泳分离检测。 1.2.6 Westernblot检测 livin和 caspase-3蛋白的 表达 按常规提取总蛋白样品。Westernblot操作按 试剂盒说明。 1.2.7 caspase-3活性测定 在培养 24h的 Hela细 胞里加入不同浓度 PC(0~600μmol/L),继续培养 24h。收集细胞,参照文献[4],采用发光底物比色法。 测定其 405nm波长下的吸光度值 (A405),用 A405nm来代表其相对活性。重复3次试验。 1.3 统计学方法 结果以(x±s)表示。采用SPSS10.0forWindows 统计软件包进行单因素方差分析。 2 结果 2.1 原花青素诱导宫颈癌Hela细胞凋亡 2.1.1 原花青素降低宫颈癌 Hela细胞存活率 不 同浓度原花青素处理宫颈癌Hela细胞24h,MTT法 检测结果显示随原花青素浓度从 75~600μmol/L增 大,细胞存活率降低,表明原花青素对细胞的抑制作 用随浓度的增大而增强,见附表。当原花青素浓度 为 300μmol/L时,宫颈癌 Hela细胞的存活率为 组别 PC(μmol/L) Hela细胞存活率(%) 正常对照组 0 100.00±2.02 溶剂对照组(DMSO) 0 99.30±1.54 给药组1 37.5 98.03±4.27 给药组2 75 90.32±3.331) 给药组3 150 76.73±6.102) 给药组4 300 53.40±2.152) 给药组5 600 34.13±11.082) 中国现代医学杂志 第17卷 2350· · A:对照组;B:150μmol/LPC;C:300μmol/LPC;D:600μmol/LPC 图2 流式细胞术检测的凋亡率结果 A:对照组;B:150μmol/LPC;C:300μmol/LPC;D:600μmol/LPCM. 100bpmarker 图3 RT-PCR分析不同剂量原花青素对宫颈癌Hela细胞 livin基因mRNA表达的影响 A:对照组;B:150μmol/LPC;C:300μmol/LPC;D:600μmol/LPC;M: 100bpmarker 图4 RT-PCR分析不同剂量原花青素对宫颈癌Hela细胞 caspase-3基因mRNA表达的影响 注:A:对照组;B:150μmol/LPC;C:300μmol/LPC;D:600μmol/L PC 图5 Westernblot分析不同剂量原花青素对宫颈癌Hela 细胞Livin蛋白的影响 2.3 原花青素剂量依赖性减少 Livin蛋白的表达, 增加caspase-3蛋白的表达 分别用 0、150、300和 600μmol/L原花青素处 理细胞,Livin蛋白条带逐渐变细,caspase-3活性片 段条带逐渐变粗,说明随着原花青素浓度的增加,细 A B C D Livinα(33kD) Liviaβ(30kD) β-Actin(43kD) 第19期 黄雪坤,等:原花青素对宫颈癌Hela细胞livin和caspase-3基因表达的影响 53.40%,与对照组比较差异有显著性意义 (P< 0.01)。 2.1.2 荧光染色结果 用不同浓度原花青素处理 24h的宫颈癌Hela细胞,荧光显微镜下观察到高亮 蓝色的典型凋亡小体,其细胞核明显固缩、凝聚和断 裂,且随原花青素剂量的增加,出现凋亡小体的细胞 明显增多,见图1B、1C、1D。而对照组宫颈癌Hela细 胞的细胞核染色均匀,如图1A。 2.1.3 流式细胞术结果 分别用终浓度为 0、75、 150、300和 600μmol/L原花青素处理宫颈癌 Hela 细胞,可看见随着原花青素浓度的增加亚二倍体峰 (Ap峰)所占比例增加,见图2,对照组宫颈癌Hela 细胞的自然凋亡百分率为(3.4±0.3)%,见图 2A, 150~600μmol/L原花青素处理组凋亡率分别为 (10.1±2.5)%、(18.6±3.4)%和(28.2±4.6)%,见 图 2B、2C、2D,处理组与相应对照组分别比较差异 有非常显著性意义(P<0.01)。 2.2 原花青素剂量依赖性减少livin基因mRNA的 表达,增加caspase-3基因mRNA的表达 分别用终浓度为 0、150、300和 600μmol/L原 花青素处理宫颈癌 Hela细胞 24h,livinmRNA条 带逐渐变细,caspase-3mRNA条带逐渐变粗,说明 随着原花青素浓度的增加,livinmRNA表达减少, 见图3,caspase-3mRNA表达增多,见图4。 A:对照组 B:150μmol/LPC C:300μmol/LPC D:600μmol/LPC 图1 荧光染色分析凋亡宫颈癌Hela细胞核形态改变 ×400 M A B C D 500bp 480bp 275bp 221bp M A B C D 500bp 566bp 302bp 2351· · 胞livin蛋白表达减少,见图5,caspase-3活性片段 表达增加,见图6。 注:A:对照组;B:150μmol/LPC;C:300μmol/LPC;D:600μmol/L PC 图6 Westernblot分析不同剂量原花青素对宫颈癌Hela 细胞caspase-3P17的影响 2.4 caspase-3相对活性的测定结果 分别用0、37.5、75、150、300和600μmol/L原花 青素处理宫颈癌 Hela细胞,从 75μmol/L原花青素 起,caspase-3相对活性明显增加 (P<0.05),600 μmol/L时酶活性达最大值,为对照的 2.39倍,见图 7。 注:与对照比较:*P<0.05,**P<0.01。 图7 不同浓度原花青素对宫颈癌Hela细胞Caspase-3 酶相对活性的影响 3 讨论 原花青素由不同数量的儿茶素或表儿茶素结合 而成。目前为止,鉴定了316种原花青素,是至今为 止所发现的最有效的自由基清除剂之一。因此,大 部分研究集中在其抗氧化活性方面。但近年研究证 实,PC对多种癌细胞如乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、 皮肤癌细胞等都具有的抑制作用。HUYNH[5]等用PC 处理的人体乳腺癌细胞,发现与未处理的同种细胞 相比,凋亡明显增加;而在正常人乳腺细胞样品中, PC并不明显改变凋亡细胞的数量。AGARWAL等[6] 用PC处理的DU145细胞与溶剂组比较,细胞生长 明显受到抑制,呈现出剂量和时间依赖性,同时 PC 以剂量依赖性的方式诱导 G1期的细胞静止。这些 研究结果说明PC有很强的抗癌发生的作用,这可 能与其调节有丝分裂、细胞周期、诱导G1期的细胞 静止、抑制细胞生长及凋亡等作用有关。本研究结 果表明,用不同剂量原花青素处理宫颈癌Hela细胞 24h,原花青素以剂量依赖性的方式抑制细胞生长, 300μmol/L原花青素时,其存活率为 53.4%(P< 0.01),见表1。荧光染色结果可见高亮蓝色的典型 凋亡小体,其细胞核明显固缩、凝聚和断裂,见图1。 流式细胞仪检测,150μmol/L原花青素时,在 G1期 前可见清晰的亚二倍体峰,如图 2B,表明原花青素 可诱导宫颈癌Hela细胞凋亡。 livin是最近发现抗凋亡作用的基因,该基因存 在2个剪接变异体,分别命名为 livinα 和livinβ, 统称为livin[7]。Livin蛋白N端仅包含1个BIR结构, C端含1个RING环指结构,其与细胞凋亡的关系表 现在抗死亡受体介导的细胞凋亡作用。KASOF等[8] 将livin基因转染Hela细胞,结果显示转染细胞可有 效阻断由Bax,RIP,RIP3及DR6(deathreceptor6) 诱导的细胞凋亡,Livin抗细胞凋亡的作用甚至略强 于survivin。livin抗细胞凋亡主要机制在于抑制cas- pase途径[7,8]:livin可与介导细胞凋亡的下游效应cas- pase,即激活形式的caspase-3和 caspase-7结合,并 抑制其活性。livin还可与未加工的或断裂形式的 caspase-9结合,可抑制由细胞色素 C及 dATP等诱 导的caspase-9激活作用。本研究结果表明,原花青 素可剂量依赖性的减少宫颈癌 Hela细胞 livinα 和 livinβ的表达水平,在转录及翻译水平均得到证实, 见图3、5。提示原花青素可调控livinα和livinβ基 因表达,介导宫颈癌Hela细胞凋亡。 caspase-3是 caspase家族中的最重要的成员。 现在发现至少有10种caspase参与细胞凋亡的信号 传导。在细胞凋亡过程中,caspase的作用可包括两 个方面[9]:一方面,作为启动物,它接受凋亡信号,发 生细胞内的级联反应;二方面,作为效应物,水解各 种成分,使细胞解体,形成凋亡小体。caspase以无活 性的酶原形式存在细胞内,需被水解加工后才能成 为P17与P12两个有活性的片段。caspase-3是细胞 凋亡过程中的主要效应因子,大多数触发细胞凋亡 的因素,最终均需要通过 caspase-3介导的信号传 递途径导致细胞凋亡[10]。有研究表明,caspase-3在 宫颈癌组织中的阳性表达率和上皮内瘤样病变中的 阳性表达率均明显低于在正常宫颈组织中的阳性表 达率。本研究结果表明,随着原花青素剂量的增加, caspase-3mRNA表达逐渐增多,caspase-3活性片 段条带逐渐变粗,其含量增加,见图 4、6,酶活性逐 Caspasc-3(17kD) β-Actin(43kD) A B C D 0.25 0.20 0.15 0.10 0.05 0 ca sp as e- 3 re la tiv e ac tiv ty ( A 40 5 ) 0 37.5 75 150 300 600 concentrationofPC(μmol/L) 中国现代医学杂志 第17卷 2352· · 达,VIP可以上调 AQP8蛋白的表达,然而本实验仅 研究了 24h以内 AQP8的表达情况,VIP对其的长 期调节是未知的,还有待于更深入的研究。 参 考 文 献: [1]MAT,VERKMANAS.Aquaporinwaterchannelsingastroin- 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(曾文军 编辑) (上接第2348页) 渐增高,如图 7。600μmol/L原花青素处理的细胞, 其酶活性为对照的2.39倍。提示原花青素可剂量依 赖性调控caspase-3基因表达,诱导宫颈癌Hela细 胞凋亡。 子宫颈癌是全球妇女恶性肿瘤中仅次于乳腺癌 的第2个常见恶性肿瘤。本次体外实验结果表明, 原花青素可能通过迅速下调抗凋亡蛋白livin表达, 激活 caspase-3,导致蛋白酶级联切割放大,最终引 起宫颈癌Hela细胞凋亡。这为原花青素诱导宫颈癌 Hela细胞的凋亡机制提供了一定的分子生物学依 据。 参 考 文 献: [1]MITSUNAGAT.Anti-cariesactivityofbarkproanthocyanidins[J]. BasicLifeSci,1999,66:555-573. [2]BAGCHID,BAGCHIM,STOHSS,etal.Cellularprotection withproanthocyanidinsderivedfromgrapeseeds[J].AnnNYA- cadSci,2002,957:260-270. [3]SUNJG,LIAORX,CHENZT,etal.ExpressionofLivin,anov- elinhibitorofapoptosisprotein family member,in tissuesof non-smallcelllungcancer[J].ChongqingMedicalJournal,2004, 33:982-984.Chinese [4]GRUBS,PERSSOHNE,TROMMERWE,etal.Mechanismsof cyclosporineA-inducedapoptosisinrathepatocyteprimarycul- tures[J].ToxicolApplPharmacol,2000,163:209-220. [5]HUYNHTH,TEELRW.Selectiveinductionofapoptosisinhu- manmammarycancercell[MCF-7]bypycnogenol[J].Anticancer Res,2000,20:2417-2420. 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