葡萄籽原花青素二聚体的提取分离与结构鉴定

葡萄籽原花青素二聚体的提取分离与结构鉴定 徐德平, 孙　芸, 谷文英, 丁霄霖Ξ (江南大学食品学院, 江苏 无锡　214036) 　　20 世纪 80 年代以来, 人们对原花青素的单聚 体、二聚体、三聚体、四聚体和高聚体进行生化、药理 活性的研究, 发现其具有抗氧化、抗致突变、抗心血 管疾病等活性, 其中二聚体和三聚体活性最强[1 ]。葡 萄籽原花青素单体主要由 (+ ) 2儿茶素 (ca tech in)、 ( - ) 2表儿茶素 (ep ica tech in)、(- ) 2表儿茶素没食子 酸酯组成, 各单体通过 4→6 或 4→8 键相连, 形成二 聚、三聚、四聚等多聚体。葡萄籽中的原花青素由于 聚合度、单体及连接键的不同, 各聚合度可能的异构 体数目为 2n- 1×3n (n= 聚合度) , 单二聚体就有 18 种可能的异构体, 结构非常复杂, 各低聚体及各同聚 异构体之间极性相近, 由于原花青素异构体数目繁 多, 一般液相色谱仪也很难分开, 能得到的异构体也 仅仅有有限的几种, 使葡萄籽中原花青素的、分 离十分困难[2～ 4 ]。目前国外对葡萄籽原花青素的研 究非常多, 国内的研究报道也有很多, 但主要集中在 生理活性研究和生产开发方面, 对低聚体的化学组 成和结构研究很少。本研究利用R P2H PL C 分析了 葡萄籽粗提物中的二聚体原花青素的构成, 并采用 反相色谱柱分离得到 2 个二聚体化合物, 并对其结 构进行了鉴定。 1　材料与方法 111　材料: 葡萄籽由中国长城葡萄酒公司提供; H PL C 用甲醇为色谱纯, 甲醇、石油醚 (30～ 60 ℃)、 醋酸乙酯等皆为A R 级 (上海化学试剂采购供应 站) ; GF 254硅胶板 (山东烟台芝罘化工厂) ; 色谱柱: 聚酰胺 (60 目, 浙江台州化工厂) , Sephadex L H 220、 HW 240 为进口分装。 112　仪器: W aters P la tfo rm ZM D 4000 液质联用 仪; B rucker AV 500 核磁共振仪 (中国科学院上海 有机化学研究所)。 113　方法 11311　色谱条件: 色谱柱 Zo rbax XDB (250 mm × 416 mm , 5 Λm ) ; 流动相A : 1% 甲酸, B: 80% 甲醇+ 1% 甲酸。梯度洗脱: 0～ 5 m in 100% A ; 5～ 50 m in 100% A →20%A + 80% B。质量流量 1 mL öm in, 柱 温 30 ℃, 进样量 20 ΛL。检测分流比 5∶1, 280 nm 检测。质谱条件: 负离子扫描 ( ES I- , m öz 260～ 1 500) , 毛细管电压 412 kV , 锥孔电压 50 V , 光电倍 增器电压 650 V , 离子源温度 120 ℃, 脱溶剂气温度 300 ℃, 结果用M assL ynx 软件分析[5, 6 ]。 11312　葡萄籽提取物: 葡萄籽 5 kg 粉碎后室温用 甲醇 (料液比 1∶7) 提取 3 次, 提取液滤过, 除去溶 剂, 石油醚脱脂, 将脱脂后的物质用 3 倍体积的醋酸 乙酯萃取, 反复多次, 直到醋酸乙酯相无色为止, 合 并醋酸乙酯相, 蒸干, 蒸发温度≤40 ℃, 得醋酸乙酯 提取物 (用于分离单聚体化合物)。将醋酸乙酯提取 后的剩余物蒸干, 取少量固体物溶于甲醇, 过 0145Λm 膜后用 H PL C2M S 分析, 余下用于二聚体化合 物的分离。 11313　二聚体化合物的分离: 将醋酸乙酯提取后的 剩余物蒸干用适量水溶解, 上聚酰胺柱 (600 mm × 60 mm ) , 先用去离子水洗脱, 再用甲醇梯度洗脱 (20%、40%、60% ) , 分步收集。40% 甲醇溶液洗脱得 流份A , 60% 甲醇溶液洗脱得流份B , 将流份A 部分 浓缩至一定体积后上 Sephedex L H 220 柱 ( 500 mm ×35 mm ) , 先用去离子水洗脱, 再用甲醇梯度洗 脱, 15 mL 收集一管, 可得到C、D、E、F 4 个组分, 每 组分主要含 1 个化合物, 将 C、D 每个组分反复上 HW 240 柱 (500 mm ×35 mm ) , 并用甲醇梯度洗脱, 可得 2 个纯化合物, 分别为É、Ê。 11314　二聚体化合物的结构鉴定: 将所得É、Ê 两 个化合物用 DM SO 2d6 溶解后, 进行 1H 2NM R 和 13C2NM R等分析。 2　结果与分析 211　反相 H PL C 分离结果: 从葡萄籽提取液选择 离子色谱图 (图 1) 及各峰的 ES I 质谱信息可以较清 楚地检出 6 种非酯二聚体 (m öz 为 577) , 出峰时间 分别为 20134、21118、21178、23158、25197、26145 m in, 和 2 种二聚体没食子酸酯 (m öz 为 729)出峰时 间分别为 27177、28149 m in。可见从本研究所用的 葡萄籽中可检出的二聚体数量为 8 种,L C2M S 只能 ·081· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 36 卷第 2 期 2005 年 2 月 Ξ 收稿日期: 2004205225 分辨相对分子质量, 不能进一步给出结构信息。 图 1　葡萄籽中原花青素二聚体 HPLC 色谱图 F ig11　HPLC chromatogram of procyan id in dimer from grape seed 212　鉴定 化合物É : 浅黄色粉末, 极易溶于水、乙醇、甲醇 等溶剂, 不溶于丙酮、醋酸乙酯等小极性溶剂。 1H 2NM R (400 M H z, DM SO 2d6) : 上部 (ca tech in) ∆: 2199 (1H , H 24) , 4105 (1H ,m , H 23) , 4173 (1H , d, J = 718 H z, H 22) , 5185 (1H , d, J = 211 H z, H 26) , 6112 (1H , d, J = 211 H z, H 28) , 6174 (1H , d, J = 718 H z, H 26′) , 6188 (1H , d, J = 716 H z, H 25′) , 7103 (1H , d, J = 217 H z, H 22′)。下部 (ep ica tech in) ∆: 2164 (1H , H 24Β) , 2189 (1H , H 24Α) , 4143 (1H , m , H 23) , 4163 (1H , s, H 22) , 6102 (1H , d, J = 213 H z, H 26) , 6117 (1H , d, J = 213 H z, H 28) , 6184 ( 2H , H 26′, H 25′) , 6198 ( 1H , s, H 22′)。从 1H 2NM R 数据可见, 4173, 4163 处各有一个 H , 4173 为双峰, 是 catech in 上的 H 22, 4163 为单峰, 应是 ep ica tech in 上的 H 22, ep i2 catech in 上的 H 22 一般在 418 左右, 而此处小于 418, 表明 ep ica tech in、ep ica tech in 上的 H 22 受到其 他基团的影响而向高场移动。在 ∆小于 3 的高场区 只有 3 个H , 说明H 24 成键。 二聚体是由 (+ ) 2儿茶素 (ca tech in)、(- ) 2表儿 茶素 (ep ica tech in)、(- ) 2表儿茶素没食子酸酯通过 4→6 或 4→8 键相连形成, 化合物É 没有没食子酸 酯的信号, 排除了 (- ) 2表儿茶素没食子酸酯成键的 可能。catech in、ep ica tech in 的 C24 一般在 26～ 29, 从13C2NM R光谱中可见 ∆3712 处有一碳信号, 这一 碳信号表明 C24 位成键; C23 的碳信号 catech in 一 般在 68 左右, ep ica tech in 的C23 的信号在 67 左右, 从13C2NM R 光谱中可见 ∆6713, 7218 处各有一碳信 号, 而 68 左右未见碳信号, 表明 ep ica tech in 的 C24 未成键, 从D EPT 谱中也可证实, ca tech in 的C24 成 键使C23 向低场移动到 7218, 可以判断 ep ica tech in 在下, ca tech in 在上。ep ica tech in 的 C26 的信号大于 96, C28 的信号小于 96, 从 13C2NM R 光谱中可见∆9612, 9619 处各有一碳信号, 而 9518 处仅有一碳 信号, ∆9612, 9619 处的碳信号分别为 catech in、ep i2 catech in 的 C26, 9518 处的碳信号应为 catech in 的 C28, 表明 ep ica tech in 的C28 成键并向低场移动。通 过以上分析并参照文献得化合物É 为 catech in 4→8 ep ica tech in [7～ 9 ]。 13C2NM R (400 M H z, DM SO 2d6 ) : 上部 (ca tech in) C2423712, C2327218, C2228212, C282 9518, C2629612, C24a210117, C25′211610, C22′2 11612, C26′212017, C21′213113, C23′214411, C24′2 14417, C28a215312, C25215419, C27215515; 下 部 ( ep ica tech in ) C2422714, C2326713, C2228017, C282 10913, C2629619, C24a210012, C25′211513, C22′2 11615, C26′2120115, C21′2131117, C23′214319, C24′2 14412, C28a215314, C25215513, C27215711。化合物É 结构见图 2。 图 2　化合物É 的结构 F ig12　Structure of compound É 化合物Ê : 浅褐色粉末, 极易溶于水、乙醇、甲醇 等溶液, 不溶于丙酮、醋酸乙酯等小极性溶剂。 1H 2NM R (400 M H z, DM SO 2d6) : 上部 (ca tech in) ∆: 2185 (1H , H 24) , 4101 (1H ,m , H 23) , 4157 (1H , d, J = 719 H z, H 22) , 5194 (1H , d, J = 212 H z, H 26) , 6118 (1H , d, J = 212 H z, H 28) , 6175 (1H , d, J = 812 H z, H 26′) , 6182 (1H , d, J = 812 H z, H 25′) , 7102 (1H , d, J = 217 H z, H 22′)。下部 (ep ica tech in) ∆: 2163 (1H , H 24Β) , 2187 (1H , H 24Α) , 5134 (1H , m , H 23) , 5104 ( 1H , s, H 22) , 5178 ( 1H , d, J = 2 H z, H 26) , 6107 ( 1H , d, J = 2 H z, H 28) , 6179 (1H , d, J = 712 H z, H 2 5′) , 6184 (1H , d, J = 712 H z, H 26′) , 6192 (1H , s, H 2 2′) , 6186 (2H , s, 2″, 6″)。从1H 2NM R数据可见, ∆4157 处有一个H , 为双峰, 是 catech in 上的H 22, ∆5104 为 单峰, 应是 ep ica tech in 上的 H 22, ep ica tech in 上的 H 22 一般在 418 左右, 而此处大于 418, 表明 ep ica t2 ech in 上的 H 22 受到其他基团的影响而向低场移 动。∆5134 处的H 可能为 ep ica tech in 上的H 23 受其 他基团影响而向低场移动。∆6186 处有 2 个单峰H , 提示有没食子酸酯的存在, 在 ∆小于 3 的高场区只 ·181·中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 36 卷第 2 期 2005 年 2 月 有 3 个H , 说明H 24 成键。 在化合物Ê 的13C2NM R 谱中, ∆16617 碳信号为 羰基碳, 提示有没食子酸酯的可能, ∆14312～ 15713 有 13 个连氧碳, 而 catech in、ep ica tech in 各有 5 个连氧 碳, 另 3 个连氧碳一定为没食子酸的, 根据文献资料介 绍, 二聚体中只有 (- ) 2表儿茶素没食子酸酯的存在。 没食子酸在 3 位与(- ) 2表儿茶素连接, C23 向低场移 动, 由于空间位阻, (- ) 2表儿茶素 4 位成键可能较小, 由于 ∆9611, 9619 处各有一碳信号, 而 9513 处仅有一 碳信号, 说明C28 位参与成键。通过以上分析并参照文 献确定化合物Ê 为 catech in4 → 8ep ica tech in gal2 la te [7～ 9 ]。13C2NM R (400M H z,DM SO 2d6) : 上部(ca t2 ech in ) C2423711, C2327612, C2228212, C2829513, C2 629611, C24a210116, C25′211513, C22′211513, C26′2 12011, C21′213119, C23′214417, C24′214418, C28a2 15516, C25215518, C27215713; 下部 (ep ica tech in gal2 la te) C2422618, C2327016, C2227717, C2829611, C262 9619, C24a210011, C25′211514, C22′211514, C26′2 11816, C21′213017, C23′214516, C24′214517, C28a2 15612, C252157, C27215612。 羰 基 16617, C21″2 12418, C22″210611, C23″215311, C24″214312, C25″2 15113, C26″210919。化合物Ê 结构见图 3。 图 3　化合物Ê 结构 F ig13　Structure of compound Ê 3　讨论 苹果、可可原花青素其聚合体一般由表儿茶素 通过C42C8 键聚合而成, 各聚合体的异构体数目一 般只有 2～ 3 个, 很容易分离分析。而葡萄籽原花青 素则复杂得多, 二聚体理论上有 18 种 (其中 6 种为 没食子酸酯形式) , 三聚体理论上有 108 种, 要获得 如此多的相应对照品非常困难。本研究采用反相液 相色谱结合电喷雾质谱分析葡萄籽粗提物中二聚体 的组成, 可以为葡萄籽原花青素的原料选择及质量 评价提供一种方法, 在没有相应对照品的情况下借 助质谱在线检测比较、分析不同来源原花青素低聚 体的相对含量。 References: [ 1 ]　Guo I, Xu L 1 P rocyan idin: A p lan t m edicine w ith m any uses [J ]1 W orld P hy tom ed (国外医药·植物药分册) , 1996, 11 (5) : 19622041 [ 2 ]　P rieu r C, R igaud J , Cheyn ier V 1 O ligom eric and po lym eric p rocyan idins from grape seeds [J ]1 P hy tochem istry , 1994, 36: 78127841 [ 3 ]　O szm iansk i J , Sap is J C1 F ractionation and iden tification of som e low mo lecu lar w eigh t grape seed pheno lics [J ]1 J A g ric F ood Chem , 1989, 37 (5) : 1293212971 [ 4 ]　W aterhouse A L , P rice S F, M cCo rd J D 1 Reversed2phase h igh2perfo rm ance liqu id ch rom atography m ethods fo r analysis of w ine po lypheno ls [J ]1 M etho E nzym ol, 1998, 299: 1132 1211 [ 5 ]　Jawo rsk iA W , L ee C Y1 F ractionation and H PL C determ ina2 t ion of grape pheno lics [J ]1 J A g ric F ood Chem , 1986, 34: 96629701 [ 6 ]　de F reitas V A P, Glo ries Y, Bourgeo is G1 Characterisation of o ligom eric and po lym eric p rocyan idins from grape seeds by liqu id secondary ion m ass spectrom etry [J ]1 P hy tochem istry , 1998, 49 (5) : 1435214411 [ 7 ]　de B ruyne T , P ieters L A C, V lietinck A J1 U nam biguous assignm ents fo r tree dim eric p roan thocyan idin pheno ls from 2D NM R [J ]1 P hy tochem istry , 1996, 43 (1) : 26522721 [ 8 ]　Fulek i T , R icardo da Silva J M 1 Catech in and p rocyan idin compo sit ion of seeds from grape cu ltivars grow n in O ntario [J ]1 J A g ric F ood Chem , 1997, 45: 1156211601 [ 9 ]　Yeap F L , Yinrong L 1 Iso lation and iden tification of p ro2 cyan idins in app le pom ace [J ]1 F ood Chem , 1999, 64 (4) : 51125181 过山蕨的化学成分研究 (É ) 李　宁1, 吴永军2, 李　铣13 , 王金辉1, 王　楠1Ξ (11 沈阳药科大学, 辽宁 沈阳　110016; 21 辽宁桓仁药业股份有限公司, 辽宁 桓仁　117201) 　　过山蕨又名马蹬草、还阳草、过桥草, 为铁角蕨 科植物过山蕨Cam p tosorus sibiricus R up r1 的全草, ·281· 中草药　Ch inese T radit ional and H erbal D rugs　第 36 卷第 2 期 2005 年 2 月 Ξ 收稿日期: 2004205218 作者简介: 李　宁 (1979- ) , 女, 河北保定人, 在读研究生, 2001 年毕业于沈阳药科大学中药学院, 同年考取本校天然药物化学专业研 究生。3 通讯作者　T el: (024) 23902286　E2m ail: lix ian@m ail1sy1ln1cn1