K_Ras基因突变检测与大肠癌治疗的研究进展

K-Ras基因突变检测与大肠癌治疗的研究进展 毕 � 媛综述 � 王 � 捷审校 � � 作者单位: 510010广州军区总医院医学实验科 � � 关键词: K-ras基因;基因突变; 大肠癌;西妥昔单抗 � � 中图分类号: R735. 3+ 4� � 文献标识码: B � � 文章编号: 1001-5930( 2010) 04-0435-03 � � 表皮生长因子 ( epiderm a l grow th factor, EGF )在许多正常组 织细胞的增殖和分化过程中起重要的作用, 表皮生长因子受体 ( ep iderm a l g row th factor recepto r, EGFR )家族存在于大多数实体 瘤细胞表面, 与肿瘤增殖、血管生成、转移和抗凋亡有关。西妥 昔单抗 ( Ce tux im ab)是 1种靶向作用于 EGFR的单克隆抗体, 通 过与 EGFR细胞外位点结合, 竞争性地抑制其与自然配体的结 合, 从而阻断下游信号转导, 起到抑制肿瘤生长及转移的作用。 此外, 西妥昔单抗还能诱发抗体依赖细胞介导的细胞毒作用 ( an tibody dependen t cel-lm ediated cytotox icity, ADCC ), 进一步杀 死肿瘤细胞。在转移性大肠癌中 ,西妥昔单抗的治疗效果优于 最好的支持疗法 [ 1]。目前, 大量临床研究证实, 西妥昔单抗联 合伊立替康在伊立替康治疗失败的转移性结直肠癌 ( m etastastic co lorec tal cancer, mCRC )患者中具有确切的疗效。但该治疗药 物并不是对所有患者均有效, 其治疗效果与肿瘤患者体内 K-ras 基因突变状态有关。 1� K-Ras基因及其突变 1. 1� K-Ras基因 � � 人类大多数细胞中都表达 Ras基因, 其家族有 3个成员, 分 别为 H-ras、N-ras、K-ras。其中 K-ras基因位于人类基因 12号染 色体 P12. 1, 含有 4个编码外显子和 1个 5�端非编码外显子, 共 同编码含 189个氨基酸组成的 RAS蛋白, 分子量为 21 kDa, 又 称 p21蛋白 [2]。Ras蛋白为膜结合型的 GTP /GDP结合蛋白, 通 过 GTP和 GDP的相互转化可以有节制的调节 p21对信号系统 的开启和关闭, 完成生长分化信号传入细胞内的过程。Ras蛋 白能够激活丝氨酸 (苏氨酸 )激酶 RAF, 丝裂原激活蛋白激酶 ERK1和 ERK2, 磷脂酰肌醇-3激酶,以及促进细胞增殖的多种 蛋白质 [ 3]。Ras基因尤其是 K-Ras基因与一些肿瘤的发病机理 和预后相关, 主要有大肠癌、肺癌和胰腺癌等。 1. 2� K-Ras基因突变 � � K-Ras基因最常见的激活方式为点突变, 突变位点几乎都 集中在 1号外显子的第 12-13位密码子上, 也有密码子 61的突 变。Rouleau等检测了 70例结直肠癌 ( CRC)的突变情况, 发现 35%的病例在密码子 12-13有突变, 同时发现 2例病例在密码 子 19有突变 ( c. 57G> C, p. Leu19Phe),在密码子 12-13没有突 变 [ 4]。在大型的人群研究中 ( n = 737 CRC), 37% 的突变位于 密码子 12-13, 6. 6%位于密码子 8, 9, 10, 15, 16, 19, 20, 和 25 [5]。 K-Ras基因的突变使 Ras蛋白一直处于激活状态, 影响信号转 导途径,使信号传递通道处于持续激活状态,刺激细胞不断地生 长或分化,最终导致细胞的恶性转化。K-Ras突变以结肠癌、胰 腺癌和肺癌的发生率比较高, 在胰腺癌组织高达 90% 以上 [6] , 在肺癌中则以肺腺癌为主, 突变率为 20% ~ 30% [ 7]。结直肠癌 K-Ras基因突变率在各个国家和地区并不相同, 在欧美为 30% ~ 68% [ 8, 9], 台湾、新加坡和日本为 17% ~ 28% [10], 在中国为 14% ~ 43. 8% [11, 12]。 2� K-Ras突变基因的检测 2. 1� 检测标本 � � K-ras基因突变的检测只能在肿瘤组织中进行,需要患者提 供石蜡包埋组织块或已切好的蜡屑或几张挂胶白片或新鲜的手 术、活检标本, 外周血不能反应真实情况。结直肠癌原发灶及转 移灶 K-ras基因状态基本相同, 所以可以选择原发灶也可以选 择转移灶的标本进行测定。 2. 2� 检测方法 � � 目前国内外检测 K-ras基因的方法较多, 如 PCR产物直接 测序法、高分辨率溶解曲线法 ( HRM )、单链构象多态性方 法 ( SSCP)、聚合酶链反应-限制性片段长度多态性方法、焦磷酸 测序方法、变性高效液相色谱法等,每种方法都各有优缺点。 � � Thom as Jefferson Un ive rs ity[ 13]在 300例结直肠癌肿瘤样本 基础上, 对 DNA测序法和 DxS K it法和 HRM法检测结果进行了 比较。该研究表明,虽然 3种方法都检测到大部分的基因突变, DNA测序法灵敏度最低 ( 85. 7% ), HRM 法 ( 96. 9% )灵敏度最 好且节约成本,是代替 DxS K it法测量 K-ras基因突变的良好方 法。Wh iteha ll等 [14]在 2组分别为 80例冷冻样本和 74例 FFPE ( form a lin- fixed paraffin- embedded)样本基础上对 6种方法 ( SS- CP法, 焦磷酸测序法, HRM 法, 双脱氧测序法 ( d ideoxy sequen- c ing ), T IB法 ( the comm ercia lly ava ilab le T IB M o lb io l)和 DxS kit 法 )的检测结果进行了对比。结果表明, 焦磷酸测序法和双脱 氧测序法灵敏性最差。HRM 方法检测到 FFPE样本和冷冻样 本的所有基因突变,是 6种方法中比较灵敏的方法。 � � HRM法是近年来在传统突变检测方法的基础上发展起来 的用于突变扫描和基因分型的新技术, 应用溶解曲线对 PCR扩 增产物进行鉴别的新方法。该检测方法不受突变碱基位点与类 型的局限,无需序列特异性探针 [ 15] , 在 PCR结束后直接运行高 分辨率熔解,即可完成对样品基因型的分析。这种方法操作简 便、快速, 使用成本低,结果准确, 已广泛应用于基因突变的检测 和筛查 [ 16, 17] ,有望成为 K-Ras基因突变检测的常规方法。 3� K-ras对治疗及预后的意义 �435�实用癌症杂志 2010年 7月第 25卷第 4期 � Th e Practical Jou rnal of Can cer, July 2010, V ol 25, No. 4 3. 1� 对抗 EGFR药物选择和疗效的意义 � � 尽管抗肿瘤药物在不断研发中, 肿瘤药物的耐药性仍是临 床用药的难题。根据 K-ras基因的突变状态合理选择抗肿瘤药 物能够提高药物疗效。近年来研究表明, EGFR信号通路在 85%的肿瘤过表达, 因此成为开发药物研发的新靶点。抗 EG- FR抗体帕尼单抗 ( Panitumum ab)和西妥昔单抗, 有希望成为结 直肠癌的二线治疗药物,并与奥沙利铂和伊立替康联合用于一 线治疗。大量研究表明, K- ras基因突变可以用来预测靶向药 物-抗 EGFR抗体等的治疗效果。 � � Am ado等对 463例转移性结直肠癌患者接受帕尼单抗治疗 ( 231例 )和最好支持疗法 ( Best supportive care, BSC, 232例 )对 比研究发现 [ 18] : K- ras基因的突变率为 43% ,帕尼单抗在野生型 K-ras基因患者治疗中有效, 突变型 K-ras基因患者接受帕尼单 抗治疗无效。 L i�v re等对 89例转移性结肠癌患者的 K-ras突变 情况进行分析 [ 19] ,发现 K-ras突变率为 27% , K-ras基因突变与 西妥昔单抗的耐药相关, K-Ras突变者生存率较低 [ 15]。 113例 依立替康治疗无效的转移性结肠癌患者接受西妥昔单抗治 疗 [ 20] ,并检测 K-ras基因突变情况, 结果显示: K- ras基因突变率 为 40. 7% ( 46例 ), K- ras基因的状态对西妥昔单抗治疗效果有 影响, 在 K-ras基因野生型患者中,西妥昔单抗和依立替康联合 治疗具有明显效果, 并且对早期的放射治疗有反应。 540例转 移性大肠癌患者接受 FOLFIR I联合西妥昔单抗治疗,并与 FOL- FIR I单独治疗进行对照比较, 结果表明, K- ras基因突变率为 35. 6% , K- ras野生型患者中, FOLF IR I联合西妥昔单抗治疗客 观有效率 ( over all response rate)显著优于 FOLFIR I单独治疗 (P = 0. 0025), K- ras野生型患者能够从西妥昔单抗联合 FOLFIR I 的一线化疗中获益,而 K-ras突变型患者不能获益。 � � 上述研究表明, K-ras基因状态是大肠癌患者选择治疗方案 和预测 EGFR单克隆抗体疗效的 1个重要指标。在治疗转移性 大肠癌时, K- ras基因是否有突变应当作为是否在依立替康、 FOLFIR I[ 21]或 FOLFOX [ 22]等方案基础上联合应用西妥昔单抗 或帕尼单抗等 EGFR单克隆抗体的筛选标准。 �美国国立综合 癌症网络 ( NCCN )结肠癌临床实践指南� 2009版指出,选用靶向 治疗 (西妥昔单抗等 )前推荐检测患者的 K-Ras基因突变状况。 3. 2� 对常规化疗预后的意义 � � 大多数结肠癌或者肺癌患者使用常规的化学治疗。 5-氟尿 嘧啶 ( 5- fluo rourac il)为嘧啶类的氟化物, 属于抗代谢抗肿瘤药, 对增殖性细胞各项均有杀伤性作用, 在大肠癌的化疗中被广泛 应用, 一些研究表明, K-Ras基因突变状态可以预测 5-氟尿嘧啶 的治疗效果。 � � K lam pfer等采用含有诱导性 K-ras基因的肠黏膜上皮细胞 研究致癌 Ras基因的表达对 5-氟尿嘧啶治疗中细胞凋亡的影 响 [ 23]。结果表明: R as基因突变增强 5-氟尿嘧啶诱导的细胞凋 亡。Ahnen等在 66例 �期和 163例 �期结肠癌患者中随机接 受左旋咪唑辅助药剂或 5-氟尿嘧啶联合左旋咪唑治疗 ,研究 K- ras基因突变或 p53的表达是否独立影响结肠癌患者生存率或 辅助治疗疗效 [ 24]。研究发现: K- ras基因突变率为 41% ,野生型 K-ras基因和无 p53基因表达的第 �期结肠癌患者从 5-氟尿嘧 啶和左旋咪唑辅助联合治疗中受益, 而突变型 K-ras基因患者 或 p53基因过表达患者不能从治疗中获益。 � � M arkow itz等对 37例接受 5-氟尿嘧啶治疗的结肠癌患者进 行调查 [ 25], 结果显示其治疗反应和总生存率在 K-ras突变型患 者和野生型患者一致, 即结直肠癌中 K-ras基因的突变不能预 测患者的化疗反应和生存率。因此, K-ras基因突变能否预测常 规化疗的预后效果,目前还有争议,需要进一步的研究。 � � 综上所述, K- ras基因突变状态是结直肠癌选择治疗方案和 预测抗 EGFR抗体等的疗效的重要指标, 同时也说明肿瘤分子 标记物的检测在选择治疗方案中具有非常重要的意义和作用。 K-ras基因突变的检测有助于实现肿瘤治疗的个体化, 不仅可以 提高药物疗效,减轻患者病痛, 而且能够减少患者经济负担, 减 轻国家医疗支出。但是值得注意的是, K- ras基因状态是抗 EG- FR药物治疗选择的重要指标, 但不是唯一指标。肿瘤是多基因 改变、多种因素导致的, 还有很多因素影响药物的疗效, 因此需 结合临床检测结果进行综合判断。 参考文献 [ 1] � Van C utsem E, PeetersM, S iena S, et a.l Open-lab el ph ase� trial of pan itum um ab p lus b est support ive care com pared w ith b est support ive care alon e in pat ien tsw ith ch emotherapy-refractorym etastatic colorec- tal cancer� J�. 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