脂肪干细胞的研究及应用进展

[基金项目 ] � 国际科技合作项目 2008DFA30590, 广州 (暨南 ) - 香港细胞工程联合项目 [作者简介 ] � 彭鑫磊 ( 1985- ) ,男,硕士研究生, 主要从事基因工 程药物学方面研究。 * 通讯联系人, E- m ai:l tw angy@f jnu. edu. cn �综述 脂肪干细胞的研究及应用进展 彭鑫磊 1, 王蕊 1,周向荣 2,刘秋英 1,王一飞 1* ( 1. 暨南大学生物医药研究开发基地,广州 � 510632; 2. 亚太干细胞科研中心有限公司, 香港 ) [关键词 ] � 干细胞; 脂肪干细胞;美容 [中图分类号 ] � Q343. 6� � � � [文献标识码 ] � A� � � � [文章编号 ] � 1004- 8685( 2010) 12- 3547- 03 � � 脂肪组织是人类身体内用脂肪形式作储存能源的松散结 缔组织, 主要由脂肪细胞所组成。脂肪细胞的脂肪质含有脂 肪滴, 可以被分类为单胞性脂肪细胞及多胞性脂肪细胞两种。 2001年, Zuk等 [ 1]通过脂肪抽吸术, 在吸出的人体脂肪悬液中 第一次分离得了多向分化的干细胞, 并发现它能够分化为脂 肪、骨、软骨、肌肉、血管内皮、肝、胰、神经等细胞系类型, 具有 易获得、易扩增、不易衰老等特点。这由脂肪组织中分离出的 成纤维细胞 , 与骨髓间充质干细胞 ( bone m arrow m esenchym a l stem ce lls, BMSCs)形态类似, 称为 ADSCs ( ad ipose- der ived stem cells, ADSCs)。脂肪组织与骨髓一样在发育过程中都来 自于胚胎中胚层, 并且都含有支持成熟组织的基质成分。也 许是因为来源相同, ADSC s与 BMSC s具有许多相似的生物学 性质, U garte[ 2]等利用从同一人中提取的两种细胞加以对比, 发现它们在细胞形态、生长动力学、细胞衰老性、面标志、多 向分化潜能以及外源基因的导入效率等方面没有明显区别。 但相比较而言, ADSC s具有以下优点: 1. 取材方便, 对供区影 响小, 并发症少; 2. 分离培养简单, 容易获得, 增值能力强, 细 胞移植不需在体外长期培养扩增; 3. 来源相对充足; 4. 在诱导 因子作用下具有定向分化能力; 5. 组织相容性好, 能适应体内 环境, 保持良好的生物学特性且不引起免疫排斥反应等。脂 肪组织是人体内含量十分丰富的组织。随着肥胖症患者的增 多, 人类脂肪开始 !富余∀,并渐成为累赘, 利用脂肪抽提术提 取脂肪分离干细胞, 作为组织工程的种子细胞来源,进行临床 治疗和美容健身, 具有重大的价值, 因此, ADSCs正在成为干 细胞新的研究热点。本文就脂肪干细胞近年来的研究进展及 应用作一综述。 1� 人类脂肪来源干细胞 ( hADSCs)的获取 � � 目前最常用的分离方法是利用脂肪抽吸术 [1] , 将得到的 脂肪组织, 用 D - H ank#s液反复冲洗, 剪碎。用预温的 0. 1% ∃型胶原酶 37% , 消化 1 h。 100目筛网过滤除去未消化的组 织。将滤出液置入离心管中, 1000 r /m in, 室温离心 10 m in,弃 上清。用 D- H ank#s液重悬洗涤, 反复 2~ 3次,以除去∃型胶 原酶,离心, 弃去上清, 并用移液管反复吹打, 使之成为单细胞 悬液, 计数,以 1~ 2 & 106 /m l的接种密度接种于 DMEM _LG+ 10% FBS培养液中,置 37% , 5% CO2的饱和湿热培养箱培养。 接下来 2天,每天换液一次, 并用 PBS轻轻洗涤, 弃去组织块 和未贴壁的细胞, 以后每 3天换液一次。当细胞达 80% ~ 90%融合时, 0. 25%胰酶 (含 0. 02%的 EDTA )常规消化, 进行 传代。 Brian [3]等报道, 1 g脂肪组织约可分离得到 5000个 CFU - F( co lony- form ing un it- fibrob last, CFU - F ), 利用脂肪抽吸 术, 每 200 m l脂肪组织可得到 1 & 106个 ADSCs。它们对培养 基中胎牛血清的来源和质量没有严格要求, 并且直至培养 13 ~ 15代仍可保持稳定的倍增率, 其中衰老和死亡细胞所占的 比例也很少 [1]。 T raktuev等 [4]报道发现 ADSCs在脂肪组织的血管周围比 较集中, 同时可以分泌多种细胞因子,保持了其在结构与功能 上的稳定。利用组织块消化及贴壁法从脂肪抽吸物中分离得 到的 ADSCs, 同时也混杂有其他的细胞, 如血管平滑肌细胞、 血管内皮细胞、血细胞、淋巴细胞、巨噬细胞和其他成纤维细 胞等, 然而经过分离培养后, 贴附在培养皿底部、形似成纤维 细胞且经多代培养不易衰老的细胞, 即 ADSCs。 ADSCs的获 取量和分化能力不仅受供者年龄的影响 , 而且取材部位与手 术方式的不同也有所区别。供体者的年龄是影响 ADSCs增生 能力的一大因素, 供者的年龄越小, 细胞的增生能力越强, 反 之, 则越差;来源于不同部位的 ADSCs凋亡倾向也不同, 如腹 部的 ADSCs不容易凋亡 [ 5]; 利用脂肪抽吸术得到的 ADSCs不 会影响其活性, 只是吸管的粗细会影响脂肪颗粒的大小, 进而 影响分离的难易程度, 但有超声辅助的抽脂术获取的 ADSCs 增殖能力会有所降低 [ 6]。 脂肪组织在人体中大量存在,容易获取, 失去后对被采集 者的影响较小, 并且真空负压抽脂术是目前整形外科一项成 熟的技术, 因此相对于其他干细胞, ADSC s的获取相对较易, 从而也大大提升了其应用的潜力。 2� hADSCs的基本特征 2. 1� hADSCs的形态特征 从成人脂肪组织中分离得到的 ADSCs在原代培养早期, 可以观察到两类细胞并存: 一种呈梭形, 分散生长; 另一种呈 多角形,紧密生长。经过传代,多角形细胞逐渐减少, 传至第 3 代时, 基本消失,视野中都为梭形细胞, 并且胞浆和核仁都很 3547中国卫生检验杂志 2010年 12月第 20卷第 12期 � Ch in ese Jou rn al ofH ealth Laboratory Techno logy, Dec 2010; Vo l20� N o 12 丰富, 呈平行排列或漩涡样生长 [7] , 这与骨髓间充质干细胞的 原代培养很相似。 2. 2� hADSC s的细胞生长周期 在传代培养中, ADSC s平均倍增时间为 60 h, 并表现低水 平衰老, P1代时细胞没有出现衰老现象, 10代后少于 5%细胞 出现衰老, 15代时仍低于 15% [ 1], 这表明脂肪干细胞易于体 外培养, 可通过体外扩增获得大量具有分化能力的干细胞。 细胞周期分析显示: G0 /G1期的细胞约占 69% , S期细胞占 24% , G2 /M 期细胞占 8% [ 7]。 2. 3� hADSC s的细胞表面抗原 脂肪来源的 hADSCs流式细胞表型分析 [ 2, 7]: CD9、CD10、 CD13、CD29、CD44、CD49d、CD49e、CD54、CD55、CD59、CD90、 CD105、CD117、CD146、CD166、STRO- 1表达为阳性, 而 CD31、 CD34、CD45、CD106均为阴性。其中 CD105、CD166、STRO - 1 被认为是具有多向分化潜能细胞的标志分子。这与骨髓来源 的 MSC基本相同, 但 Zuk[ 1]发现 CD49d脂肪 M SC s表达而骨 髓 MSCs不表达, CD106刚好相反, 即骨髓 MSCs表达, 而脂肪 M SCs不表达。有报道称 ADSCs的免疫标志会随着传代而发 生变化, 如间充质细胞表面标志 CD13、CD16、CD29、CD44、 CD63、CD73、CD90等起初表达低, 但随不断传代, 其表达会显 著增加 [ 8]。 2. 4� hADSC s的多向分化潜能 脂肪组织是人体内含量十分丰富的组织。随着肥胖症患 者的增多, 人类脂肪开始 !富余∀, 并渐成为累赘。 Zuk[ 1]等人 将脂肪抽吸术后的脂肪细胞 ( processed lipoasp ira te ce l,l PLA ) 收集、消化后进行体外培养研究,分离得到脂肪干细胞。除了 能分化为脂肪细胞外 ,经过不同的细胞因子的诱导,脂肪干细 胞能够向骨、软骨、骨骼肌、神经等非脂肪组织转化,且其诱导 因子与骨髓 MSC有着较大的相似性。将 ADSCs置于含有去 羟基 VD和磷酸甘油的培养基中, 能分化为骨组织细胞; 向成 软骨细胞的分化需要有 TGF- �; 氢化可的松则参与了向骨骼 肌的分化; 向成神经组织的分化中, � -巯基乙醇起着重要的 作用, 并且分化后的细胞还表达了神经系统特异性物质, 如神 经特异性核蛋白 ( NeuN )、神经特异性烯醇酶 ( NSE)、神经丝蛋 白 ( NF- 70)、神经胶质酸性原纤维蛋白 ( GFAP)等。 2. 5� hADSC s的其他特征 ADSCs也具有分泌功能, 会分泌促进血管生成的相关因 子, 如血管内皮生长因子、粒细胞集落刺激因子、间质源性因 子 - 1�、肝细胞生长因子等,以促进血管再生 [9]。ADSC s也能 通过旁分泌作用于成纤维细胞,促进其分泌∃、∋型胶原和纤 连蛋白, 促进皮肤表皮细胞的成熟, 以利于创面愈合和瘢痕缩 小 [ 14] ,这些功能是其在美容方面具有应用价值的基础。AD� SCs分泌的前列腺素 E2具有抑制细胞免疫反应,降底 ADSCs 免疫原性的功能 [ 10]。 3� 脂肪干细胞的应用前景 3. 1� 脂肪干细胞的疾病治疗作用 干细胞要想用于临床疾病治疗要考虑以下几项因素: 1. 细胞移植的方法; 2. 是否有免疫排斥问; 3. 移植后细胞是否 具有靶向性, 分布于受损部位; 4. 移植后细胞是否具有体内多 系分化的能力, 如何定向分化; 5. 移植后的疗效评价; 6. 移植 后干细胞存活情况, 发挥作用的机制,能否长期发挥作用等。 Puissant B 等 [ 11] , 报道脂肪来源的 M SC 同骨髓来源的 M SC一样有免疫力调节作用, 异体移植亦不会引起排斥反应 的发生。R io rdan NH等 [ 12] ,报道脂肪来源的干细胞可以有助 于多发性硬化症, 对于多发性硬化症的治疗提供了一条新的 途径。 Schenke- Lay land K等 [13], 报道脂肪干细胞有助心肌梗 塞后的心脏功能恢复。K im WS等 [14]报道 ,脂肪来源的间充质 干细胞对伤口的修复功能与其分泌物有关, 其通过旁分泌作 用于成纤维细胞, 促进其分泌∃、∋型胶原和纤连蛋白, 促进 皮肤表皮细胞的成熟以利于创面愈合和瘢痕缩小。 3. 2� 脂肪干细胞在美容健身上的应用 关于干细胞修复受损伤组织的机制, 主要有以下几点: 1、 干细胞可以分泌细胞因子和生长因子 (如: 肝细胞生长因子, 血管内皮生长因子 ) ,以旁分泌的形式促进局部损伤组织的修 复; 2、干细胞可以提供抗氧化剂, 清除氧自由基, 热休克蛋白 到局部, 使得局部毒性物质清除, 促进修复; 3、干细胞可以提 供新的线粒体给受损细胞, 使之恢复有氧代谢。 脂肪干细胞的美容作用主要与其旁分泌有关。K im Wk 等 [14], 在 2008年报道了脂肪干细胞的分泌物有美白作用。 Park BS [15]与 K imW k等, 也报道了脂肪干细胞的抗衰老与延 缓衰老的作用主要与其分泌物有关。K im W S等研究了脂肪 干细胞的美容机制, 发现 其有明显的抗皱作用,主要是其能分 泌分子激活皮肤的成纤维细胞, 从而达到修复皮肤的作用。 在临床脂肪雕塑术操作中, 不排除注射器内脂肪颗粒上 层含脂质 (油脂 )部分和不离心排出多余水分而保留注射器内 自然静置后脂肪组织悬液, 直接注射填充移植的方法更符合 科学依据, 这是因为脂肪及间质细胞同时存在, 更有利于造血 微环境的创建。近年来在临床开展脂肪雕塑术后经常收到许 多皮肤改善的临床效果: ( 改善皮肤微循环; ) 改善皮肤淋巴 循环; ∗ 增加皮肤弹性; +改善皮肤细小皱纹; , 皮肤痤疮消 失; −皮炎和皮肤红斑消失; . 皮肤脱屑消失; /皮肤毛细血 管扩张和皮肤发热消失。这些皮肤改善的机制和远期效果有 待进一步观察研究。 3. 3� 脂肪干细胞的其他作用 3. 3. 1� 促血管化作用 � 近年来, 大量的研究表明 ADSCs可以 产生和分泌多种促血管化的细胞因子 (如 VEGF、HGF、bFGF 等 ), 并参与了组织损伤修复的血管化过程 [ 16]。其机制可能 为 ADSCs直接诱导分化为血管内皮细胞; 另一方面分泌促血 管化因子以加速血管化。 3. 3. 2� 造血支持作用 � 目前, 已有学者关注 ADSC s的造血支 持作用。Cousin等 [ 17]证实 ADSC s具有造血支持作用, 然而其 机制是否为 ADSCs分化为造血细胞 ,还是 ADSCs分泌大量促 造血的细胞因子, 或者为两者均发挥作用,尚不清楚。 Co rre J等 [18]指出, ADSC s可以短期构建造血组织微环 境, 为血细胞的分化生长提供重要因子, 协助造血祖细胞的分 化。 3. 3. 3� 抗凋亡作用 � Sadat等 [ 16]应用 T ransw e ll共培养新生鼠 心肌细胞和 ADSCs时发现 ADSCs有保护心肌细胞的作用。 进一步采用 siRNA技术研究显示 ADSC s所分泌的 IGF- 1和 VEGF发挥抗凋亡的作用。 3. 3. 4� 趋化作用 � 目前, Cousin B等 [ 17]已证实 ADSC s和 BM� 3548 中国卫生检验杂志 2010年 12月 第 20卷 第 12期 � Ch inese Journal ofH ealth Lab oratory T echnology, Dec 2010; Vol 20� No 12 SCs都能够合成和分泌趋化因子 SDF1 (趋化因子 CXCL12, 又 称基质细胞衍生因子 - 1)。 4� 展望 � � 目前的研究报道已经预示了 ADSCs的广泛应用前景。 ADSCs分化的成骨细胞和软骨细胞可以做为组织工程骨的种 子细胞, 在整形外科和矫形外科的研究与治疗中将获得广泛 的应用。与其它来源的干细胞相比, ADSCs有显著的优越性, 它容易获得 (真空负压抽脂术是目前整形外科一项成熟的技 术 ) ,既安全, 又对病人的损伤小, 脂肪组织容易再生, 可以反 复进行吸脂术获得, 从而避免从骨髓获取干细胞所造成的损 伤及对病人本身带来的痛苦。脂肪源的 ADSC s不仅能够进行 自体移植, 还可以克服种属和免疫障碍, 它在体外增殖速度 快, 易获得足够的细胞用于移植, 是新的组织工程的种子细胞 来源 [ 18]。目前,亚太干细胞科研中心有限公司 ( A sia Pacific Stem cell Sc ience L im ited, APSC)已建立有脂肪干细胞存储库。 [参考文献 ] [ 1] Zuk P A, ZhuM, A sh jian P, et a l. H uman adipose t issue is a source ofm u ltipotent stem cells[ J] . Mo l B iol C el,l 2002, 13 ( 12 ): 4279- 4295. [ 2] De U garte DA, M orizono K, E lbarb ary A, et al. C om parison ofm u lt i� lin eage cel ls from hum an adipose t issue and bone m arrow [ J] . Cell tis� sues organs, 2003, 174( 3) : 102- 109. [ 3] BrianMS, Kevin CH, M arc HH, et a l. Mu ltipoten tial d ifferent iat ion of ad ipose t issue- d erived stem cel ls[ J] . Keio JM ed, 2005, 54( 3 ): 132- 141. [ 4] T rak tuev DO, M erfeld - C lauss S, L i J, et a l. A popu lation ofm u lt i� potent CD34- posit ive ad ipose atrom al cells sh are p ericyte andm esen� chyma l su rface m ark ers, res ide in a periendothel ial locat ion, and sta� b ilize endothel ial netw orks[ J] . C irc Res, 2008, 102( 1 ) : 77- 85. [ 5] S ch ipp er BM, M arraKG, Zh angW, et al. Reg iona l anatom ic and age effects on cel l fun ct ion ofhum an ad ipose- derived stem cells[ J] . Ann Plast Surg, 2008, 60: 538- 544. [ 6] O edayrajsingh- Varma M J, Van H am SM, Kn ippenb erg M, et a l. Ad ipose tissu e- derivedm esenchyma ls tem cell yield and grow th char� acteris tics are affected by th e t issue- harvesting procedu re[ J] . Cyto� therapy, 2006, 8 ( 2) : 166- 177. [ 7 ] G ronthosS, F rank inDM, Leddy HA, et a l. Surface protein character� ization of hum an ad ipose tissue- derived stromal cells[ J] . Cel lPhys i� o,l 2001, 189( 1 ) : 54- 63. [ 8 ] M itch ell JB, M cIntosh K, Zvon ic S, et a l. Imm unophenotype of hu� m an ad ipose- d erived cells: tem poral changes in strom al- associated and stem cell- associatedm arkers[ J] . S tem cells, 2006, 24( 2 ) : 376 - 385. [ 9 ] M eliga E, S tream BM, Duck ersH J, e t al. Ad ipose- d erived cel ls [ J] . Cell Tran sp lant, 2007, 16 ( 9) : 963- 970. [ 10] Cu i L, Y in S, L iuW, e t al. Exp anded ad ipose- derived stem cel ls supp ress m ixed lym phocyte react ion by secretion of prostagland in E 2 [ J] . T issue Eng, 2007, 13( 6 ) : 1185- 1195. [ 11] Pu i ssant B, B arreau C, B lan cher A, et a l. Imm unom odu latory effect of hum an ad ipose tissu e- derived adu lt stem cells: com parison w ith bone m arrow m esenchym al stem cells[ J] . Br JH aem ato,l 2005, 129 ( 1 ): 118- 29. [ 12] R iordan NH, Ich im TE, M inev B, e t al. Non- expanded ad ipose strom al vascu lar fract ion cell therapy for mu ltiple scleros is [ J ] . J Trans lM ed, 2009, 7( 29) : 1- 9. [ 13] S chenke- Layland K, S trem BM, M aclellanWR, et a l. Ad ipose t is� su e- derived cells imp rove cardiac funct ion follow ing m yocard ial in� farction[ J] . J Su rg R es, 2009, 153( 2) : 217- 23. [ 14] K im WS, Sung JH. W hiten ing ef fect of ad ip se- derived stem cells a crit ical role ofTGF- �1 [ J] . B iol Pharm Bu l,l 2008, 31( 4 ) : 606- 610. [ 15] Park BS, JangKA, K imW S, et al. Ad ipose- Derived stem cells and their secretory factors as a p rom is ing therapy for sk in aging[ J] . Der� m atol Surg, 2008, 34 ( 10) : 1323- 6. [ 16] S adat S, Gehm ert S, S ong YH, et a l. Th e card ioprotective effect of stem cells ism ed iated by IGF- I and VEGF [ J] . B iochem B iophys ResC omm un, 2007, 363 ( 3) : 674- 679. [ 17 ] C ous in B, AndreM, Arnaud E, et a l. Reconstru ct ion ofLethally ir� rad iated m ice by cells isolated from adipose[ J] . B iochem B iophys ResC omm un, 2003, 301 ( 4) : 1016- 1022. [ 18] C orre J, Barreau C, C ous in B, e t a l. H um an sub cutaneous ad ipose cells support com p lete d ifferent iat ion bu t not self- renewa lof hem ato� poietic progen itors[ J] . J C ellPhysio,l 2006, 208 ( 2) : 282- 288. (收稿日期: 2010- 08- 02) 3549中国卫生检验杂志 2010年 12月第 20卷第 12期 � Ch in ese Jou rn al ofH ealth Laboratory Techno logy, Dec 2010; Vo l20� N o 12