导苹果属植物细胞程序性死亡的研究

书书书 园! 艺! 学! 报! "##$，%&（"）："$’ ( "$) *+,- ./0,1+23,20-4 5161+- 收稿日期："##7 ( #8 ( 9&；修回日期："##$ ( #% ( "% 基金项目：北京市重点实验室资助项目 ! 通讯作者 *2,:/0 ;/0 +/004<=/6>46+4（?@A-13：0<+:-6B +-2C 4>2C +6） 干旱胁迫诱导苹果属植物细胞程序性死亡的研究 谭冬梅9，"，许雪峰9，李天忠9，韩振海9! （ 9 中国农业大学园艺植物研究所，北京 9###8&；" 潍坊学院生物学院，山东潍坊 "79#79） 摘! 要：用聚乙二醇（=/3D4,:D3464 E3D+/3，F?G7###）对苹果属植物平邑甜茶（!"#$% &$’(&()%*% =-A= H43>I）和新疆野苹果〔!+ %*(,(-%**（J4>4K）H/4AI〕幼苗进行水分胁迫处理，通过 5/2,:406杂交和 L4<,406 杂交的方法检测胁迫条件下幼苗体内 MN* J->>40 及 O-<=-<4@% 蛋白酶。5/2,:406 杂交结果明，干旱处理 后，两种苹果的根和叶片中都有 MN* J->>40 产生；L4<,406 杂交结果显示，在苹果的叶片中有杂交印迹， 而根中没有。这说明干旱胁迫可以诱导两种苹果属植物发生细胞程序性死亡，并且在细胞程序性死亡过程 中叶片中都有类 O-<=-<4@%蛋白酶的产生。 关键词：苹果属；干旱胁迫；细胞程序性死亡；MN* J->>40；O-<=-<4@% 中图分类号：5 779! ! 文献标识码：*! ! 文章编号：#’9%@%’%P（"##$）#"@#"$’@#& !"# $"%&’()(*% +,- .’(/"#0’&12% 3,+)%4’,* (5 $2(*2+00#- 6#)) 7#+1" 8,-#2 72(8*"1 912#&& ’, !"#$% &$’(&()%*% +,- !+ %*(,(-%** Q*N M/6E@A419，"，PR P24@S46E9，JT Q1-6@U:/6E9，-6> .*N V:46@:-19! （ 9 .)%/*/$/( 01- 21-/*3$#/$-"# 4#")/%，5&*)" 67-*3$#/$-"# 8)*,(-%*/9，:(*;*)7 9###8&，5&*)"；"<(’"-/=()/ 10 67-*3$#/$-( ")> ?)7*@ )((-*)7，A(*0")7 8)*,(-%*/9，A(*0")7，B&")>1)7 "79#79，5&*)"） 3:&12+/1：544>316E< /; !"#$% %*(,(-%** -6> !+ &$’(&()%*% ,04-,4> W1,: =/3D4,:D3464 E3D+/3（F?G7###） W404 2<4> ,/ <,2>D ,:4 +:-0-+,40< /; !"#$% <=4+14< 26>40 >0/2E:, <,04<>40< W404 ;/26> 16 0//,< -6> 34-X4< 16 ,:4<4 <=4+14< -;,40 K416E <2KY4+,4> ,/ >0/2E:, <,04< ,:4 04<23,< /; L4<,406 K3/,,16E <:/W4> ,:-, K3/,< -==4-04> 16 34-X4< K2, 6/, 16 0//,1+-,4> ,:-, >0/2E:, <,04<< +/23> 16>2+4 =0/E0-AA4> +433 >4-,: 16 !"#$% =3-6, O-<=-<4@% W-< =0/>2+4> 16 34-X4< 16 ,:4<4 ,W/ !"#$% <=4+14< >2016E ,:1< =0/+4< +433 >4-,:；MN* J->>40；O-<=-<4@% 细胞程序性死亡（=0/E0-AA4> +433 >4-,:，FOM）是由基因编程调控的细胞自主性自杀过程。细胞 程序性死亡的主要生化特征是：细胞被诱导产生核酸内切酶，核 MN* 从核小体间降解断裂，产生带 有 %Z@[.端的、大小不同的寡聚核小体片段。这些片段在凝胶电泳上可以见到 9&# K= 倍增的 MN*梯 形条带（MN* J->>40）（王雅清和崔克明，988)）。细胞程序性死亡过程一般分为诱导期、效应期和 降解期。其中半胱氨酸蛋白酶（O-<=-<4）的激活是细胞程序性死亡的关键步骤，该步一旦实施，细 胞的死亡将不可避免（史刚荣，"##"）。许多研究都将 MN* J->>40 的产生作为鉴定细胞程序性死亡 的一个重要生化指标（M/2E3-< \ ]1+:^34，9887；5,416 \ .-6<46，9888）。也有学者对植物体中的 O-<=-<4蛋白酶进行了相关研究（[0U-4U \ G0-6433，988$）。作者从苹果叶片及根系中提取 MN* 以及 总蛋白，期望通过 MN* J->>40的产生情况来判断干旱处理是否能诱导苹果属植物发生细胞程序性死 亡，并通过蛋白免疫杂交来检测发生细胞程序性死亡过程中是否有 O-<=-<4蛋白酶的出现。 万方数据 园! ! 艺! ! 学! ! 报 "# 卷 $! 材料与方法 !" !# 材料与处理 选取均匀一致的平邑甜茶（抗旱性较弱）和新疆野苹果（抗旱性较强）种子，去除种壳，蒸馏 水浸泡 $% &，沙布包好放在培养皿中置于 #’冰箱中层积。层积过程中每隔 % ( 用清水冲洗 " 遍，尽 量甩干水分以免发霉。选发芽一致的种子播入蛭石中室温下培养。幼苗长至 # 片真叶时移入 $ ) % 剂量 的 *+,-.,/(营养液培养。0 (后，改用全剂量 *+,-.,/(营养液培养。营养液用 12*调至 3* 45 6，每 0 (更换 $ 次，每天定时通气，人工恒定日光灯光源，$# &光照，光照强度 #66 !7+.·7 8%·9 8 $，温 度为白天 %:’ ;%<’，夜间 %%’ ;%:’。 取 4 月龄幼苗，移入含有 %6=聚乙二醇（>?@4666）的营养液中进行水分胁迫处理，设 " 次重 复；对照为正常营养液水培。从胁迫处理开始，第 $ 次取样时间为早晨 K>，$= GL?）提取总 BCD，并用紫外分光光度计测定 BCD 的含量（萨姆布鲁克和拉赛尔，%66:）。称取 $5 6 - 叶片或根 系，用液氮将样品快速研成粉末装管，每管加入 " 7H 蛋白提取液（$66 77+.·H 8$ FIJ9 8 *E.，:6 77+.·H 8$ ?BFD，$66 77+.·H 8$ 1E.，% 77+.·H 8$ BFF，% 77+.·H 8$ >LMN，$6=甘油，3* 05 :），振荡混匀，置于 #’冰箱抽提 % & 以上，离心（#’，$% 666 I·7J/ 8$）$: 7J/。提取上清液， 用紫外分光光度计测定蛋白含量，并进行 MBM 8 >D@?电泳检测蛋白条带（汪家政和范明，%666）。 $5 %5 %! M+OP&QI/杂交! BCD上样量为 $6 !-。以

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BCD（用 !"#R"酶切正常组织基因组 BCD后的 BCD片段总和）制作杂交探针（萨姆布鲁克和拉赛尔，%66:）。 $5 %5 "! MBM 8 >D@? 电泳及 SQ9PQI/ 免疫印迹! 取各样品蛋白 %6 /- 用于 MBM 8 >D@? 电泳（浓缩胶 :=，分离胶 $%=），然后将凝胶的 L,ITQI泳道切下放入考马斯亮蓝染色液中染色，用脱色液脱色后 做蛋白分子量标记用；余下的样品胶进行电转后用于 SQ9PQI/杂交并拍照（汪家政和范明，%666）。 %! 结果与分析 $" !# 干旱胁迫诱导叶片及根中产生 %&’ ()**+, M+OP&QI/杂交结果显示，新疆野苹果和平邑甜茶的叶片及根，在正常营养液培养条件下总 BCD 为一条完整的带，没有降解现象（图 $ 和图 % 的泳道 $）。用 %6= >?@4666 处理后，平邑甜茶叶片 BCD从 $ (开始降解（图 $，D中泳道 "），根从 65 : (开始降解（图 $，G中泳道 %）；而新疆野苹果 叶片和根 BCD均从 $ (开始降解（图 %，泳道 %）。降解表现为 BCD H,((QI的出现（在杂交图片下部 的 BCD片段），片段大小为 $<6 U3 左右。可见，两个试材在处理过程中都发生了细胞程序性死亡。 有研究表明，在植物材料中常难检测到清晰的 BCD H,((QI（E+&Q/ QP ,.V，$WW%；S,.TQI X MJT+I9T,， $WW0），只在个别物种中有理想的 BCD H,((QI（陈浩明 等，$WWW；L,YY,II+/Q QP ,.V，%666）。有学者 认为：在细胞程序性死亡的过程中，如果 BCD是单链断裂，在电泳图谱上就很难观察到 BCD的梯形 条带；而且在对一个生物组织的 BCD进行凝胶电泳时，由于活细胞、程序化死亡细胞和坏死细胞并 存，活细胞和坏死细胞会严重干扰程序化死亡细胞 BCD凝胶电泳条带的出现，所以 BCD H,((QI常很 难辨晰（E+&Q/ QP ,.V，$WW%；S,.TQI X MJT+I9T,，$WW0）。本试验中干旱胁迫条件下两种苹果属植物都 有 BCD H,((QI出现，在新疆野苹果中条带比较清晰，而在平邑甜茶中比较模糊，可能也是出于这个 原因。因此在进行细胞程序性死亡判定时，以多项生理生化指标综合判定能得出更为可靠的结果。 40% 万方数据 ! " 期 谭冬梅等：干旱胁迫诱导苹果属植物细胞程序性死亡的研究! 图 !" #$% &’()$$$ 处理后平邑甜茶叶片（*）和根（+）的 ,-./0123 45-/结果 6789 !" :01 21;.5/; -< ,-./0123 45-/ 73 51=>1;（*）=3? 2--/;（+）-< !" #$%&#&’()( /21=/1? @7/0 #$% &’()$$$ 图 #" #$% &’()$$$ 处理后新疆野苹果叶片（*）和根（+）的 ,-./0123 45-/结果 6789 #" :01 21;.5/; -< ,-./0123 45-/ 73 51=>1;（*）=3? 2--/;（+）-< !" ()&*&+()) /21=/1? @7/0 #$% &’()$$$ #A #" 干旱胁迫诱导 &BC产生时类半胱氨酸蛋白酶（B=;D=;1EF）的表达 由于选用的抗体是针对动物的抗体，所以在试验中出现的蛋白印迹称之为类 #$%&$%’() 蛋白酶。 图 ) 和图 * 分别显示了干旱胁迫下平邑甜茶和新疆野苹果叶片及根中类 #$%&$%’() 的表达情况。无论 是平邑甜茶还是新疆野苹果，叶片中均有类 #$%&$%’() 的印迹条带，分子量大约为 *+ ,-（图 )，.和 图 *，.）。而在两种苹果的根中都没有印迹产生（图 )，/和图 *，/）。 图 F" #$% &’()$$$ 处理后平邑甜茶叶片（*）及根（+）的G1;/123 45-/结果 6789 F" :01 G1;/123 45-/ 21;.5/; 73 51=>1;（*）=3? 2--/;（+）-< !" #$%&#&’()( /21=/1? @7/0 #$% &’()$$$ 图 H" #$% &’()$$$ 处理后新疆野苹果叶片（*）及根（+）的G1;/123 45-/结果 6789 H" :01 G1;/123 45-/ 21;.5/; 73 51=>1;（*）=3? 2--/;（+）-< !" ()&*&+()) /21=/1? @7/0 #$% &’()$$$ 00" 万方数据 园! ! 艺! ! 学! ! 报 "# 卷 "! 讨论 在细胞程序性死亡过程中起关键性作用的蛋白酶是半胱氨酸蛋白酶（$%&’%&(&），而且 $%&’%&(& 是一个半胱氨酸蛋白酶家族。其中的 $%&’%&()" 为凋亡效应子，位于级联反应下游。$%&’%&( 在动物体 中以酶原的形式存在，受信号刺激活化后才能诱导细胞程序性死亡发生。本研究中检测出的类 $%&’%&()" 的分子量大约为 #* +,，比动物细胞中 $%&’%&()" 的分子量（"- +,）大 . +, 左右（李嘉琦 和吴娟，-**"）。本研究结果表明，干旱胁迫下苹果叶片中有类 $%&’%&()" 存在，而根中没有。这说明 在苹果叶片中本身就有半胱氨酸蛋白酶存在；在受到干旱胁迫后，根首先感受到胁迫信号，并将信号 传到叶片，在叶片中启动类 $%&’%&( 蛋白酶基因，诱发类 $%&’%&( 蛋白酶活性，从而导致细胞程序性 死亡发生。 既然在苹果细胞程序性死亡中证明有类 $%&’%&( 存在，今后应重点研究确定类 $%&’%&( 是否也像 动物细胞的 $%&’%&(一样，具有启动细胞程序性死亡的作用，进而研究它在苹果属植物中启动细胞程 序性死亡的机制及调控机理；找到上游凋亡始动子，比如 $%&’%&().、$%&’%&()/ 等，在苹果中克隆出 凋亡始动子基因，并将其转入苹果，进一步验证它们在苹果中的表达及功能，为今后根据生产需要培 育抗凋亡及促凋亡的新种奠定理论基础。 !"#"$"%&"’ $01(2 3 4，562 7 4，52089(2 : ;，,<2&9%=( ,，5+<==(>(? , @A B//-A C(D E0?’10=0F6?(& 0H %’0’>0&<& E%D 0GG6? <2 >1( %I&(2G( 0H <2>(?) 26G=(%0&0E%= ,@J H?%FE(2>%><02A K<0G1(E &10G+ <296G(9 %’0’>0&<& <2 >0) I%GG0 &6&’(2&<02 G(==&A $1<2(&( 5G<(2G( K6==(><02，##（-）：B/M N -**A（ <2 $1<2(&(） 陈浩明，颜长辉，姜晓芳，夏慧莉，朱海珍，吴! 逸，戴尧仁A B///A 热激诱导烟草悬浮细胞的凋亡A 科学通报，##（-）：B/M N -**A ,06F=%& T :，40 0=& 96?<2F G(== 9(%>1 <296G(9 ID H62F%= <2H(G><02 0? ID %I<0>?(%>E(2>&A ;1( W=%2> $(==，.："/" N #*-A X< L<%)Y<，S6 L6%2A -**"A $%&’%&(& %29 %’0’>0&<&A W?0F?(&& <2 Z(>(?<2%?D 4(91%?> L \ 3，\<2%RR< J JA -***A T%?=D %G><02 0H =<’0]DF(2%&( <2 =(2><=（!"#$ %&’(#)*($） ?00> ’?0>0’=%&>& ID 0]<9%>?(&& <296G(& ’?0F?%EE(9 G(== 9(%>1A T6?0’(%2 L06?2%= 0H K<0G1(E<&>?D，-M^（BM）：[*^. N [*.#A _?R%(R ,，3?%2(== JA B//^A ,@J H?%FE(2>%><02 <& ?(F6=%>(9 ID (>1D=(2( 96?<2F G%?’(= &(2(&G(2G( <2 +($&, $)-(.&,A >1( W=%2> L06?2%=，BB：B"^ N B##A 5%EI?00+ L，:6&&(== , SA -**[A 40=(G6=%? G=02<2F：% =%I0?%>0?D E%26%=A "?9 (9A O6%2F W(<)>%2F >?%2&=%><02A K(<‘<2F：5G<(2G( W?(&&：#/- N #//A（ <2 $1<2(&(） L 萨姆布鲁克，, S 拉赛尔A -**[A 分子克隆实验指南A 第 " 版A 黄培堂译A 北京：科学出版社：#/- N #//A 51< 3%2F)?02FA -**-A W?0F?%EE(9 G(== 9(%>1 <2 ’=%2>&A K<0=0FD ;(%G1<2F，-^（B）："# N "[A（ <2 $1<2(&(） 史刚荣A -**-A 植物细胞程序性死亡A 生物学教学，-^（B）："# N "[A 5>(<2 L $，O%2&(2 3A B///A 4%220&( <296G(& %2 (29026G=(%&( ?(&’02& G(==&A W=%2> W1D&<0=0FD，B-B：^ B N ^/A S%=+(? W :，5<+0?&+% 4A B//^A @(8 %&’(G>& 0H >1( E(G1%2<&E 0H ,@J H?%FE(2>%><02 <2 %’0’>0&<&A K<0G1(E<&>?D $(== K<0=0FD，^ [（#）：-.^ N -//A S%2F L<%)R1(2F，\%2 4<2FA -***A 4%26%= 0H ’?0>(<2 >(G120=0FDA K(<‘<2F：5G<(2G( W?(&&：^ ^ N B.#A（ <2 $1<2(&(） 汪家政，范! 明A -***A 蛋白质技术手册A 北京：科学出版社：^^ N B.#A S%2F P%)Y<2F，$6< C()E<2FA B//.A W?0F?%EE(9 G(== 9(%>1 96?<2F >1( V(&&(= (=(E(2> 9<%><02 0H >1( &(G029%?D ]D=(E <2 /&%0,,() &’1 ,0(2"$ &100>&A JG>% K0>%2论文

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