顺铂与肾小管上皮细胞凋亡

国际泌尿系统杂志2006年11月第26卷第6期InternationalJournalofUrologyandNephrology，Nov2006，Vol-26NO．6 顺铂与肾小管上皮细胞凋亡 杨宁+ 综述 樊均明 甘华山 审校 【摘要】 顺铂剂量依赖的肾毒性而限制了其临床治疗肿瘤的效果。研究发现，顺铂通过线粒体途径 和死亡受体途径诱导的肾小管上皮细胞凋亡在顺铂引起的肾毒性中发挥着重要作用。 【关键词】 肾小管；上皮细胞；脱噬作用；顺铂 [中图分类号]R692[文献标识码]A[文章编号]1673—4416(2006)06-0848-04 顺铂是临床上常用的化疗药物，广泛的应用于 各种实体瘤的治疗中，然而顺铂剂量依赖的肾毒性 而限制了其临床治疗肿瘤的效果。顺铂易于在肾脏 外髓的近端小管上皮细胞，特别是s3段蓄积，28％ 一36％的患者接受初始剂量的顺铂(50—100me,／ m2)而引起急性肾功能衰竭，主要现为肾小管上 皮细胞生化和细胞功能紊乱，包括抑制蛋白合成、氧 化应激、线粒体失功、细胞骨架重构、细胞间黏附的 变化以及小管上皮细胞的死亡(包括坏死和凋亡)。 最近顺铂诱导的肾小管上皮细胞凋亡在其肾毒性中 发挥着重要的作用⋯，因此本文就顺铂诱导的肾小 管上皮细胞凋亡作一综述，从而为临床顺铂引起的 肾毒性提供治疗。 ·综述· 1 凋亡 1．1 定义 凋亡是一个基因调控的主动而有序的细胞自我 消亡的过程，是指一连串连续性的不伴炎症反应的 细胞的变化，最终导致细胞死亡。凋亡在正常的生 命活动中发挥重要作用，参与正常发育，保持组织稳 定状态，维护正常免疫系统，凋亡的紊乱会引起退行 性变，自身免疫系统疾病以及恶性肿瘤等12j。 1．2凋亡发生的机制 凋亡的发生是通过caspase实现的。研究发现 caspase的激活是通过两条途径完成的，即死亡受体 介导的外源性途径和线粒体介导的内源性途径旧’4]。 Caspase是一种半胱胺酸蛋白酶，水解底物中的 14 MehersCM．SeeffLB．Stehman—BreenCO，eta1．HepatitisCand renaldisease：anupdate．AmJKidneyDis，2003．42：631—57． 15 ChadbanSJ，AtkinsRC．Glomerulonephritis．Lancet，2005．365： 】797一】806． 16 MisianiR．BellavitaP．FeniliD。eta1．Interferonalfa一2atherapy incryoglobulinemiaassociatedwithhepatitisCvirus．NZn#】Mad． 1994．330；75l一756． 17 SabryAA．SobhMA．flheushuHA．eta1．Effectofcombination therapy(ribavirinandinterferon)inHCV—misted810merulopathy． NephmlDialTransplant．2∞2．17l1924一1930． 18 Bmahfetd杰．1dndahIK。StahleL．eta1．Interi'emnandrimvirin treatmenti11patientswithhepatitisC·associatedmnaldiseueand renalinsufficiency．NephmlDialTransplant．2003。18I1573一 1580． 19 R堋-lP。BertanlT．BaloPeta1．HepatitisCvlruR—mistederyo· 810hulinemioIflomemlonephritln!Ions—termnsmlssionafterantlvlral therapy．KidneyInt．2003。6312236—2241． ·作者单位1610041成都，四川大学华西医臃肾脏科 20 AideL．PlaisierE，ThebaultS．ete1．Influenceofantivirattherapyin hepatitisCvirus—associatedcryoglobulinemicMPGN．AmJKidney Dis．2004．43：617—623． 21 GariniG．XJlesriL，CarnevaliL．eta1．Interferon—alphaincombine- tionwithribavirinaSinitialtn_atmentforhepatitisCvirus—associat- ederyoglobulinemlcmembranoproliferative#omeralonephfitis。Am3 KidneyDis．2001．38lE35． 22 CampiseM．TarantinoA．Glomerulonephritisinmixedcryoglobu- linemia!whattreatment?Ne'phmlDialTransplant．999．14：28l一 3。 23Z^|aF．DeVitaS．Mmmroe．etB1．EfficacyandsafetyofrJtuxim曲 tntype11mixedcryolllobultnemla。Blood2003．10113827—3834． 24 RoceatelIoD．BddovinoS．RrmlD．eta1．Lonil—terme爆ectsofanti —CD20monoclonalantibodytreatmentoforyo胡obulin-emio#omer- ulonephritls．Nephro]DialTransplant．2004．19t30S4—3001． (收稿日期：2006-05-25) 万方数据 国际泌尿系统杂志2006年11月第26卷第6期InternationalJournalofUrologyandNephrology，Nov2006，V01．26NO．6 天冬胺酸残基。迄今在哺乳动物中已发现14种 casepase，其中8种在凋亡中发挥重要作用。根据 caspase的一级结构和蛋白质一蛋白质相互作用的 N端的原结构域分为启动子caspase(initiator caspase包括easpase一2、一8、一9、一10)和效应子 caspase(effeetorcaspase包括caspase一3、一6、一7 )。肩动子caspase其N端的原结构域的氨基酸> 90，可以自身催化而激活，而效应子caspase则只有 20～30个氨基酸残基，通过启动子caspase激活。 因此在一定条件下，启动子caspase自身激活后引起 一系列下游的caspase的激活，从而启动凋亡的发 生‘51。 死亡受体介导的凋亡是由CD95(Fas)，TNF等 死亡受体超家族成员所启动的，CD95配体与CD95 结合可使CD95受体相互聚集形成死亡信号复合 物，后者通过死亡功能域DD与转接器分子FADD 的DD结合，FADD是一种胞质蛋白，其C一末端含 DD，N一末端则有死亡效应结构域DED，其可以通 过N一末端的DED进而与caspase一8酶原中的 DED相结合并募集多个caspase一8酶原分子而导 致caspase一8靠近激活∞j。而线粒体介导的凋亡则 是细胞色素C启动的。在一些凋亡刺激的作用下， 线粒体电子传递链中的细胞色素C从线粒体释放 到胞浆，与胞浆中的Apaf一1蛋白结合，后者具有 caspase募集结构域(CARD)，细胞色素c与Apaf一 1的结合诱导Apaf一1构型改变，与dATP／ATP结合 增加，dATP／ATP与细胞色素C—Apaf一1形成凋亡 酶体(apoptosome)，然后募集前easpase9，形成 caspase9全酶，后者催化其他的caspase，如caspase3 最终发生凋亡。利用基因敲除试验证实了细胞色素 C—Apaf一1一caspase9一caspase3的线性途径，在细 胞色素c敲除的细胞中，即使在凋亡信号的刺激下， Apaf一1仍然保持单体状态，而在Apaf一1或 caspase9敲除的细胞中，则无caspase3的激活Mj。 2顺铂与肾小管上皮细胞凋亡 2．1 线粒体途径和死亡受体途径在顺铂诱导的凋 亡中的作用 研究发现，顺铂引起的肾小管上皮细胞的凋亡 是通过线粒体途径和死亡受体途径完成的【6'7|，并 且是剂量和时间依赖性的，不同的浓度和作用时间 引起细胞不同的死亡方式旧1。ALAN等研究发现， 高浓度的顺铂(800uM)引起肾小管上皮细胞的坏 死，出现胞浆肿胀，胞膜完整性消失，而较低浓度的 』Ib而,IA(8uM)则引起凋亡，出现典型的细胞皱缩，染 色质浓缩、核碎裂。给予肾小管上皮细胞50uM顺 铂诱导后，在8h～24h核碎裂的细胞由9％一 39％，并且DNA凝胶电泳也发现12h后出现典型 的梯形带∽J。 Park等研究发现，顺铂以剂量和时间依赖的方 式诱导LLC—PKl发生凋亡。通过DNAladder和 TUNE两种方法证明了在顺铂50uM，作用24h诱导 的凋亡较显著，但是增加顺铂的浓度则会引起LLC —PKI坏死。同时发现顺铂引起剂量依赖性的前凋 亡分子Bax激活和细胞色素C从线粒体转运到胞 浆，应用Caspase9特异的抑制剂LEHD—CHO完全 抑制LLC—PKI的凋亡，而Caspase一8特异的抑制 剂IETD—fmk则对凋亡没有影响，并且在顺铂的诱 导下，Caspase9的活性上调了6倍，而Caspase8的活 性无变化，因此表明顺铂诱导Bax分子的激活，进而 使线粒体膜的通透性增加，细胞色素r从线粒体释 放，激活Caspase9，从而启动线粒体介导的凋亡16)。 Tsuruya等体内和体外研究均发现，顺铂诱导的 肾小管上皮细胞的凋亡与死亡受体及配体有关。给 予大鼠和B6小鼠注射顺铂8mg／kg，NEK52E和 B6PTC8umol／1顺铂培养均引起Fas、Fas—L、TNF— ccmRNA表达的上调，caspase8的活性增强；应用 C57BLl6一lp#lpr鼠(Fas突变)和TNFRl一／一鼠 给予顺铂后，均能减轻小管上皮细胞的凋亡和肾功 能损害。因此，Fas—FasL及TNF—TNFRl途径参 与了顺铂诱导的凋亡【10|。另外，Ramesh等研究发 现，顺铂引起了TNFRl、2表达上调，其中TNFR2参 与了顺铂引起的肾小管上皮细胞的坏死和凋亡，并 且TNFR2的缺失则能减轻凋亡和坏死的发生，而 TNFRl在这方面的作用比较小⋯J。 此外，Faubel等研究发现，给予caspasel缺失的 小鼠顺铂后，肾小管上皮细胞的凋亡，肾小管坏死评 分，中性粒细胞的浸润均减轻，与野生型的小鼠相 比，前者caspase3的活性降低了50％；而体外的试 验同时发现，在肾脏胞质提取物中，easpasel激活 caspase3，因此综上研究推测在顺铂引起的急性肾衰 中，caspase!对caspase3的激活是非常必须的¨2|。 P53、线粒体、caspase3、8、9参与了顺铂诱导的肾小 管上皮细胞的凋亡。Brian等研究发现，50％的肾小 管上皮细胞的凋亡是P53直接激活caspase3引起 的，而不依赖于caspase8／9或者是线粒体的激活；另 50％凋亡的发生是不依赖于P53、caspase3、8、9途径 万方数据 850 国际泌尿系统杂志2006年11月第26卷第6期InternationalJoumMofUrologyandNephrology，Nov2006，Vol·26NO·6 的其他机制引起的，具体有待于进一步的研究¨引。 2．2氧化应激在顺铂诱导的凋亡中的作用 Liu等研究发现细胞色素P450(CYP2E1)作为 活性氧代谢产物(ROM)的来源，在顺铂诱导的肾毒 性和凋亡中发挥重要的作用。CYP2E1KO的小鼠能 显著减少ROM的产生，并且对凋亡有明显的保护 作用¨引。此外，还发现内质网应激相关的 caspasel2参与了顺铂诱导LLCK—l的凋亡。 caspasel2是内质网特异性的caspase，位于内质网的 胞浆面。给予顺铂诱导后，caspasel2的激活在 caspase3、9之前，且抗caspasel2抗体则能显著减少 顺铂诱导的凋亡，因此推测顺铂与内质网细胞色素 P450相互作用引起的氧化应激激活了caspasel2而 启动凋亡【J引。 Tsuruya等首次发现了在肾小管上皮细胞中 ROS与死亡受体介导的凋亡途径之间的关系，而 DMTU是一种氧自由基清除剂，能下调顺铂引起的 肾小管上皮细胞中Fas、Fas一1、TNF一仅mRNA的表 达，从而减轻了顺铂引起的肾小管上皮细胞的死亡。 因此推测在顺铂引起的急性肾衰中，ROS通过激活 死亡受体而参与了肾小管细胞的死亡【I“。 2．3 MEK／ERK信号途径在顺铂诱导的凋亡中的 作用 ERK途径在调节细胞生长与分化方面发挥作 用，在一些应激的情况下激活，特别是氧化应激的损 伤中。Wang研究发现，ERK信号途径在顺铂诱导 Hella细胞的凋亡中发挥重要的作用。顺铂以时间 和剂量依赖的方式引起了Hella细胞中ERK的高度 激活，并且保持较高的活性，而下调ERK途径则能 抑制顺铂诱导的凋亡的发生；给予：①PD98059， U0126一MEK／ERK信号途径化学抑制剂阻止了凋 亡；②TPA—ERK信号途径激活剂能增加Hela细 胞对顺铂的敏感性；@)suramin一生长因子受体拮抗 剂，抑制了ERK信号的激活，从而抑制了顺铂诱导 的凋亡Ⅲo。同时J0研究发现在顺铂引起的肾损伤 中上调了ERKl／2信号途径，TNF—d、caspase活性 均升高，从而促进了肾小管上皮细胞的损伤，包括氧 化应激、DNA损伤、凋亡、炎症反应。而U0126一 MAPK／ERK信号途径的抑制剂，则能下调ERKl／2 的磷酸化，减少了TNF—d，caspase的活化，从而减 轻了小管上皮的凋亡、炎细胞的浸润。因此推测抑 制ERKl／2途径将为预防顺铂引起的肾毒性提供新 的治疗策略¨引。 3展望 顺铂诱导的肾小管上皮细胞的凋亡是其引起肾 毒性重要的表现，因此抑制小管上皮的凋亡是预防 和治疗顺铂肾毒性的重要措施，从而减少顺铂的肾 毒性的发生，更加有利于肿瘤的治疗。大量的中药 及其单体成分具有抗氧化、调节细胞因子和细胞膜 稳定作用。顺铭的肾毒性能否通过中药起到保护作 用，有待研究。 参考文献 l MasahiroOkuda，KoichiMasaki，SachioFukatsu，eta1．Roleofap· nptosisincisplatin—inducedtoxicityintherenalepithelialcellline LLC—PKl．BiochemicalPharmacology，2000，59：195—201． 2 Cory，S．andAdams．J．M．TheBcl2family：Regulatorsofthecellu- larlife—or—deathswitch．Nat．Rev．Cancer，2002，2：647—656． 3 Ashkenazi，A．Targetingdeathanddecoyreceptorsofthetumour— necrosisfactorsuperfamily．Nat．Rev．Cancer，2002，2：420—430． 4 Strasser，A，OConnor，L，andDixit，V．M．Apoptosissignaling． Annu．Rev．Biochem，2000，69：217—245． 5 Shi，Y．Mechanismsofca叩aseactivationandinhibitionduringapep— tosis．M01．Cell，2002。9：459—470． 6 XiaodongWangTheexpandingofmilochondriainapoptosis．Genes &Dev，200I．15：2922—2933． 7 ParkMS，DeLeonM．DevarajanP．Cisplatininducesapeptosisin LLC—PKIcellsviaactivationofmitochondrialpathway．JAmSoc Nephrol，2002，13：858—865． 8 KaushalGP，KaushalV，HongX。elal，Roleandregulationofacti— rationofeaspasesineisplatin—inducedinjuryto／'enaltubularepithe- lialcells．KidneyInt，2001，60：1726～1736． 9 AlanH．IJau．Apoptosisinducedbycisplatinnephrotoxicinjury． KidneyInt，1999，56：1295—1298． 10 KazuhikoTsuruya，ToshiharnNinomiya，MasanoriTokumoto，eta1． Directinvolvementofthereceptor—mediatedapoptotiepathwayin cisplatin—inducedrenaltubularcelldeath．KidneyInt，2003，63：72 —82． t 1 GanesanRamesh，W．BrianReeves．TNFR一2mediatedapoptosis andnecrosisincisplatin—inducedacutetinalfailure．AmJPhysiol RenalPhysiol，2003，285：F610—618． I2 KazuhikoTsuruya，MasanoriTokumoto，ToshiharuNinomiya，eta1． Antioxidamameilioratescisplatin—inducedrenaltubularcelldeath throughinhibitionofdeathreceptor—mediatedpathway．Am】Physi— 01RenalPhysiol，2003．285：F208—218． 13 BrianS，Cummings，RickG．Sehnellmann．Cisplatin—inducedre． nalcellapeptosis：caspase3—-dependentandcaspase3——independent pathways．TheJournalOfPharmacologyandExperimentalTherapeu— tics，2002，320：8—17． 14 LiuH．BaligaR．CytochromeP4502E1nullmiceprovidenovelpro— tectionagainstcisplatin—inducednephrotoxicityandapoptosis． KidneyInt．2003．63：1687一1696． 15 Liu14．BaligaR，Endoplasmicreticulumstess—associated 万方数据 国际泌尿系统杂志2006年11月第26卷第6期InternationalJournalofUrologyandNephrology，Nov2006，V01．26NO．6 85I DAG／PKC信号通路和糖尿病肾病 王晶晶+ 综述 陈江华 审校 【摘要】 糖尿病肾病是糖尿病最常见的微血管并发症之一。PKC的异常激活尤其是PKC一13在糖尿 病肾病中的作用已逐渐予以确立，但还得进一步明确除PKC—B之外其他的PKC同工酶在糖尿病肾病发生 发展中的作用，阻断DAG／PKC信号通路有望成为治疗糖尿病肾病的一种新方法。 【关镰词】 糖尿病肾病；信号传递 [中圈分类号]R692．39[文献标识码]A[文章编号】1673—4416(2006)06-0851-04 糖尿病肾病是糖尿病最常见的微血管并发症之 一。在西方国家糖尿病肾病是导致终末期肾病最常 见的原因之～；而在我国其发病率亦呈上升趋势。 目前认为有多种因素参与了糖尿病肾病的发生发 展，如糖脂代谢异常、血流动力学紊乱、细胞因子和 生长因子合成增多、胞内信号分子激活等⋯，而PKC 的异常激活尤其是PKC—B在糖尿病肾病中的作用 已逐渐予以确立，但还得进一步明确除PKC—B之 外其他的PKC同工酶在糖尿病肾病发生发展中的 作用，阻断DAG／PKC信号通路有望成为治疗糖尿 病肾病的一种新方法。 l DAG／PKC信号通路 1．1 PKC和DAG的生物学特征 蛋白激酶C(ProteinkinaseC，PKC)是多种不同 结构不同生物活性的同工酶组成的丝氨酸／苏氨酸 蛋白激酶家族。1977年由Nishizuka发现，分子量为 80KD～90KD，均为单链多肽，包含两个功能区，即亲 水的催化活性中心和疏水的膜结合区。目前在哺乳 动物中发现的PKC至少含12种同工酶，每一同工 酶编码基因位于不同染色体，其结构既高度保守又 高度变异。根据它们的活化条件不同而分为三大 ·综述· 类【2’：①经典的PKC包括PKC—Ot、PKC一13I、PKC— pII和PKC一1亚型含全部的氨基酸序列，依赖磷脂 酰丝氨酸(Ps)，Ca2+和二酯酰甘油(DAG)或波脂激 活；②新型PKC包括PKC一6、PKC一8、PKC一-i1、 PKC一0、PKC一斗和PKC—u，它们的激活只需 DAG，无须Ca2+的参与；③非典型PKCs包括PKC一 ∈、PKC—L、PKC一入，膜结合区仅有一个锌指结构，依 赖Ps，对can和DAG均不依赖。 生理状态下细胞信号如激素、生长因子或神经 递质等首先和血浆膜受体结合，进而激活G蛋白，后 者激活磷脂酶C，水解磷脂肌醇4、5二磷脂产生二 酯酰甘油(Diacylglycerol，DAG)和肌醇1、4、5一三 磷酸，其中DAG是激活PKC的主要胞内物质，它可 直接激活PKC，被激活的PKC在c1位结合DAG，C2 位结合磷脂酰丝氨酸后转位到细胞膜改变血管通透 性、合成胞外基质、调节平滑肌收缩、介导细胞增殖 和分化、影响细胞周期和细胞凋亡、调节基因表达、 控制神经传导等旧。。然而在磷脂酶c(PLC)作用下 水解形成的DAG很快被代谢掉，不可能长期维持 PKC活性，而细胞增殖或分化行为的变化要求PKC 具有长期活性；后发现DAG可由PLC催化质膜上的 caspasel2 mediateseisplatin—inducedLIJC—PKlcellapoptosis．J AmSocNephrol，2005，16：1985—1992． 16 XiaotaoWang，JenniferL，Martindale，eta1．RequriementforERK activationincisplatin—inducedapoptosis．JBiolChem，2000，275： 39435—39443． 17 Sang—kyungJo，WonyongCho，SuanSung，eta1．MEKinhibitor U0126decreaseinflammationandapoptosis．KidneyInt，2005，67： +作者单位：310003杭州，浙江大学医学院附属第一医院肾脏病中心 458—466． 18 SarahF，DanicaLjubanovic，LeonidReznikov，eta1．Caspase一1一 deficientmiceareprotectedagainstcisplatin—inducedapoptosisand acutetubularnecrosis．KidneyInt，2004，66：2202—2213． (收稿日期：2005．12-06) 万方数据 顺铂与肾小管上皮细胞凋亡 作者： 杨宁， 樊均明， 甘华山 作者单位： 610041,成都,四川大学华西医院肾脏科 刊名： 国际泌尿系统杂志 英文刊名： INTERNATIONAL JOURNAL OF UROLOGY AND NEPHROLOGY 年，卷(期)： 2006，26(6) 引用次数： 0次 参考文献(18条) 1.Masahiro Okuda.Koichi Masaki.Sachio Fukatsu Role of apoptosis in cisplatin-induced toxicity in the renal epithelial cell line LLC-PK1 2000 2.Cory S.Adams J M The Bcl2 family:Regulators of the cellular life-or-death switch 2002 3.Ashkenazi A Targeting death and decoy receptors of the tumournecrosis factor superfamily 2002 4.Strasser A.O 'Connor L.Dixit V M Apoptosis signaling 2000 5.Shi Y Mechanisms of caspase activation and inhibition during apoptosis 2002 6.Xiao dong Wang The expanding of mitochondria in apoptosis 2001 7.Park MS.De Leon M.Devarajan P Cisplatin induces apoptosis in LLC-PK1 cells via activation of mitochondrial pathway 2002 8.Kaushal GP.Kaushal V.Hong X Role and regulation of activation of caspases in cisplatin-induced injury to renal tubular epithelial cells 2001 9.Alan H Lau Apoptosis induced by cisplatin nephrotoxic injury 1999 10.Kazuhiko Tsuruya.Toshiharu Ninomiya.Masanori Tokumoto Direct involvement of the receptor-mediated apoptotic pathway in cisplatin-induced renal tubular cell death 2003 11.Ganesan Ramesh.W Brian Reeves TNFR-2 mediated apoptosis and necrosis in cisplatin-induced acute renal failure 2003 12.Kazuhiko Tsuruya.Masanori Tokumoto.Toshiharu Ninomiya Antioxidant ameiliorates cisplatin-induced renal tubular cell death through inhibition of death receptor-mediated pathway 2003 13.Brian S Cummings.Rick G Schnellmann Cisplatin-induced renal cell apoptosis:caspase3-dependent and caspase3-independent pathways 2002 14.Liu H.Baliga R Cytochrome P4502E1 null mice provide novel protection against cisplatin-induced nephrotoxicity and apoptosis 2003 15.Liu H.Baliga R Endoplasmic reticulum stess-associated caspase12 mediates cisplatin-induced LLC- PK1 cell apoptosis 2005 16.Xiaotao Wang.Jennifer L.Martindale Requriement for ERK activation in cisplatin-induced apoptosis 2000 17.Sang-kyung Jo.Won yong Cho.Su an Sung MEK inhibitor U0126 decrease inflammation and apoptosis 2005 18.SarahF.Danica Ljubanovic.Leonid Reznikov Caspase-1-deficient mice are protected against cisplatin-induced apoptosis and acute tubular necrosis 2004 相似文献(10条) 1.期刊论文 康健.羊惠君.李爱冬 c-Myc c-Fos c-Jun c-H-Ras在糖尿病早期大鼠肾小管和集合管上皮细胞内表达 -川北医学院学报1999,14(1) 为了解c-Myc、c-Fos、c-Jun、c-H-Ras是否参与7～140d糠尿病早期大鼠肾小管、集合管上皮细胞两次转换率加速过程,我们了本实验.雄性 Wistar大鼠60只,四氧嘧啶(alloxan)尾静脉注射(50mg/kg)造糖尿病模型;石蜡包埋肾切片经c-Myc、c-Fos、c-Jun、c-H-Ras免疫组化染色.在7～30d、 70～140d c-Myc、c-Fos、c-Jun、c-H-Ras分别在近端小管、髓襻、远端小管、集合管上皮细胞内表达.c-Myc、c-Fos、c-Jun在糖尿病早期肾小管、集合 管上皮细胞内表达呈现延迟性、持续性、区域性和时间性.c-Myc、c-Fos、c-Jun、c-H-Ras可能参与调控糖尿病早期肾小管、集合管上皮细胞转换率加速 过程. 2.学位论文 陈丹 肾小管源性泡沫细胞及其形成机制 2006 目的：论证肾小管上皮细胞泡沫化的形成是否伴随着上皮细胞-巨噬细胞转分化这一过程。 方法：选取32例肾组织存在肾小管源性泡沫细胞的 肾病患者，结合组织病理、免疫组化、免疫荧光双套色和超微结构，观察肾小管源性泡沫细胞上皮细胞标志蛋白(cytokeratin，CKp)，巨噬细胞表型 (CD68、HAM56和CD11c)和功能相关蛋白(HLA-DR和CD86(B7-2))，功能分子(CD16、MCP-1、Hsp47和PDGF)的表达，以及肾小管源性泡沫细胞与肾间质泡沫 细胞可能的联系。 结果：早期，肾小管中仅有部分上皮细胞发生泡沫化，肾小管基底膜结构完整。个别泡沫化的肾小管上皮细胞，胞浆内可见 CKp和CD68的共表达，处于上皮细胞-巨噬细胞转分化的中间状态。随着肾小管的完全泡沫化，肾小管源性泡沫细胞从基底膜脱落，伴基底膜的断裂。此 时，肾小管上皮细胞呈现巨噬细胞样超微结构特征。其不仅丢失上皮细胞标志蛋白CKp的表达，在转而表现出巨噬细胞表型特征(CD68、HAM56和CD11c)的 同时，还获得巨噬细胞抗原提呈功能标志(HLA-DR和CD86(B7-2))及致炎分子(CD16和MCP-1)的表达。 结论：肾小管上皮细胞泡沫化的形成伴随着上 皮细胞-巨噬细胞转分化过程。肾小管源性泡沫细胞不仅获得巨噬细胞表型特征，还表现出抗原提呈能力和致炎作用，随着基底膜结构的破坏，脱落到肾 间质游走聚集，活化并加重肾间质炎症反应。 3.期刊论文 康健.羊惠君.李爱冬.Kang Jian.Yang Hujun.Li Aidon ICE Bcl-2 Bax p53在糖尿病早期大鼠肾小管 和集合管上皮细胞中表达 -川北医学院学报1999,14(3) 目的:为了解糖尿病早期肾小管和集合管上皮细胞凋亡过程中ICE、Bcl-2、Bax、p53是否参与调控.方法:雄性Wistar大鼠60只,四氧嘧啶(alloxan)尾 静脉注射(50mg/kg)造糖尿病模型;石蜡包埋肾切片经ICE、Bcl-2、Bax、p53免疫组化染色.结果:ICE、Bcl-2、Bax、p53蛋白分别在肾小管和集合管上皮 细胞两次凋亡发生前或发生时表达.结论:p53蛋白的表达可能反应了高血糖致使肾小管、集合管上皮细胞DNA损伤;Bax表达增强可能有使Bcl-2与Bax的比 值发生变化,以及在两次凋亡发生前ICE表达增强均与受损的肾小管、集合管上皮细胞凋亡有关. 4.期刊论文 廖晓辉.张玲.刘杞.LIAO Xiao-hui.ZHANG Ling.LIU Qi 重组大鼠肝再生增强因子对肾小管上皮细胞增 殖及凋亡的影响 -中华肾脏病杂志2005,21(12) 目的探讨重组大鼠肝再生增强因子(rrALR)对体外培养的肾小管上皮细胞增殖及凋亡的影响.方法将体外培养的人肾小管上皮细胞株(HK2)分组,分别 加入不同浓度的庆大霉素(GM)或(和)rrALR,3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)掺入法检测HK2细胞的增殖;吖啶橙/溴乙啶(AO/EB)染色和钙磷脂结合蛋白/碘化丙 啶(annexin V/PI)双标记流式细胞术检测上述各组HK2细胞的凋亡.结果 (1)rrALR对常规培养条件下的HK2细胞有直接的促增殖作用,并具有量效关系(在 25 ng/ml～50 μg/ml的浓度范围内逐渐增强,P＜0.01)和时效关系(培养12 h即有该作用,48 h达到高峰,以后逐渐下降,P＜0.05);(2)rrALR能够促进GM损 伤后的HK2细胞增殖,有明显剂量依赖性(P＜0.05);(3)rrALR呈剂量依赖性抑制GM诱导的HK2细胞凋亡(P＜0.01).结论 rrALR能够促进体外常规培养和GM损 伤后的肾小管上皮细胞增殖,抑制GM诱导的小管上皮细胞凋亡,提示ALR可能对小管上皮细胞的中毒性损伤有改善作用. 5.学位论文 皮蕾 Pax2在肾小管上皮细胞表型转化、肾间质纤维化中的表达及作用研究 2007 终末期肾病(ESRD)是各种慢性肾脏疾病持续不愈、进行性发展的最终结局。不论肾脏病的原始病因如何，其基础病变是否静止，肾脏都将缓慢、持 续、不可逆地向着终末期肾功能衰竭进展。迄今为止诸多的研究表明，以基质蛋白合成增多、降解减少所造成的细胞外基质的大量堆积导致的进行性肾 小管间质纤维化是各种晚期肾脏病的共同特征，慢性肾脏疾病肾功能的恶化进程取决于肾小管间质纤维化的程度和范围。因此积极探讨慢性肾小管间质 纤维化的机制，寻找积极有效的防治措施，延缓、阻滞肾小管间质纤维化的发生发展已成为国际肾脏病界的研究热点之一。 细胞外基质的大量堆 积被普遍认为是导致肾小管间质纤维化的重要步骤。究其来源，肾间质中的成纤维细胞、肌成纤维细胞、肾小管上皮细胞及炎症浸润细胞都可能参与分 泌。在这些细胞类型中，肌成纤维细胞的中心地位已经被广泛接受。肌成纤维细胞是一种特殊类型的细胞，兼具成纤维细胞和平滑肌细胞的特征，在正 常肾脏中处于静止状态，散在分布于肾间质中，病理状态下它们快速增殖，合成并分泌胶原，促进组织纤维化；其是成纤维细胞的一个亚类，表达间充 质细胞标记物α-SMA(α-smooth muscle actin)。它的出现被认为是肾小管间质纤维化进展过程中的一个关键步骤，追溯肌成纤维细胞来源，越来越多 的研究证实存在肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞的逆向分化(EMT)。EMT是肾脏小管细胞丢失上皮细胞表型，获得间叶细胞特征的过程，被认为是胚胎时 期间充质细胞——上皮细胞分化(MET)的逆向分化过程。胚胎时期间充质细胞一上皮细胞间的表型转化涉及了一系列参与、影响肾小管上皮细胞发育基因 的开启和关闭。我们推测，肾小管上皮细胞在受到损伤刺激后向间充质细胞逆向分化的过程中，同样涉及了这一系列参与、影响肾小管上皮细胞发育基 因的启动和表达，使得细胞的转型得以完成，因此，我们选择了这一系列基因中的成员Pax2进行研究。Pax2是泌尿生殖系统发育的早期调控基因，属于 在进化上高度保守的PairedBox Gene(PAX)转录因子家族成员，对肾小管上皮细胞分化及肾脏发育起着重要的调控作用，启动胚胎肾发育时期间充质细胞 一上皮细胞分化(MET)的分化过程。病理状态下可能启动上皮细胞一间充质细胞(EMT)的转型。但：Pax2并非是独立存在、独立发挥作用的。本课组的 前期研究的WT1也是诱导肾脏胚胎发育过程中间充质细胞-肾小管上皮细胞分化的关键基因之一，并与Pax2相互作用。因此我们认为，在控制、调节肾小 管上皮细胞一肌纤维母细胞间的逆向分化过程中，应该有一组基因群的参与，它们在特定信号传导机制的调控下，有序地开启和关闭，执行细胞内部地 一系列功能活动。 研究表明局部或循环中的细胞因子在肾小管上皮细胞发生逆向分化的过程中发挥着重要的作用。肾素-血管紧张素系统(Renin- Angiotensin-System，RAS)是胚胎期肾脏发育的过程中的重要的调控因子。AngⅡ作为RAS系统中最主要的血管活性肽，可引起细胞肥大并促进基质合成 ，在多种肾病中被激活。在肾脏纤维化的早期阶段，RAS激活的成纤维细胞和肾小管上皮细胞在肾脏疾病持续、不可逆性发展中发挥重要作用。 然 而我们对急性缺血再灌注损伤动物模型的研究表明，肾小管细胞也可发生EMT，逆向分化为肌成纤维细胞，其对受损的肾小管上皮细胞进行再生修复，此 时肾脏并不发生纤维化。因而我们认为逆向分化TEC的命运尚有这样一种可能：即肾小管上皮细胞转化可能转化为组织干细胞对损伤组织进行修复。 CD133分子是组织干细胞的一个重要的表面标志，研究发现，肾脏中CD133+细胞代表了一个多能的成体组织固有的干细胞群体，可修复损伤的肾小管。 肾脏内已分化细胞的增殖及逆向分化在肾脏受损后的修复重建过程中发挥着比骨髓干细胞更重要的作用。对逆向分化细胞是否具有干细胞潜能的研究 ，将有助于我们深刻地认识肾小管上皮细胞逆向分化的意义、细胞分化后的命运以及逆向分化后细胞对受损组织的积极或消极修复作用。 为此 ，在本研究中，我们重点探究了成年肾小管上皮细胞受慢性损伤刺激时，发生逆向分化过程中的基因的序列表达和调控；逆向分化发生的可能机制；以 及逆向分化后的肾小管上皮细胞生物学行为及命运，从而进一步证实慢性损伤时成年肾小管上皮细胞逆向分化发生的精确机制及其意义。 我们假 设：(1)在慢性肾脏疾病进程中，由于特定病理损伤因素的作用，可能激发启动了部分肾小管上皮细胞内以WT1和：Pax2为代表的基因序列，以控制肾小 管上皮细胞的逆向分化过程，发生由上皮细胞向间充质细胞的逆向分化的转变。(2)受损局部的炎性因子(如局部RAS)可能对肾小管上皮细胞的逆向分化 起诱导作用，参与其发生机制。(3)发生逆向分化的肾小管上皮细胞可能具有不同的生物学行为，除了我们以前实验已证实的致纤维化作用以外；其还可 能受不同信号的调控获得组织干细胞样的增殖分化潜能，旨在参与肾脏损伤的修复过程。 为此，我们建立了慢性肾功能衰竭动物模型及细胞模型 ，用分子生物学、免疫化学等方法观察了在肾脏慢性损伤时，肾小管上皮细胞逆向分化过程中，控制胚胎分化发育的关键基因WT1、Pax2等基因的序列表 达及调控，试图探讨在慢性肾功能衰竭肾脏病理改变过程中WT1、Pax2基因重新启动对成年肾小管上皮细胞逆向分化的影响、分子学机制及相互联系，肾 脏局部炎性因子对EMT的影响。并进一步研究了经EMT后的肾小管上皮细胞的功能和命运，即：①肾小管上皮细胞发生EMT由上皮细胞转化为向具有增殖分 化潜能的间充质细胞，在某些信号的介导下，这些获得分化潜能的肾小管上皮细胞群可向肾小管上皮细胞方向分化，积极参与肾小管上皮细胞的再生修 复：②肾小管上皮细胞发生：EMT由上皮细胞转化为向具有增殖分化潜能的间充质细胞，在另类信号的介导下，向纤维母细胞方向分化，通过分泌细胞外 基质、形成纤维结缔组织起到消极的修复作用，从而导致肾小管间质纤维化的发生发展。 具体研究方法如下： 1．Pax2与胚胎/初生期肾脏 发育之间关系的研究目的：观察肾脏发育期间即胚胎期和新生期肾脏中Pax2的表达消涨情况，探讨Pax2在肾脏发育过程中的可能作用，为下一步实验做 准备。 小结：Pax2的表达与肾脏发育成熟时间之间的相关性提示了Pax2在肾脏胚胎发育中的重要作用。 2． Pax2与5/6肾部分切除致慢性肾 损伤之间关系的研究.(1)5/6肾部分切除致慢性肾损伤时Pax2重新启动与肾小管上皮细胞逆向分化的关系目的：观察控制肾小管上皮细胞胚胎发育时期的 关键基因-Pax2在慢性肾损伤过程中是否重新表达及其表达情况，探讨Pax2和肾小管上皮细胞逆向分化以及肾脏进行性纤维化之间可能的内在联系。小结 ：胚胎发育基因Pax2在慢性肾损伤中重新一过性开放，可能是促使肾小管上皮细胞向肌成纤维细胞逆向分化、肾小管间质进行性纤维化的内在启动机制 ；逆向分化后的肾小管上皮细胞表达间充质细胞的标志α-SMA。Pax2并非独立作用的，其与WT1等一系列基因是相互作用、相互影响的，Pax2的双峰表达 模式证明了这一观点。 (2)慢性肾损伤肾小管上皮细胞逆向分化机制研究——肾脏局部RAS与Pax2之间的关系目的：观察体外培养NRK-52E细胞模型 在局部RAS变化时，肾小管上皮细胞内Pax2的表达和变化情况。探讨肾脏局部RAS变化与Pax2基因之间的内在联系。小结：RAS与：EMT有明确关联，在体 外RAS能够激发。肾小管上皮细胞发生逆向分化，表达肾脏胚胎发育基因Pax2，体外启动肾小管上皮细胞发生逆向分化。 3、肾小管上皮细胞逆向 分化与干细胞潜能的获得目的：体外建立局部不同浓度的RAS环境，观察PETC细胞(NRK-52E)CD133分子的表达和变化情况及其与Pax2的关系。 小结 ：逆向分化的过程是肾小管上皮细胞转化为组织干细胞对组织损伤进行修复的可能途径，上皮细胞通过逆向分化获得干细胞的潜能，表达肾组织干细胞 标志CD133分子。 结论：Pax2是控制胚胎肾小管上皮细胞分化、发育的关键基因，在肾小管上皮细胞发育成熟后，Pax2表达几近消失。肾脏受损后 ，Pax2在成年鼠肾小管上皮细胞中又可出现短暂重新表达，表现出开放-关闭-重新开放的表达模式，可能是肾小管上皮细胞发生逆向分化以及肾间质进 行性纤维化的内在启动机制。Pax2并非独立作用的，其与WT1等一系列基因是相互作用、相互影响的。RAS作为胚胎期肾脏发育的过程中的重要的调控因 子，能够刺激肾小管上皮细胞发生EMT并且表达Pax2和肾脏干细胞标志CD133。发生逆向分化的肾小管上皮细胞获得干细胞潜能，对受损的肾小管上皮细 胞进行修复。而由于特定的肾脏局部环境作用，逆向分化的肾小管上皮细胞只能起到消极的修复作用，导致肾小管间质的纤维化。 6.期刊论文 夏慧玲.刘必成.张晓良.刘殿阁.吴冀宁.张建东.弓玉祥.XIA Hui-ling.LIU Bi-cheng.ZHANG Xiao- liang.LIU Dian-ge.WU Ji-ning.ZHANG Jian-dong.GONG Yu-xiang 整合素连接激酶在梗阻性肾病肾小管上皮细胞 转化中的作用 -中华病理学杂志2007,36(1) 目的 观察整合素连接激酶(ILK)在单侧输尿管梗阻小鼠(UUO)肾脏中的表达,并探讨其在肾小管上皮细胞转化中的作用.方法 将10周龄健康雄性CD- 1小鼠随机分为假手术组(C,n=20)和UUO组(n=40),分别于术后1、3、7、14 d处死小鼠.采用Masson染色观察肾间质纤维化程度;用免疫组织化学(SP法)的 方法 观察ILK、E-钙黏蛋白(E-cadherin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达;Western blot半定量梗阻侧肾组织ILK的蛋白水平;用即时荧光逆转 录聚合酶链反应(RT-PCR)检测ILK、E-cadherin和α-SMA mRNA的表达.结果 免疫组织化学显示ILK在假手术组只有微量表达,主要位于肾小球脏层上皮细 胞,UUO术后1 d ILK蛋白表达显著增多(t=16.5,P＜0.01),7 d达高峰.术后3 d肾小管上皮细胞及肾间质α-SMA阳性细胞数显著增多(t=21.0,P＜0.01),肾 小管上皮细胞表达E-cadherin明显减少(t=5.6,P＜0.01).根据免疫组织化学结果 分析,术后1～7 d,ILK蛋白表达与α-SMA蛋白表达呈正相关 (R=0.88,＜0.01),与E-cadherin表达呈负相关(R=-0.87,P＜0.01).Western blot结果 显示ILK蛋白表达于术后1 d明显增加,7 d达高峰,14 d表达不再增 加(P＞0.05).RT-PCR结果 显示术后l d ILK mRNA表达增多(t=141.6,P＜0.01),E-cadherin mRNA表达于术后3 d显著减少(P＜0.01),α-SMA mRNA表达于 术后3 d开始增多(P＜0.01).结论 UUO模型早期整合素连接激酶表达增高,可能通过介导肾小管上皮细胞-间充质转化而参与肾脏纤维化的发生发展. 7.期刊论文 黄大伟.傅博.陈香美.刘维萍.汪杨.HUANG Da-wei.FU Bo.CHEN Xiang-mei.LIU Wei-ping.WANG Yang 细胞混合种植法构建生物人工肾小管的初步研究 -中国药物与临床2008,8(3) 目的 为构建一种既有滤过及抗凝功能、同时又有重吸收及内分泌功能的新型生物人工肾小管提供实验基础.方法 以层黏连蛋白0.74 mg/ml包被的 AV400滤器为载体,将转染人Nanog基因的血管内皮细胞(ECV304)悬液与转染人Nanog基因的肾小管上皮细胞(HKG)悬液等体积混匀,分次注入实验组滤器内 腔,构建生物人工肾小管.对照组只在层黏连蛋白包被的AV400滤器内腔注入不含细胞的培养基.采用PKH26、PKH67标记法分别观察ECV304、HKC在聚砜膜中 空纤维上的分布;应用扫描电镜检测混合细胞在聚砜膜中空纤维上的生长状况及形态.结果 混合细胞能在聚砜膜中空纤维上较好地黏附、生长.PKH26、 PKH67标记检测发现细胞呈致密点片状分布;扫描电镜观察可见细胞形成单层片状.结论 两种转染