高效分子排阻色谱法测定头孢硫脒聚合物含量

海峡药学 2010年 第 22卷 第 3期 表 2 不同温度下热力学参数 如表 2所示，MACA与 HAS作用的 AH和 AS分别为一 25．39 kJ·mol一 和 18．2O kJ·mol一1。根据经典文献【l0j表明， 当 △S>O。表明化合物的形成是放热反应，分子间作用为疏水 相互作用；在静电相互作用下 AH是非常小，几乎为零；当AH <0，分子作用主要为氢键作用。在本文中，测得 MACA与蛋 白质作用 AH为负值和 AS为正值．说明氢键和疏水作用在两 者相互作用中发挥了重要作用。 参考文献 [1]Lima SAC．Cordeiro—da—SilvaA，de CastroB，eta1．．Sensitivity of P．glycoprotein tryptophan residues to benzodiazepines [J]． Biophys．Chem，2007，125(2)：143—150． [2]杜江燕，黄晓华．徐飞等 ．硫荃与 DNA分子作用机理的光谱研究 O]。光谱学与光谱分析，2005，25(9)：1435—1438． 【3】孙伟，刘晓云 ．电化学法研究蛋白质和茜素红 S的相互作用(J]． 分析化学，2002，30(3)：312—314． (4]Papadopoulou A，Green R J，Frazier R A．Interaction of flavonoids with bovine serum ~bumin：a fluorescence quenching mudy【j】．A· gric．Food Chem。2005，53(2)：158—163． [5]金芬 ．光谱法研究生理条件下药物与蛋白质相互作用：【硕士学位 论文]．上海：华中师范大学分析化学系．2007． (6]李锐，任海平，孙艳亭 等 ．小分子与生物大分子间非共价相互作 用分析方法研究进展 [J]．分析化学评述与进展：2006。34(12)： 1801—1806． (7]陈国珍．黄贤智．许金钩编 ．荧光分析(第二版)(M]．北京：科学 出版社，1990，pl15—121． [8)Jing Jin，Jingfeng Zhu，Longmin Wu．Study on the binding of farrerol to human serum albumin[J]．Journal of Photochemistry and Photobi- ology，2007，191(6)：59—65． [9]陈鸿琪，夏闽 ．荧光染料吖啶红作测定蛋白质的生物探针[J]．理 化检验．2001．37(2)：53—55． (10]P D Ross，Subramanian。Thermodynamics of Protein association reac— tion forces contribution to stability[J]．J Biochemistry，1981。20(4)： 3096—3102． 高效分子排阻色谱法测定头孢硫脒聚合物含量 晏会根f福建省天健制药有限公司 三明 365001) 摘i要：目的 建立以凝胶色谱柱的分子筛机制为分离原理的高效分子排阻色谱法测定头孢硫脒聚合物含量。方法 采用TSK． GELG2000SWxL柱(7．8ramx 30 cm，5 m)，以O．01tool·L一 醋酸铵溶液：乙腈(93：7)为流动相．流速0．5mL·rainI1；检测波长254nm。结果 头 抱硫胖浓度在0．4～2．0mg·mL 范围内与聚合物的峰面积呈良好的线性关系(r=0．9989)。结论 本方法简便快速，定量准确，重现性好，可 用于头抱硫脒聚合物 的含量测定。 关键词：高效分子排阻色谱法；头抱硫脒；头孢硫脒聚合物 中图分类号：R969．4 文献标识码：A 文章编号：1006．3765(2010) 02．0062．03 Determination of the polymer in Cefathiamidine by HPSEO YAN Hui-gen(Fujian Tianjian Pharmacy Co．，Ltd，Sanming 365001，China) ABSTRACT：OBJECTIVE HPSEC method was established for the determination of the polymers in cefathiami— dine．METHODS A TSK—GEI G2000SWxL column(7．8mm X 30cm，5Mm)was used with the mobile phase Of 0．Olmo卜I sodium acetate buffer：acetonitrile(93：7)at a flow rate of 0．5mI ·min_。。and the detection wave． 1ength was set at 254nm．RESULTS Under the established chromatographic conditions．The standard curve iS linear within the range of 0．4～2．0mg·mI _’with the correlation coefficient of 0．9989．CONCLUSION The method iS proved to be accurate，sensitive and suitable for the determination of cefathiamidine polymer． KEY WORDS：HPSEC；cefathiamidine；cefathiamidine polymer 作者简介：晏会根．男．高级工程师．主要从事化学制药和新药研发。 联系电话：(0598)8300769，E—mail：yhg1963yahoo．com．cn · 62 · 头孢硫脒是由我国自主研制并荣获国家技术发明奖的头 孢菌素类全身抗感染药物【l】。由于其基本结构同已上市的许 多半合成的 p内酰胺类抗生素一样，头孢硫脒也会形成高分 Strait Pharmaceutical Journal Vol 22 No．3 20 1 0 子聚合物，也会在临床使用中引发速发型过敏反应。对患者危 害极大【2J。已有的注射用头孢硫脒国家药品未将头孢硫 脒高分子聚合物列为检定项目，国内的药学研究也主要集中 在头孢硫脒的合成与纯化[3l。头孢硫脒及其制剂的纯度、含量 及相关杂质测 定【4】，以及其降解产物的检测等方面【5J，未见 头孢硫眯高分子聚合物的研究和报道。从临床用药安全性考 虑，我国已在此类药品注册和上市药品质量检验中要求检定 高分子聚合物，(oe国药典)2005年版二部【6]已就 8一内酰胺类 抗生素中高分子聚合物含量测定制定了相应的和验证方 法，因此对头孢硫脒进行聚合物检测是势在必行。 本文在有关预试验的基础上，根据中国药典 2005年版二 部附录 v H和凝胶色谱原理。采用高效分子排阻色谱法，以 亲水硅胶高效体积分子排阻色谱柱。 (TSK—GELG200OSwxL)，以 1％浓度的主成分为外标， 在同一个色谱体系中检查头孢硫脒聚合物含量。 l 仪器与试药 Series nl高效液相色谱系统(Model 201 紫外检测器、La— bAlliance中文色谱工作站)。 注射用头孢硫脒(批号：080901、080902、080903，规格均 为0．5g)，山福建省天健制药有限公司提供 ：头孢硫脒对照品 (批号：130523—200702；含量：98．3％)由中国药品生物制品 检定所提供；乙腈为色谱纯，水为重蒸馏水，醋酸铵为分析纯。 2 色谱条件 色谱柱 ：TSK—GELG2000SWxL柱(7．8mm×30cm，5tLm)； 流动相：0．Olmol·LI1醋酸铵溶液 ：乙腈 (93：7)；检测波长： 254nm；流速 ：0．5mL·min一 ；进样量 ：20 L。 3 系统适 用性 图 1 对照品 图 2 供试品 在该色谱条件下。头孢硫脒的主峰保留时间约为 22min。 理论板数以头孢硫脒计约为 20000；头孢硫脒聚合物与头孢 硫脒峰的分离度大于 2．5。对照品溶液和供试品溶液的色谱 图(见图 1)，对 照品溶液的图谱 (见图 2)，供试品溶液的图 谱)。 4 实验方法与结果 4．1 头孢硫脒对照溶液线性范围 取头孢硫脒对照品10．0 mg，精密称定，加流动相溶解并分别稀释制成每 1mL中含头 孢硫脒 2⋯4 6 10、20、40gg·mLI1的溶液，摇匀，分别精密量 取 20t~L进样，色谱图。以头孢硫脒 的浓度 为横坐标 (X)，以主峰面积为纵坐标(Y)，求得回归方程：Y=496．2+ 47775．6X，r=0．9999。结果表明。在上述色谱条件下．头孢硫 脒浓度在 2～4O g·mL 范围内与峰面积呈 良好的线性关 系。 表 1 头孢硫脒对照溶液线性关系 4．2 头孢硫脒对照溶液稳定性 取头孢硫脒对照孢 品10．0 mg，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每 1mL中含头孢硫 脒 lOng的溶液，摇匀，室温放置，分别于 0⋯1 2 4、6、8h。精密 量取 20"L进样，记录色谱图，测定主峰面积，考察对照溶液 的稳定性。不同时间测定的主峰面积RSD为0．52％，表明在 一 个工作闩范围内，室温条件下溶液稳定性 良好。 表 2 对照溶液的稳定性 时间(h) 0 1 2 4 6 8 主峰面积 477207 477912 474733 471021 474242 474394 平均主峰面积 474918 RSD(％) 0．52 4．3 头孢硫脒对照溶液进样精密度 取头孢硫脒对照品 10．0mg，加流动相溶解并稀释制成 每 1mL中含 头孢硫 脒 lOug的溶液，摇匀，作为对照溶液。按上述色谱条件，取对照 溶液连续进样 6次，记录色谱图，测定主峰面积。考察精密度。 RSD为 0．39％，表明精密度 良好。 表3 对照溶液精密度 编号 1 2 3 4 5 6 主峰面积 477207 474939 477912 476102 474733 472823 平均主峰面积 475624 RSD(％) 0．39 4．4 头孢硫脒聚合物进样精密度 精密称取注射用头孢硫 脒(批号：080901，规格：0．5g)同一样品 6份，用流动相溶解并 稀释制成每 1mL中含头孢硫脒 lmg的溶液，摇匀，作为供试 品溶液。按上述色谱条件。分别立即进样，记录色谱图，计算 聚合物含量。RSD为 4．2％。表明有较好的精密度。 4．s 头孢硫脒与聚合物的线性关系 取注射用头孢硫脒(批 号：080901。规格：0．5g)，精密称定。用流动相溶解并分别稀释 制成每 1mL中含头孢硫脒 0．4、0．7、1．0、1．5、2．Omg的溶液， · 63 · 海峡药学 2010年 第 22卷 第 3期 摇匀．按上述色谱条件，精密量取 2O L立即进样分析．记录 色谱图。以头孢硫脒的浓度为横坐标(X)，以聚合物的峰面 积为纵坐标(Y)，求得回归方程：Y=1193．5+22764．6X，r= 0．9989。结果表明，头孢硫脒浓度在 0．4--2．0mg·mL 范围 内与聚合物的峰面积呈良好的线性关系。 表4 头孢硫脒聚合物进样精密度 表 5 供试品溶液浓度与聚合物峰的线性关系in=5) 4．6 供试品溶液稳定性 取注射用头孢硫脒(批号：080901， 规格：0．5g)。精密称定，用流动相溶解并稀释制成每 lmL中 含头孢硫脒 1．0mg的溶液，摇匀，室温放置，分别于 0、1、2．5、 5、6．5h，精密量取 20vL进样，记录色谱图，按面积归一化法 计算头孢硫脒聚合物的含量，考察供试品溶液的稳定性。结 果表明供试品溶液中聚合物含量随时间逐渐增大，故供试品 溶液应临用现配。 表 6 供试品溶液稳定性 4．7 供试品中聚合物含量测定 供试品溶液；取批 号为 080901、080902、080903(规格均为 0．5g)的注射用头孢硫脒 样品，精密称取适量，用流动相溶解并稀释制成每 1mL中含 头孢硫脒 lmg的溶液，摇匀，即得。 对照溶液：取头孢硫脒对照品适量，精密称定，加流动相 溶解并稀释制成每 lmL中含头孢硫脒 lvg的溶液．即得。 分别立即精密量取供试品溶液和对照溶液各 20vL进 样，记录色谱图。按外标法以峰面积计算头孢硫脒聚合物的 含量 。 表 7 供试品的聚合物测定 5 讨论 · 64 · 5．1 检测波长选择 将注射用头孢硫脒溶液及聚合物流出 接收液于200～400nm波长内进行扫描，结果显示溶液在 254nm波长处有较明显吸收，故选择 254nm为测定波长，峰 形好。无干扰。 5．2 流动相的优化 按药典方法。采用分子排阻色谱法(中 国药典 2005年版二部附录 V H)，用葡聚糖凝胶柱(Sephadex G一1O。10．0mm×30mm)。以 pH8．0的磷酸盐缓冲液(O．5tool ·LI1磷酸氢二钠溶液 一0．5tool·L-1磷酸二氢钠溶液(95：5)] 为流动相 A。以水为流动相 B，检查头孢硫脒聚合物。在流动 相 A中头孢硫脒聚合物峰与头孢硫脒峰分离差，且在流动相 B中头孢硫脒很难缔合，影响检测结果。 分别以 pH值 7．0的磷酸盐缓冲液 一乙腈(95：5)。pH值 7．0的磷酸盐缓冲液，0．01mol·L 醋酸铵溶液 ：乙腈(93：7) 为流动相进行实验。结果表明，在前两种流动相中分离效果 不理想，主峰拖尾因子大。在 0．01m0】·L 醋酸铵溶液：乙腈 (93：7)流动相中，聚合物峰与主峰分离度好，拖尾因子合适， 理论板数高，所以选择 0．01mol·LI1醋酸铵溶液：乙腈(93：7) 为流动相。 5．3 试验要求及聚合物峰的判定 经试验，选择用水为流动 相．用葡聚糖凝胶柱(Sephadex G一10，10．0mm～30ram)接收 聚合物流出液后在亲水硅胶高效体积排阻色谱杜(TSK— GELG2000SwXL。7．8ram×30cm，5 m)系统中分析，头孢硫脒 主峰前杂质峰均为聚合物峰。聚合物的形成是一个动态过 程。聚合物的含量会随时间延长而增大，故测量聚合物的含量 时应在溶液配制后立即进样。 5．4 专属性试验 将供试品溶液boo．itool·LI1的氢氧化钠 溶液后室温放晋 10rain，用 0．itool·L 盐酸溶液调节 pH值 至中性，滤过，取滤液进样分析，头孢硫脒峰与聚合物峰分离 良好，表明本色谱系统条件专届性良好。 参考文献 [1]蔡德山等 ．头孢硫脒的开发与成果转化(J]．中国医药经济与技 术管理 ．2008，2(6)：20． [2]江晓玲等 ．头抱菌素类抗生索中高分子杂质的研究进展 【J]．国 外医药抗生素分册，2007．28(6)：264． [3]刘学斌等 ．头孢硫脒纯化新方法 [J)．中国抗生索杂志．2007。32 (10)：585． [4]杜旭等 ．HPLC法测定头孢硫脒及其制剂的含量和有关物质[J]． 天津药学．2007．19(1)：25． [5]叶放等 ．头抱硫脒降解产物的Lc—Ms分析(J]。中国抗生素杂 志，2005．30(12)．741． 【6]国家药典委员会编 ．中国药典Cs)．2005年版，北京：化学工业出 版社，2005，二部