人乳腺癌细胞系MCF-7中不同亚群细胞的体内外克隆和成瘤能力分析

四川大学学报‘医学版；2008，39(4)J SiebuanUniv(MedSciEdi ：547—549) ’ ⋯’一 人乳腺癌细胞系MCF一7中不同亚群细胞的 体内外克隆和成瘤能力* 李 治，刘春萍，贺艳丽，田 元，黄 韬△ 华中科技大学协和医院乳腺甲状腺外科(武汉430022) 【摘要】 目的 了解在人乳腺癌细胞系MCF一7中是否存在乳腺癌干细胞。方法采用流式细胞技术对MCF- 7细胞进行分选，检测MCF一7中不同亚群细胞的体外克隆形成能力和体内成瘤能力。结果MCF一7中有部分细胞 具有体外克隆形成能力和体内成瘤能力，而且和CD44+CD24+细胞相比，CD44+CD24一细胞中成瘤细胞的含量更 高。结论MCF一7中存在乳腺癌干细胞，并主要集中于CD44+CD24一细胞中，CD44+CD24+细胞也可能是乳腺癌祖 细胞。 【关键词】干细胞乳腺癌 自我更新 动物模型 【中图分类号】R737．9 AnalysisonClone／nvitroandTumorigenicCapacity／nvivoofDifferentSubsetsCellsFromtheMCF一7Human BreastCancerCellLineLIZhi，LlUChun-ping．HEYan-li，TIANYuan，HUANGT∞△．Departmentof BreastandThyroidSurgery，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceand Technology，Wuhan430022，China [Abstract]ObjectiveToinvestigatewhethertherearecancerstemcellsintheMCF一7humanbreastcancer cellline．MethodsFlowcytometryWasappliedtoseparatedifferentsubpopulationcellsfromMCF一7cells，and theirabilityofclonein口itroandreconstructiontumorinV／voweredetermined．ResultsTheabilityofclonein 口打roandreconstructiontumorinvivowereobservedinsomeMCF一7cells．ContrastwithCD44+CD24+ceils。the proportionoftumorigeniccancercellsinCD44+CD24一cellsishigher．ConclusionBreastcancerstemcellexists inMCF-7anditmainlylocatesthesubpopulationofCD44+CD24一cells．CD44+CD24+cellpossiblyisbreast cancerprogenitorcell． [Keywords]Stemcell BreastcancerSelf—renewalAnimalmodel 肿瘤干细胞的发现已经使研究者们从一个崭新 的角度去认识肿瘤的起源和治疗。目前已经陆续从 白血病细胞、乳腺癌细胞以及中枢神经恶性肿瘤细 胞中将这一小群细胞成功地加以分离，并在相关的 动物模型实验中鉴定、验证了肿瘤干细胞的存 在‘卜3。。而在AI—Hajj等‘33鉴定了人乳腺癌干细胞分 子型为Lin—CD44十CD24一后不久，Kondo等[4]认 为体外可长期培养的肿瘤细胞系MCF一7中也存在 着类似的肿瘤干细胞。在此基础上，我们研究了 MCF一7中不同亚群细胞的体内外克隆、成瘤能力。 1与方法 1．1细胞来源和培养条件 人乳腺癌细胞系MCF一7由本院普外科实验室 提供。采用10％胎牛血清(FBS)一1640，在37"C、5％ *国家自然科学基金(批准号30571798)和湖北省十一五重大 科技攻关项目(批准号2006AA301A05)资助 △Correspondingauthor，E-mail,huangtaowh@163．com CO。条件下培养。 1．2流式细胞仪的检测与分选 用0．25％胰蛋白酶消化液将培养后的MCF一7 细胞制备成单细胞悬液，用PBS溶液洗2次；加入 相应的荧光标记抗体(CD44一APC、CD24一PE)和 7AAD[3]，置于4℃孵育20min；再用PBS溶液洗2 次后开始进行流式细胞检测和分选。每次分选都重 复上机两次，最后检测细胞纯度>95％，然后将分选 后的细胞亚群用10％FBS一1640重悬细胞，计数备 用。 1．3细胞体外克隆培养 将分选后不同亚群的MCF一7细胞用10％FBS一 1640重悬后接种到6孔板内，每组3孔，每孔含1× 103个细胞。①贴壁培养法：每孔3mL细胞悬液，充 分震荡混匀后进行培养；②半悬浮培养法：先用1 mL1．2％低熔点琼脂糖溶液+1mL20％FBS一 1640／每孔(1：1混匀)铺底，待其自然凝固后，将1 mL0．7％低熔点琼脂糖溶液+1mI。20％FBS一1640 的细胞悬液在37～38℃条件下充分吹打混匀后加 548 四川大学学报(医学版)2008年第39卷第4期 目_-_l，===目====E=；=目=目t=={；；；==_·_-_l__--·-·=j目-_自===_·__··一i_·-···_--__={=======jE_IE=================；l==目目==#；====；======；口口l=====自==__======一 入，自然凝固后进行培养。 1．4细胞接种裸鼠的体内成瘤能力测定 将分选并计数后的MCF一7细胞用PBS溶液重 悬，4℃下保存运输，调整细胞浓度后接种在裸鼠的 腋窝皮下，两侧接种细胞量同为1000个细胞／侧 (100肛I。细胞悬液)，右侧接种CD44+CD24一细胞， 左侧接种CD44+CD24+细胞，每组10只裸鼠，接种 后观察6月。 用有限稀释移植法(1imitingdilution transplant)[“63计算不同亚群细胞中成瘤细胞的含 量。接种方法同上，每组8只裸鼠，每组的接种细胞 量逐步递增，CD44+CD24一组分别为10个／只，30 个／只，50个／只，100个／只，200个／只，CD44+ CD24+组分别为30个／只，50个／只，100个／只，200 个／只，400个／只。接种后观察6月，成瘤细胞的含 量一肿瘤形成数／接种细胞总数。 1．5统计学方法 对裸鼠的肿瘤形成率进行X2检验，对肿瘤发生 时间进行配对t检验，a=0．05。 2 结果 2．1 MCF一7细胞CD44和CD24的表达 与人乳腺癌原代细胞主要由CD44+CD24一和 CD44一的两群乳腺癌细胞组成不同，MCF一7细胞主 要由CD44+CD24一和CD44+CD24+的两群乳腺癌 细胞组成，见图1。 +，．≯ ．}， t曩 耩辫。：．，：％ 圈1 MCF-7细胞和人乳腺癌原代细胞的CD44和CD24表达 Fig1 ExpressionofCD44andCD24withMCF‘7cellsandhuron primarybreastcancercells AlMCF一7cells；Bl Humanprimarybreastcancercells 2．2 MCF一7细胞中不同亚群细胞的体外克隆形成 比较 在半悬浮培养状态下，MCF一7细胞中的CD44+ CD24一细胞在早期(第1周)形成克隆的体积略小于 CD44+CD24+细胞，但是后期时(第3周)两群细胞 形成克隆的体积基本相等；而且CD44+CD24一细胞 的克隆形成率明显高于CD44+CD24+细胞(图2A 和2B)。 图2 MCF一7中不同亚群细胞的体外克隆形成结果 Flg2 ResultofclonewithdifferentsubsetscellsfromMCF·7cells invitro Al CD44+CD24一cells；Bl CD44+CD24+cells(Semi— suspensionculture2 weeks，observationwiththenakedeye)；C； CD44+CD24一cells(×400)lD；CD44+CD24+cells(×100) (Adherenceculture2 weeks。observationwithphasecontrast microscope) 在贴壁培养状态下，MCF一7细胞中两群细胞的 总体克隆形成率基本相似，但是CD44+CD24一细胞 的分裂现象不如CD44+CD24+细胞明显。少数的 CD44+CD24一细胞以体积的明显增大为主(图2C)， 而CD44+CD24+细胞则有明显的叠加生长现象(图 2D)。 2．3 MCF一7细胞中不同亚群细胞的裸鼠接种结果 将分选后CD44+CD24一和CD44+CD24+亚群 的MCF一7细胞接种于裸鼠腋下6月后，其肿瘤发生 时间分别为(67士11)d和(137±24)d，其差异具有 统计学意义(P