原花青素对淀粉样肽诱导PCI2细胞基因表达影响

中革葛ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第3期2006年3,El·405· 94．4％)，不影响测定的准确度。鸟§方法学验证，新建 立的测定方法符合药动学要求“]。据文献报道n]，猕 猴ivGI．Q223300pg／kg后，药物在体内的消除半 衰期81／2F为(3．7士1．5)h。本实验结果显示，猕猴iv MTCS220pg／kg后，药物在体内的消除半衰期 “Ⅲ为(3．8±1．4)h。说明MTCS与天然的天花粉 蛋白的体内过程基本一致。 References： f1]YeungHW，NgTB．Chemicalaodbio]oglealcharacteriza— tionofthegalactosebindinglectinsfromTr&hosantheski— rilowiiroottubers[J3IntdPeptProteinRes，1986，27 (2)：208—220 C23gahnjO．GoreliekKJ，GattiG，“a／．Sa{ety，activity， andpharmacoklneticsofGLQ223inpatientswithAIDSand AIDSrelatedcomplex[J]．AntimtcruhAgentsCh—ther 1994，88(2)：260—267． [3]ZhaoJ，BenLH．AntiHIVAgenttrichosanthinenhances thecapabilitiesotehemokinestostimulateehemotaxisandG proteinactivation，andthisismodiatodthroughinteractionof trichosanthinandchemokinereceptors[J]．JExpMed， 1999，190(1)：101—111 [4]GattiG．KahnJOPharmacokinetiesofGLQ223inrats， monkeys．andpatientswithAIDSorAIDS—relatedcomplex [J]．AntimicrobAgentsChemother．199l，38(12)：2531— 2537． Is]Zhang1P．Ph㈣，№yEz}⋯Ⅲt“(药理学实验)m3． 2nded Beijing：People 7 sMedicalPublishingHouse，1996， [6]LiucX，WeiGL，LiQS．Methodologystudiesofvalida— tionforbioanalysisin studiesofpharmacokineticsand kAoavailabdity[』]．AsianJDrugM±-tabPharmacokinet， 2001，l(4)：279286。 原花青素对p一淀粉样肽25—35诱导PCI2细胞par一4 和bcl一2基因达的影响 梅寒芳1，谢朝阳2，扬红1，祝其锋” (1．广东药学院生物化学教研室．广东广州 510006；2．广东医学院生物化学与分子生物学研究所，广东湛江524023) 掎要：且的探讨原花青索(Pc)对p淀粉样肚(A＆s，s)诱导凋亡PCI2细胞par一4和bcl2基因mRNA和蛋 白表达的影响。方法采用MTT比色法细胞存活率，Hoechst33258+PI荧光染色法检测细胞凋亡，RT—PCR 方法检测PCI2细胞par一4和bcl一2基因mRNA的表达，Westernblotting检测PCI2细胞Par一4和Bcl一2蛋白表 达。结果不同剂量(5、10、20、30mg／L)PC预处理PCI2细胞1h可剂量依赖性对抗Ap挣as引起的细胞礴亡，提 高PCI2细胞的存活率，减少A日脊。；引起的PCI2细胞核固缩、凝聚和碎裂，降低par一4基因mRNA表达及蛋白表 达，增加bcl一2基因mRNA表达爱蛋白表达。结论PC可剂量依赖性对抗ApzⅢs对PCI2细胞的毒性作用，其机 制可能与下调凋亡基因par一4和上词抗凋亡基因bcl一2表达有关。 关键词：原花青索(PC)；A口25刚PCI2细胞；细胞摘亡；par一4{bcl一2 中圈分类号：R285．5 文献标识码：A 文章编号：02632670(2006)03—0405—04 Effectofprocyanidinsongeneexpressionofpar‘‘4andbcl—r2 inPCI2cellsinducedbyA1325—35 MEIHan—fan91，XIEZhaoyan92，YANGHon91，ZHUQifen92 (1．OepartmantofBiochemistry．GuangdongPharmaceuticalCollege，Guangzhou510006·China；2．Institute ofBiochemistryandMolecularBiology，GuangdongMedicalCollege，Zhanjiang524023，China) Abstract：ObjectiveTostudytheeffectofprocyanidins(PC)onmRNAandproteinexpressionof par一4andbcl一2genesinPCI2cellsinducedbyAp25_35．MethodsCellsurvivaIratewasevaluatedbyMTT assayandapoptosiswasanalyzedbyHoechst33258一PIfluorescencestaining．TheexpressionsofmRNA andproteinforpar一4andbcl一2weretestedbvRT—PCRandWesternblotting．ResultsPretreatmentwith differentconcentrationsofPC(5、10、20．and30mg／I，)forl hincreasedthesurvivaIrateofPCI2eelIina dose—dependentmanner．PCpreventedthePCI2cellsnucleifromshrinkage，condensation，andcleavage inducedbyAp25m．PCdecreasedtheexpressionofpar一4mRNAandprotein，andincreasedtheexpression 收穰日期；2005—0614 基盒项目t广东省重点学科重点项目资助(9808， 作者简介t拇塞芳(1977一)，女．黑龙扛牡丹江人，硕士，助教，主要从事衰老生化研究 Td：(020)89239472I3602463964E—mail：meihf37@183conl *通讯作者祝其锋Tel{(0759)2388850 万方数据 中革喃ChineseTraditionalandHerbalDrugs第37卷第3期2006年3月 ofbcl一2mRNAandprotein．ConclusionPCcanprotectPCI2cellsfromapoptosisinducedbyAB2w5ina dosedependentmanner．Themechanismofprotectionislikelyrelatedtodecreasingthepar一4geneexpres— sionandincreasingthebcl一2geneexpression． Keywords：procyanidins(PC)}pamyloidpeptide“35(Ap25-35)；PCI2cells；apoptosis；par一4；bcl一2 p淀粉样肽(pamyloidpeptide，Aft)是阿尔茨 海默病(Alzheimer’sdisease，AD)的特征性病理 改变——老年斑的重要成分n3，A口在脑实质中沉积 与AD的发病密切相关，目前常用A恕sm诱导体外 神经毒实验的AD模型。原花青素(procyanidins， PC)是植物中广泛存在的一种多酚化合物，是植物 体内天然的抗氧化物质，富含于葡萄、山楂、花生等 植物中，其生物学活性广泛，如抗氧化、抗炎、抗突 变、抗病毒、抗真菌等口]。目前对于PC的研究，多集 中于抗癌、抗缺血一再灌注损伤等。前期研究发现PC 对n13。。。诱导体外培养的PCI2细胞凋亡有保护作 J月”。本实验将进一步对PC保护作用的机制进行 探讨。 1材料 PCI2细胞由军事医学科学院基础医学研究所 马子敏博士惠赠；AB。；。。购于Sigma公司(用时以 pH7．4的PBS溶解)；原花青素(Pc)购自南京学 子医化研发中心，为葡萄籽提取物，质量分数大于 95％；各种规格培养皿均为美国CorningCostar公 司产品；DMEM及马血清均购自Gibco公司；胎牛 血清为杭州四季青公司产品；琼脂糖为Amreseo公 司产品；小鼠抗大鼠Par一4多克隆抗体、兔抗大鼠 Bcl一2多克隆抗体均为SantaCruz公司产品； MML—V逆转录酶、TaqDNA聚合酶、Oligod(T)、 RNAsin为Promega公司产品；100bpDNAmark er为华美生物公司产品；其余试剂为国产分析 纯；引物为上海生物工程公司合成。 2方法 z．1 细胞培养oJ：PCI2细胞在DMEM基质中培 养，其中加10％灭活马血清、5％胎牛血清、100U／ mL青霉素及100mg／ml。链霉素，于37C、5％ CO。培养箱中培养。 2．2实验分组：每次实验均分为对照组(opmol／L A8：。。)、诱导组(10#mol／I，Ap。。。)和药物保护组 (PC+AB：”s)，每组至少重复3次。 2．3 MTT法检测细胞存活率：取对数生长期的 PCI2细胞以1×108／L接种于96孔板，培养24h， 分别加入不同终质量浓度(5、10、20、30mg／I，)PC 预处理lh，再加入10FLmol／LA口：。。，继续培养20 h，每孔加入MTT(5g／I。)15pL，继续培养4h，倒 出培养液，每孔加入DMSO10pL，摇床震摇10～ 15min，待紫色结晶完全溶解后，用M450型 ELISAReader酶标仪检测各组细胞的吸光度(A) 值，以A。。／A。。代表细胞活力，并以0vmol／l。 Ap。。作为对照组，其细胞存活率为100％，计算其 余各组细胞存活率。 存活率=弓毳器器黼X100％ 2．4细胞凋亡的细胞核形态学检测：取对数生长期 的PCI2细胞以2×10s／L接种于67L板，每孔2 mL，培养24h，分别加入不同终质量浓度(10、20、 30mg／L)PC预处理1h，再加10umol／LAB25_35， 继续培养24h，收集细胞于1．5mLEP管中，冷 PBS(pH7．4)洗2次，每管加Hoechst33258至终 质量浓度为5mg／L和PI至终质量浓度为50mg／ L，37℃避光孵育30min，于荧光显微镜下观察并 拍照。 2．5 RT—PCR检测par一4和bcl一2基因mRNA表 达：取对数生长期的PCI2细胞以2×108／L接种于 6孔板，每孔2mL，培养24h，分BU加入不同终质量 浓度(10、20、30mg／L)PC预处理1h，再加10 ttmol／LA口zs_35，继续培养24h，收集细胞，提取总 RNA，用紫外分光光度仪测定A。。⋯／A。。。，比值 在1．7～2．0，计算RNA质量分数。引物设计：(1) Ratpar一4：正义引物：5’一ATCCCCGAACA— GATAGAAGT一3，L“，反义链：5’一AAAAGCAGG— TTTCCCACAC一3’(扩增产物340bp)；(2)Ratbcl一 2：正义引物：5’一CTGGTGGACAACATCGCTC— TG一3““，反义链：57一GGTCTGCTGACCTCAC— TTGTG一37(扩增产物227bp)。逆转录体系：总 RNA5弘L(2肛g)、Oligod(T)2ttlu5×M—MLV 缓冲液5pL、dNTP(每一种浓度为2．5mmol／L) 混合物5弘L、M—MLV(2×108U／L)1pL、RNasin (4×107U／L)1pL、DEPC处理水6ttL，总体积25 pL，稍离心后混匀，42℃水浴60min。合成的cD- NA于一20℃保存备用。从上述反应体系中取5 pLcDNA，加10×缓冲液5弘L、dNTP(每一种浓 度为2mmol／L)5pL、GAPDH正反义引物(6．25 umol／L)各1bLL，par一4正反义引物(25ttmol／L) 万方数据 中革药ChineseTraditionalandHerbalDrags第37卷第3期2006年3月·407- 各1pL或bel一2正反义引物(25ttmoI／L)各l pl。Taq酶(5×106U／L)0．3pL、灭菌三蒸水29．7 pL，总体50"L，混匀，瞬间离心，于PE9600型PCR 仪上扩增。反应参数为：95℃、5min，94‘C、1min， 58℃或55c、45s，72C、1min，共30个循环，最 后72℃延伸10min。PCR产物用2％琼脂糖凝胶 电泳分离检测。 2．6 Westernblotting检测Par4和Bel一2蛋白的 表达：PCI2细胞以2×108／L接种于6孔板，每孔2 mL，培养24h，分别加入不同终质量浓度(10、20、 30mg／I。)PC预处理1h，再加10txmol／LAB％⋯ 继续培养24h，低温收集细胞，每管加100pL细胞 裂解液(50mmol／I。TrisHCl、150mmol／I，NaCl、 5 mmol／LEDTApH8．0、1％NP40、0．05％ PMSF、2mg／LAprotinin、0．5mg／LLeupeptin)， 提取蛋白，考马斯亮蓝G250染色法测定蛋白浓度， 与等体积2×上样缓冲液混匀，煮沸5min。每孔上 样50／lg，SDSPAGE分离样品。4℃、90mA、15h 将蛋白转至NC膜上，将膜封闭后，与一抗(小鼠抗 大鼠Par一4多克隆抗体1：400，兔抗大鼠Bel2多 克隆抗体1：500)室温孵育2h，洗涤，再与以1； 4000体积比稀释的二抗稀释液室温孵育1．5h，洗 涤，加入ECL试剂，暗室曝光，显影，定影，拍照，扫 描并分析。 2．7统计学处理：F与Bonferroni或Tamhane7S T。检验，采用SPSSl0．0统计软件包完成，数值用 j±s表示。 3结果 3．1 MTT结果：培养的PCI2细胞用不同终质量 浓度(5～30mg／L)PC预处理1h，再加入10 ”-mol／LA8。。继续培养24h，细胞的存活率随PC 剂量的增大而升高，具有明显的量效依赖性。5rag／ LPC即具有保护作用(JP