原花青素对佐剂关节炎大鼠滑膜细胞

原花青素对佐剂关节炎大鼠滑膜细胞 !"#$%、!&’表达的影响 王旭光!，陈根殷，杨 展 （广东医学院附属医院中心实验室，湛江 (%)**+） 摘 要 目的：研究原花青素（,-）对佐剂关节炎大鼠滑膜细胞 !"+$%、!&’表达的影响。方法：采用大鼠佐剂性关节炎 （..）模型，逆转录聚合酶链反应（/0$,-/）测定各组大鼠滑膜细胞 !"#$ %、!$% 1/2.的水平，免疫印迹法（3456478 9#:66;8<）检 测各组大鼠滑膜细胞 !"#$%、!&’蛋白表达，滑膜细胞 "&5=&54$> 酶原的裂解，比色法测定大鼠滑膜细胞 "&5=&54$> 的相对 活性。结果：正常大鼠滑膜细胞 !"#$% 和 !&’均有表达，模型组大鼠 !"#$%、!&’ 表达均高于正常组。,-（?，>* 1< @ A<）治疗组 可明显下调 !"#$ % 1/2.和蛋白的表达，上调 !$% 1/2.和蛋白表达；而 "&5=&54$> 酶原的表达随药物浓度的增加而减少，药 物组大鼠 "&5=&54$> 与对照组相比活性升高。结论：,- 可通过下调滑膜组织中 !"#$% 表达、上调 !&’ 表达，诱导 "&5=&54$> 活 化，从而诱导滑膜细胞凋亡，这可能是其治疗佐剂性关节抗炎的机制之一。 关键词 原花青素；佐剂关节炎；滑膜细胞；凋亡 中图分类号 BCD?；/E?( 文献标识码 . 文章编号 +*** F (*)D（%**C）*) F *>?( F *) !""#$%& ’" ()’*+%,’$-*+./.+& ’+ %,# #0()#&&.’+ ’" 1$2!" *+/ 1*0 .+ &-+’3.’$-%#& ’" */453*+% *)%,).%.& )*%& 3.2G HI$?@AAB，&<0($ !"#$%&’$ !()：0: ;8P456;<&64 6O4 4QQ4"65 :Q =7:&86O:"L&8;R;85 :8 6O4 4’=7455;:8 :Q !"#$% &8R !&’ ;8 5L8:P;I1 :Q &R$ SIP&86 &76O7;6;5 7&65 T*+$,-.#：U8 6O4 &RSIP&86 &76O7;6;5$;8RI"4R 7&6 1:R4#，6O4 4’=7455;:85 :Q !"#$% &8R !&’ 1/2. ;8 6O4 5L8:P;:"L645 ;8 6O4 ":867:# &8R &RSIP&86 &76O7;6;5$;8RI"4R <7:I=5 V474 &8&#LW4R 9L /0$,-/ T 0O4 =7:64;8 4’=74 55;:85 :Q !"#$% &8R !&’ ;8 6O4 5L8:P;:"L645 &5 V4## &5 6O4 "#4&P&<45 :Q =7:$"&5=&54$> V474 QI76O47 &8&#LW4R 9L 3456478 9#:66;8< T U8 &RR;6;:8，6O4 74#&6;P4 &"6;P;6;45 :Q "&5=&54$> V474 R46471;84R 9L ":#:7;1467L T/+#01$#：0O4 1/2. &8R =7:$ 64;8 4’=7455;:85 :Q !"#$% &8R !&’ V474 O;* 1 R4"74&54R &5 ;8"74&545 ;8 =7:&86O:"L&8;R;85 ":8"4867&6;:8 T 0O4 &"6;P$ ;6L :Q "&5=&54$> ;8 6O4 674&61486 <7:I= V&5 O; T 0O454 Q;8R;8<5 1; ! 收稿日期 %**C$*>$%? !通讯作者 04#：*C(E F %>DC()% K$1&;#：1&7P;8**EZ+%?[ ":1 学 报 \:I78&# :Q -O;8& ,O&71&"4I6;"&# ]8;P475;6L %**C，!"（)）： ################################################################# >?( F >?D 万方数据 研究发现原花青素对大鼠佐剂性关节炎有较强的 抗炎作用［!］，但其抗炎作用机制还不清楚。本文拟 建立大鼠佐剂性关节炎（"#$%&"’( ")(*)+(+,，--）模 型，研究滑膜组织 ./012、."3、/",4",51! 蛋白的表达 及原花青素对其的影响，探讨原花青素抗大鼠佐剂 性关节炎的作用机制。 ! 材料与方法 6 76 药品和试剂 原花青素（南京学子医化研发中心，纯度： 89:）；弗氏完全佐剂、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、 ;<=>、;?@A（美国 =+BC" 公司）；D@2 培养箱内培养，每隔 6 W 2天换培养液，待有 滑膜成纤维细胞长出组织块后，去除组织块，继续培 养，待细胞长满后，进行传代培养，大约传代 2 次后。 滑膜成纤维细胞经涂片和 I+5C," 染色，高倍镜计数 !HH个细胞，其纯度在 8V:以上。实验时用含 6V: 小牛血清的 D@2 培养箱培养 G *。 67!7! !"#1 2、!$% CDO- 表达水平测定 滑膜细胞 总 DO-抽提按试剂盒说明

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进行。采用半定量 DL1 @AD法，按一步法试剂盒步骤进行。 !"#1 2 引物为： 上 游 V[1IAL-AI-ILIII-L-ALII-I 1![，下 游 V[1 I-A-IAA-II-I---LA---A1![，产物长度为 VV8 J4，反应条件为：VH Z逆转录 !H C+’；8G Z预变性 2 C+’；8G Z变性 !H ,，V9 Z退火 6 C+’，Y2 Z延伸 GV ,， 扩增 !H个循环；Y2 Z延伸 6H C+’。!$% 引物为：V[1 A-LAA-II-LAI-IA-I-I-I 1!，下游 V[1-IA---I1 L-I--I-IIIA--AA1![，产物长度为 2F2 J4，反应条 件为：VH Z逆转录 !H C+’；8G Z预变性 2 C+’；8G Z 变性 !H ,，V2 Z退火 VH ,，Y2 Z延伸 GV ,，扩增 !H个 循环；Y2 Z延伸 6H C+’。退火温度 V2 Z；内参照 I-@;N 上 游 引 物： V[1AALLA-LLI-AAL1 A--AL-A-LII 1![，下 游 引 物：V[1IA-ILI-LIIA- L;;-ALILIIL ![，扩增片段长度 GG2 J4，反应条件 为：VH Z逆转录 !H C+’；8G Z预变性 2 C+’；8G Z变 性 GH ,，V9 Z退火 6 C+’，Y2 Z延伸 6 C+’，扩增 !H个 循环；Y2 Z延伸 6H C+’。@AD产物于 67V:琼脂糖凝 胶电泳，;K/ I50 6HHH成像系统观察结果并拍照。同 时进行吸收度积分值分析，以目的基因 @AD 产物与 内参照 I-@;N @AD 产物的吸收度积分值之比作为 目的基因 CDO-的相对含量，实验重复 !次。 67!7G ./012、."3、/",4",51!蛋白的表达测定 提取 细胞总蛋白，然后取蛋白质样品 VH"B加上样缓冲液 煮沸变性后，进行 6H: =;= @-I?；电转移至 @T;U 膜；用含 V:脱脂奶粉的 L.=（4N 97H）封闭2 *；分别 加入适量 ./012、."3 鼠单抗 EBI（6 \ GHH）、/",4",51! 兔 多抗 EBI（6 \ GHH）或!1"/(+’ 山羊 EBI 多克隆抗体（6 \ GHH），摇床上室温反应 2 *；洗膜 !次，每次 2H C+’；加 FF! 学 报 &’()*$# ’+ ,-.*$ /-$)0$"1(2."$# 3*.41)5.26 第 !9 卷 万方数据 辣根过氧化物酶标记的羊抗鼠 !"#（$ % & ’’’），室温 反应 ( )；洗膜后作 *+, 化学发光，- 光显影。图像 经扫描仪扫描后，用图像分析软件 ./01 23/0 45’ 进 行吸收度积分值分析，计算目的蛋白与内参照!6/36 780蛋白表达量的吸收度积分值之比作为目的蛋白 表达量的相对含量，实验重复 9次。 $5954 3/:;/:<69 活性的测定 根据 3/:;/:<69 活性 检测试剂盒进行。将上述各组细胞分别用裂解液在 冰上裂解 $’ =80，> ?，$9 >’’ @A=80 离心 $ =80，各取 上清液 4", 进行蛋白定量（.@/1BC@1 法）。另外 >4 ",上清液各加 4’", ( D反应缓冲液 4",反应底物 （E+6F*GF 6;HE），于 9I ?孵育 $ )，在酶标免疫测定 仪上测定 !>’4，以此来表示 3/:;/:<69的相对活性。 $ 5> 统计学处理 全部数据均表示为（ " J #），采用 2K22$$ 5’ 统 计软件进行单因素方差分析。 ! 结 果 ( 5$ 大鼠佐剂关节炎模型的制备 致炎各组大鼠和正常组相比，毛色晦暗并轻微 脱毛，精神萎靡，食量减少，体重增长缓慢，尾部出 现明显结节，双侧后踝关节出现明显肿胀，说明造 模成功，模型成功率达 L’ 5&M。 ( 5( 对大鼠关节滑膜组织中 $%&6 (、$’" =NHE 表 达的影响 NO6K+N结果（图 $）及图像分析结果显示，与正 常对照组相比较，模型组 $%&6 (、$’" 的 =NHE 表达 均上调；与模型组相比较，小剂量原花青素组 $%&6 (、 $’" =NHE的表达无显著性变化，中，大剂量原花青 素组 $%&6 ( =NHE 的表达减少（ ( P ’5’$），而 $’" =NHE表达则明显上升（ ( P ’5’$）。图像分析结果 显示，各组 $%&6( Q #EKFR的吸收度积分值之比分别 为 ’5$(( J ’5’$S，’5S(9 J ’5(94，’5IL4 J ’5(’9，’54’9 J ’5$9S，’5(I& J ’5’I4；各组 ./T Q #EKFR的吸收度积 分值之比分别为 ’5’L9 J ’5’$(，’5(S> J ’5’>4，’59$I J ’5’L$，’5I>9 J ’5(’$，’5S>4 J ’5(I$。 ( 59 对大鼠关节滑膜细胞中 .3U6(、./T 蛋白的表 达的影响 结果表明（图 (），低剂量原花青素组的 .3U6(、 ./T蛋白表达量与模型组比较差异均不明显；而与 模型组相比较，中、高剂量原花青素组的 ./T 蛋白 表达量上升，而 .3U6( 蛋白表达量下降（ ( P ’ 5’$）。 图像分析结果显示各组 .3U6( Q!6/3780 蛋白表达量 的吸收度积分值之比分别为：’ 5(( J ’ 5’I ’ 5L9 J ’ 59$，’ 5SL J ’ 5(S，’ 5>9 J ’ 5$>，’ 5(I J ’ 5’L；各组 ./T Q!6/3780 蛋白表达量的吸收度积分值之比分别 为：’ 59$ J ’ 5$9，’ 5&S J ’ 5$S，’ 5I& J ’ 5(&，$ 5’S J ’ 59(，$ 5$L J ’ 5>’。 "#$%& *BB<37 CB ;@C/07)C3V/08180:（K+）C0 $%&6( /01 $’" "<0< 对大鼠关节滑膜细胞 3/:;/:<69 活性的影响 结果显示，模型组大鼠关节滑膜细胞 3/:;/:<69 活性有一定程度的增强，而药物各组的 3/:;/:<69 活性均随着浓度的上升而明显逐渐增强（ ( P ’ 5’$，表 $），中、高剂量原花青素组增强更为明显。 ’()%& N’4 +C07@CU ’ 5’IS J ’5’’I!! YC19!! 9’ ’ 5>&& J ’5’49!! K+：;@C/07)C3V/08180: ^!! ( P ’5’$ *# =C1 期 王旭光等：原花青素对佐剂关节炎大鼠滑膜细胞 .3U6(、./T表达的影响 万方数据 ! "# 各组大鼠关节滑膜细胞 $%&’%&()* 酶原的裂解 结果表明（图 +），各药物组大鼠关节滑膜细胞 $%&’%&()* 酶原蛋白条带随着药物浓度的增加逐渐 变细，同时均出现 $%&’%&()* 的活性裂解片段 ,-- （-- ./），并随着药物浓度的增加，裂解片段条带逐 渐变粗。图像分析结果显示 $%&’%&()* 吸收度积分 值分别为：* ++!，* 00+，! 00#，1#0，*#!；,-- 裂解片 段的吸收度积分值分别为：*0#，20#，! 34+。 !"#$% 56%78(& 9: $%&’%&()* ’;9<(=7 >? @(&<(;7 >A9<<=78 B：597<;9A；C：D9E(A；5：,5（- "! F8 G .8）；/：,5（2 F8 G .8）； H：,5（*4 F8 G .8） & 讨 论 IB典型的病理特征在于滑膜组织的炎性增 生，IB滑膜组织的增生性、侵蚀性生长及病理学行 为在许多方面类似于肿瘤组织的特性。滑膜细胞 呈肿瘤样生长导致血管翳形成，侵袭软骨及骨组 织，造成关节软骨和骨组织的损害。近年来，由于 对细胞凋亡的深入认识，研究发现 IB 关节滑膜组 织的异常增生与细胞凋亡异常密切相关。在 IB 发生发展过程中，细胞增殖和细胞凋亡均呈增加趋 势，但滑膜组织中细胞增殖数增加远远高于凋亡细 胞数，即凋亡数是相对减少而不是绝对减少，滑膜 细胞凋亡的相对不足导致滑膜细胞过度增生［#，2］。 在 IB 滑膜细胞凋亡相关的分子中，!"#) ! 和 !$% 是 !"#)! 家族中一对凋亡相关基因，在细胞凋亡的 调控中起重要作用，!$% 可促进细胞凋亡，而 !"#)! 是一种原癌基因，可以通过调节抗氧化途径阻止一 系列氧化应激诱导的细胞凋亡［0］。研究发现 IB 滑膜组织和滑膜成纤维样细胞 C$A)!、C%J 表达升 高，表明 IB 滑膜组织异常增生与 C$A)!、C%J 表达 相关［3，1］。C$A)! 表达上调可能抑制 IB滑膜细胞凋 亡，从而促进滑膜细胞的增殖，导致 IB 患者滑膜 组织增生和关节损害。而近年来发现细胞凋亡信 号传导的关键是 $%&’%&( 的激活，而 $%&’%&()* 被认 为是哺乳动物细胞凋亡中的关键蛋白酶，在细胞凋 亡信号传导过程中起重要作用。 前期研究发现原花青素能减轻佐剂性关节炎大 鼠原发病变和继发病变的足肿胀度，明显改善大鼠 的关节炎症状。本实验结果表明，模型组大鼠滑膜 组织的 C$A)!和 C%J表达增加，$%&’%&()* 活性也有一 定程度的升高，提示滑膜细胞凋亡相关基因表达异 常，导致细胞增生与凋亡的不平衡，引起滑膜细胞增 生。而原花青素可以使 BB 大鼠滑膜细胞 C$A)! 表 达减少，C%J表达明显升高，并且 $%&’%&()* 的相对活 性升高。提示原花青素可能通过调控 !"#) ! 和 !$% 等凋亡相关基因，并诱导 IB 滑膜细胞 $%&’%&()* 活 化，促进滑膜细胞的凋亡，从而抑制关节滑膜细胞的 增殖，减轻滑膜增厚而发挥治疗作用。 参 考 文 献 ［-］ 戴 冽（/%= K），叶志强（L( MN），汤美安（O%78 DB）P 类风湿关 节炎滑膜巨嗜细胞来源的研究［ Q］P中华风湿病学杂志（ &’() * +’,-.$/0#），!444，%（!）：-4* R -4# P ［!］ ST;9U&.% D，ITE7=$.% @，S97<7? H，,/ $# P V=W;9>A%&<)A=.( &?79W=9) $?<(& :;9F ;6(TF%<9=E %;<6;=<=& ’%<=(7<& (J’;(&& :T7$<=97%A XK)-# ;() $(’<9; $9F’A(J：(7E98(79T& XK)-# =7 %T<9$;=7( :%&6=97 (76%7$(& $(AA ’;9A=:(;%<=97 %7E (J’;(&&=97 9: C$A)J（K）%7E C$A)!［Q］P * 1..-)0#， !44!，’()（+）：- 024 R - 020 P ［*］ 王旭光（@%78 YZ），梁 统（K=%78 O），周克元（M69T SL）P 原花 青素对佐剂性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞 =[\] 表达的影响 ［Q］P 中国药科大学学报（ * &’()$ 2’$3. 4)(5），!442，&*（*）： !2* R !20 P ［+］ 周学平（M69T Y,），梁 卫（K=%78 @），周玲玲（M69T KK），等 P 清 络通痹颗粒对胶原性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡相关基因 ’#* 和 C$A)!表达的影响［Q］P 中国免疫学杂志（ &’() * 1..-)0#）， !442，++（3）：0-3 R 0!4 P ［#］ 5(’97=& B，^ =(<%7(7 Q，O%FTA%=<=(7( D，,/ $# P B $9F’%;%<=W( _T%7<=) <%<=W( F9;’69F(<;=$ &;%7(& =7 ’&9;=%<=$ ;(%$<=W( %7E ;6(TF%<9=E %;<6;=<=&［ Q］P +’,-.$/0#067（ 8%9 :03;），-111，&,（#）：+*- R + +4 P ［2］ S9>%?%&6= O，\.%F9<9 S，S9>%<% O，,/ $# P B’9F9ETA%<=97 %& % 79W(A <6(;%’(T<=$ $97$(’< :9; <6( ;(8TA%<=97 9: %’9’<9&=& =7 ;6(TF%<9=E &?79) W=9$?<(&［Q］P &-33 8<() +’,-.$/0#，-111，’’（*）：-33 R -1* P ［0］ ST;9U&.% D，ITE7=$.% @，S97F? H，,/ $# P V=W;9>A%&<)A=.( &?79) W=9) $?<(& :;9F ;6(TF%<9=E %;<6;=<=& ’%<=(7<& (J’;(&& :T7$<=97%A XK)-# ;() $(’<9; $9F’A(J：(7E98(79T& XK)-# =7 %T<9$;=7( :%&6=97 (76%7$(& $(AA ’;9A=:(;%<=97 %7E (J’;(&&=97 9: C$A)YX %7E C$A)!［ Q］P * 1..-)0#， !44!，’()（+）：- 024 R - 020 P ［3］ S%U%.%F= B，H87$6= S P X7W9AW(F(7< 9: %’9’<9<=( $(AA E(%<6 =7 %T<9) =FFT7( E=&(%&(&［Q］P =,; >#,"/30) =("30?"，!44!，&-（-）：- R 3 P ［1］ ^=A>(;& X，^ %7&(7 O，,(<;9U ,S，,/ $# P HJ’;(&&=97 9: <6( %’9’<9&=& %$$(A(;%<9; C%J =7 ;6(TF%<9=E %;<6;=<=& &?79W=TF［Q］P +’,-.$/0# 1)/， !44*，+&（!）：0# R 01 P 32* 学 报 *0-3)$# 0: &’()$ 2’$3.$",-/("$# 4)(5,3?(/7 第 *3 卷 万方数据 原花青素对佐剂关节炎大鼠滑膜细胞Bcl-2、Bax表达的影响 作者： 王旭光， 陈根殷， 杨展， WANG Xu-guang， CHEN Gen-yin， YANG Zhan 作者单位： 广东医学院附属医院中心实验室,湛江,524001 刊名： 中国药科大学学报 英文刊名： JOURNAL OF CHINA PHARMACEUTICAL UNIVERSITY 年，卷(期)： 2007，38(4) 引用次数： 0次 参考文献(9条) 1.戴冽.叶志强.汤美安 类风湿关节炎滑膜巨噬细胞来源的研究[期刊论文]-中华风湿病学杂志 2000(2) 2.Kurowska M.Rudnicka W.Kontny E Fivroblast-like synoviocytes from rheumatoid arthritis patients express functional IL-15 receptor complex:endogenous IL-15 in autocrine fashion enhances cell proliferation and expression of Bcl-x(L) and Bcl-2 2002(4) 3.王旭光.梁统.周克元 原花青素对佐剂性关节炎大鼠腹腔巨噬细胞iNOS表达的影响[期刊论文]-中国药科大学学 报 2006(3) 4.周学平.梁卫.周玲玲.王明艳.梁涛 清络通痹颗粒对胶原性关节炎大鼠滑膜细胞凋亡相关基因p53和bcl-2表达 的影响[期刊论文]-中国免疫学杂志 2006(8) 5.Ceponis A.Hietanen J.Tamulaitiene M A comparative quantitative morphometric study of cell apoptosis in synovial membranes in psoriatic reactive and rheumatoid arthritis 1999(5) 6.Kobayashi T.Okamoto K.Kobata T Apomodulation as a novel therapeutic concept for the regulation of apoptosis in rheumatoid syno-viocytes 1999(3) 7.Kurowska M.Rudnicka W.Konmy E Fivroblast-like syno-viocytes from rheumatoid arthritis patients express functional IL-15 receptor complex:endogenous IL-15 in autocrine fashion enhances cell proliferation and expression of Bcl-XI and Bcl-2 2002(4) 8.Kawakami A.Egnchi K Involvement of apoptotie cell death in autoimmune diseases 2002(1) 9.Hilbers I.Hansen T.Petrow PK Expression of the apoptosis accelerator Bax in rheumatoid arthritis synovium 2003(2) 相似文献(0条) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zgyaokdxxb200704018.aspx 下载时间：2010年2月25日