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原花青素对大鼠急性坏死性胰腺炎肺损伤的治疗作用

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原花青素对大鼠急性坏死性胰腺炎肺损伤的治疗作用 [文章编号 ] 1000 - 4718 (2007) 03 - 0609 - 03  [收稿日期 ]2006 - 02 - 15   [修回日期 ]2006 - 08 - 30 Tel: 0352 - 7895399; E - mail: shenlhd@163. com 原花青素对大鼠急性坏死性胰腺炎肺损伤的治疗作用 沈凌鸿 ,  陈向东 ,  王占海 ,  李建巍 ,  王  献 ,  乔志灏 ,  张宏松 ,  朱  容 (同煤集团总医院 ICU,山西 大同 037003)   [摘  要 ] 目的 : 观察原...
原花青素对大鼠急性坏死性胰腺炎肺损伤的治疗作用
[文章编号 ] 1000 - 4718 (2007) 03 - 0609 - 03  [收稿日期 ]2006 - 02 - 15   [修回日期 ]2006 - 08 - 30 Tel: 0352 - 7895399; E - mail: shenlhd@163. com 原花青素对大鼠急性坏死性胰腺炎肺损伤的治疗作用 沈凌鸿 ,  陈向东 ,  王占海 ,  李建巍 ,  王  献 ,  乔志灏 ,  张宏松 ,  朱  容 (同煤集团总医院 ICU,山西 大同 037003)   [摘  要 ] 目的 : 观察原花青素 ( GSP)对急性坏死性胰腺炎 (ANP)的治疗作用及其可能机制。 :采用 5%牛磺胆酸钠胰管逆行注射制备 ANP动物模型。SD雄性大鼠 48只 , 采用随机分配原则分 4组 :假手术组给予 NS 3 mL /kg; ANP模型组 ; GSP组给予腹腔注射 GSP 50 mg/kg; GSP + ANP组于造模型后给予腹腔注射 GSP 50 mg/kg。采用酶联免疫法 ( EL ISA) 检测血液及肺组织 TNF -α、IL - 1β及 ICAM - 1含量。W estern boltting法检 测 GSP对 MAPKs信号通路的影响以及用电泳迁移率实验 ( EMSA )检测肺组织 NF -κB的 DNA结合活性。结果 : GSP能够减轻 ANP大鼠胰腺和肺组织损伤。ANP大鼠血清及肺组织中 TNF -α、IL - 1β及 ICAM - 1的水平、肺组 织 MPO水平均明显高于对照组 ( P < 0105)、ANP大鼠 ERKs、p38和 JNKsMAPKs的磷酸化水平及 NF -κB的 DNA 结合活性显著高于对照组。GSP +ANP组上述指标明显轻于 ANP组。结论 : GSP可能通过抑制肺 MAPKs及 NF - κB通路的激活 ,抑制炎症因子的达而减轻 ANP所致的肺损伤 ;对 ANP组大鼠胰腺损伤有显著的减轻作用。 [关键词 ] 胰腺炎 ; 肺损伤 ; 原花青素 ; NF -κB   [ KEY WO RD S]  Pancreatitis; Lung injury; Grasp seed p rocyanidins; NF - kappa B   [中图分类号 ] R363   [文献标识码 ] A   原花青素是一种天然植物药物 ,在自然界有着丰富的资 源。研究表明原花青素 ( grasp seed p rocyanidins, GSP)都具有 显著的抗炎、抗氧化、降血脂、降血压与阻断各种信号转导通 路的作用 [ 1 - 3 ]。到目前为止 ,国内外还没有任何研究表明原 花青素是否具有抑制急性坏死性胰腺炎 ( acute necrotizing pancreatitis, ANP)的作用。本文通过急性坏死性胰腺炎大鼠 模型 , 探讨抗氧化剂 GSP对 ANP肺损伤的治疗作用及其可 能的机制。 材  料  和  方  法 1 材料 SD雄性大鼠共 48只 , 体重 280 - 320 g, 由中国医学科 学院实验动物中心提供 ; 淀粉酶试剂盒购于 B&D公司 ; 5% 牛磺胆酸钠由 Sigma公司提供。原花青素由中国医学科学院 药物研究所提供。髓过氧化物酶活性 (MPO )检测试剂盒为 Sigma公司产品 ; TNF -α、IL - 1β及 ICAM - 1 EL ISA检测试剂 盒均购自美国 B&D公司。抗磷酸化与非磷酸化 ERK1 /2、JNK 及 p38抗体均购于 Cell Signaling公司。 2 动物模型的复制及分组 大鼠常规喂养 , 实验前 12 h禁食但不禁饮 ,可自由活 动。用 215%戊巴比妥钠注射液 ( 1 mg/kg BW ) 腹腔内注射 麻醉 , 造模前行右颈静脉插管 ,并用肝素液维持。腹腔正中 切口 , 打开腹腔 , 找到胆总管及胰管 ,在胆总管进入十二指 肠开口下缘处用金属夹夹住十二指肠及胰管远端 , 然后将针 头插入胰管内 , 插管后 5 m in内缓慢匀速注入 5%牛磺胆酸 钠 (1 mL /kg BW )制备 ANP动物模型。实验分为 4组 , 每组 大鼠 12只 , 采用随机分配原则分组。假手术组 , 给予 019% NaCl溶液 ; ANP模型组 ; GSP组给予 GSP 50 mg/kg; GSP + ANP组 , 造模型后 ,给予腹腔注射 GSP 50 mg/kg。ANP后再 继续分别观察 6 h后采用颈椎脱位法处死大鼠 , 并立即取 血、胰腺组织及肺组织供实验用。取胰腺组织及肺组织固定 部位约 100 mg,称重 ,用于计算湿 /干重比率。切取肺组织约 100 mg,即刻投入液氮中冻存 , 用于蛋白测定 ;再取约 100 mg 肺组织 , 液氮急冻后 - 80 ℃冻存 , 留待测定髓过氧化物酶 (myeloperoxidase, MPO)。另外 , 分别取胰头部位组织及肺 组织固定部位做病理学检查。 3 血清和肺组织细胞因子含量测定 各组动物在造模型 6 h后 , 经静脉采血 , 留取血清和肺 组织匀浆上清液置 - 70 ℃冰箱冻存 , 用酶联免疫吸附试验 ( EL ISA) 测定血清和肺组织匀浆上清液中 TNF -α、IL - 1β、 MCP - 1及 IL - 6的含量 , 按试剂盒 (购自美国 B&D公司 )说 明操作。 4 肺组织 M PO水平测定 灌洗后速取右肺 ,用生理盐水冲洗表面血迹 ,吸干水分 及血液 ,称湿质量 ,每克组织加入 6 mL 溴甙十六烷三甲胺 , 冰浴中匀浆 5 s, 4 ℃ 20 000 ×g离心 10 m in,收集上清液 , 沉淀物反复冻融 3次 ,再超声破裂细胞 10 m in, 然后 4 ℃ 20 000 ×g再离心 10 m in,取所有上清液 , 37 ℃放置 3 m in, 每管分别加入 012 mol/L NaAc 1175 mL, 混匀后 , 读取 655 nm波长处吸光度值 (测定 1 m in) ,计算组织 MPO含量。 5 W estern blotting 用 PBS清洗肺组织后进行组织总蛋白提取 ,用 B radford 法测定总蛋白的含量。取适量样品 , 进行 SDS聚丙烯酰胺凝 ·906·中国病理生理杂志  Chinese Journal of Pathophysiology 2007, 23 (3) : 609 - 611 胶电泳。电泳时浓缩胶恒压 80 V, 分离胶恒压 120 V, 电泳约 80 m in。PVDF膜用甲醇活化 15 m in后 , 在电转移架 上从负极到正极方向依次铺上滤纸 - 胶 - PVDF膜 - 滤纸 , 恒压 100 V 转移 120 m in。 PVDF膜用含 5%脱脂奶粉的 TBST(在 1 000 mL 含 0102 mol/L Tris - HCl和 013 mol/L NaCl的溶液中加入 1 mL Tween - 20于 4 ℃封闭 6 h。然后 用 TBST按 1∶200稀释各种多克隆抗体 ,与 PVDF膜于 4 ℃ 下孵育过夜 ,并轻柔摇动。再用 TBST按 1∶5 000稀释鼠抗山 羊 IgGⅡ抗 ,与 PVDF膜孵育 1 h, 室温轻柔摇动。化学发光 法分别检测 PVDF膜上各种蛋白的表达。同样用 V ILBER LOURMAT凝胶图像分析系统对条带吸光度扫描 ,以 GAPDH 为内参照 , 测定各样品的蛋白表达。 6 电泳迁移实验 EM SA 肺组织 NF -κB活性的检测 ,依 EMSA 试剂盒说明书进 行 ,主要步骤 : (1) 肺组织核蛋白的提取 , 用考马斯亮蓝定量 核蛋白 (牛血清白蛋白作参照 ) ; ( 2 ) NF - κB ( 5’- AGTT2 GAGGGGACTTTCCCAGGC - 3’)寡核苷酸探针的标记 ; ( 3) 寡核苷酸探针标记百分率的测定 ; (4) 未标记寡核苷酸的清 除 ; (5)寡核苷酸探针与细胞核蛋白的结合反应 ; (6) 7%非 解离聚丙烯酰胺凝胶电泳 ; (7) 放射性自显影 ; ( 8) 将显影 结果经扫描仪扫入计算机中 , 然后用 Image Too1系统进行分 析 ,以积分灰度值表示 NF -κB的活性变化。 7 病理学检查 在光镜下观察胰腺及肺组织学改变。肺组织学观察与 计分参照 Hofbauer等 [ 6 ]的方法。即 ,在各组实验动物中随机 抽样做病理学检查。肉眼观察 :观察胰腺及周围有关皂化斑 的形成 ,胰腺水肿、出血、坏死程度 ,腹水颜色及量。观察肺 组织水肿、出血及坏死程度 , 胸腔有无积液及量。取各组胰 腺及肺组织 ,用 10%中性甲醛固定 ,石蜡包埋 , HE染色。光 镜下胰腺组织病理学评分指标为水肿、空泡形成、间质白细 胞浸润、腺泡坏死及胰腺组织灶性坏死 5个项目积分 , 并计 算其积分总和。 8 统计学处理 计量资料数据用 珋x ±s表示 ,应用统计软件 SPSS 1010进 行方差齐性检验 ,若方差不齐 ,采用平方根反正弦或对数变 量变换 ,达到方差齐性后再进行方差分析。 结   果 1 GSP对血清及肺组织中炎症因子水平的影响 结果表明 , ANP造模后 6 h,血清及肺组织 TNF -α、IL - 1β及 ICAM - 1水平明显高于对照组 ( P < 0105, P < 0101)。 GSP +ANP组炎症因子的水平则明显低于 ANP组 ( P < 0105, P < 0101)。单独 GSP组的炎症因子没有明显变化 ,见表 1。 2 GSP对脂肪酶、淀粉酶和胰腺湿 /干重比率的影响 ANP组血脂肪酶、淀粉酶水平明显高于对照组 , GSP + ANP组脂肪酶和淀粉酶明显低于 ANP组 ( P < 0105, P < 0101)。湿 /干重比率比较显示 GSP组胰腺湿 /干重比率低于 ANP组 (表 2)。 3 GSP对肺组织湿 /干重比率、病理和 M PO 的变化 胰腺炎组肺湿 /干重比率高于对照组 ; GSP组肺组织湿 / 干重比率则明显低于 ANP组。GSP组肺 MPO活力也明显低 于 ANP组 (表 2)。 表 1 GSP对 ANP大鼠细胞因子的作用 Tab 1 Effects of grasp seed p rocyanidins( GSP) on the levels of cytokines in ANP rats (珋x ±s. n = 12) Group Control ANP GSP GSP +ANP Serum TNF -α ( ng/L) 91. 4 ±8. 2# 788. 4 ±76. 333 88. 4 ±10. 6# 356. 7 ±35. 7#33 IL - 1β( ng/L) 121. 4 ±15. 6# 843. 2 ±115. 833 110. 9 ±10. 5# 366. 3 ±56. 6#33 ICAM - 1 ( ng/L) 57. 5 ±6. 8# 387. 3 ±26. 733 64. 6 ±8. 9# 145. 6 ±31. 3#33 Lung tissue TNF -α ( ng/L) 64. 4 ±7. 7# 533. 7 ±78. 233 68. 2 ±8. 5# 305. 7 ±36. 3#33 IL - 1β( ng/L) 89. 4 ±11. 7# 718. 5 ±94. 333 92. 2 ±9. 5# 315. 8 ±56. 4#33 ICAM - 1 ( ng/L) 47. 3 ±6. 4# 307. 5 ±34. 633 52. 5 ±4. 8# 153. 2 ±18. 5#33  33 P < 0101 vs control group; #P < 0101 vs ANP group. 表 2 GSP对 4组大鼠淀粉酶和脂肪酶含量的影响 Tab 2 Effects of GSP on the levels of amylases and lipase (珋x ± s. n = 12) Group Control ANP GSP GSP +ANP Amylases (U /L) 1 783. 4 ±122. 5# 8 063. 7 ±379. 833 1 885. 4 ±132. 3# 4 228. 6 ±254. 6#33 Pancreatwet/dry ratio 3. 29 ±0. 62# 6. 10 ±0. 8133 3. 35 ±0. 47# 4. 78 ±0. 37#33 L ipase ( IU /L) 86. 5 ±9. 4# 261. 4 ±32. 633 87. 9 ±11. 4# 148. 7 ±18. 5#3 Lung wet/dry ratio 4. 3 ±0. 4# 5. 8 ±0. 63 4. 2 ±0. 3# 4. 7 ±0. 3#3 MPO (U /g) 4. 7 ±0. 5# 11. 8 ±1. 133 4. 6 ±0. 7# 7. 60 ±1. 2#33  3 P < 0105, 33 P < 0101 vs control group; #P < 0101 vs ANP group. Fig 1 Effects of GSP on the phosphorylation of MAPKs in ANP rats. A: control; B: GSP group; C: ANP model; D: ANP + GSP group. 图 1 GSP对 ANP大鼠 M APKs磷酸化的影响 ·016· 4 GSP对 ANP大鼠 M APK通路的影响 W estern blotting显示 , ANP造模后 6 h,大鼠 ERK1 /2、p38 及 JNKs的磷酸化显著增强。而 GSP +ANP组 , ERK1 /2、p38 及 JNKs的磷酸化被完全取消 (图 1)。 5 GSP对 ANP大鼠 NF -κB信号转导通路的影响 EMSA显示 , ANP造模后 6 h大鼠 NF -κB的 DNA结合 活性明显增加。GSP +ANP组大鼠的 NF -κB的激活作用被 完全取消 (图 2)。 Fig 2 Effects of GSP on the activation of NF -κB in ANP rats. A: control; B: GSP group; C: ANP model; D: ANP + GSP group. 图 2 GSP对 ANP大鼠 NF -κB激活的影响 讨   论   GSP是一种很强的抗氧化剂 , GSP有显著的降血脂、保护 心肌、抗脑缺血以及抗炎、抗糖尿病的治疗作用 [ 1 - 3 ]。研究已 证实 MAPK在急性炎症 , 如脓毒血症、AL I及 ANP的发病中 起非常重要的作用 [ 4, 5 ]。NF -κB 是炎症基因表达的关键调 节因子 , 许多炎症因子的启动子区都有 NF -κB结合位点 , 而受 NF -κB的激活 [ 6, 7 ]。但是对于 GSP在 ANP的治疗目前 还没有任何研究。 本实验发现 ANP 后 6 h 大 鼠肺 与胰 腺 中的 NF - κB明 显 活 化 , 应 用 GSP后 , ANP组 大 鼠 NF - κB 活性及炎症因子 TNF -α、IL - 1β及 ICAM - 1水平大幅度降 低 , 提示 GSP可能通过抑制 NF -κB活化 , 阻止 NF -κB 从 胞浆进入胞核 , 降低 ANP大鼠体内炎症介质 TNF -α、IL - 1β及 ICAM - 1水平 , 减轻肺与胰腺的损伤。但 GSP作用的 确切机制有待进一步研究。 [参  考  文  献 ] [ 1 ] Keen CL, Holt RR, O teiza P I, et al. Cocoa antioxidants and cardiovascular health [ J ]. Am J Clin Nutr, 2005, 81 ( Supp l 1) : 298S - 303S. [ 2 ] Rasmussen SE, Frederiksen H, Poulsen L. D ietary p roan2 thocyanidins: occurrence, dietary intake, bioavailability, and p rotection against cardiovascular disease[ J ]. Mol Nu2 tr Food Res, 2005, 49 (2) : 159 - 174. 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