2005 中华神经外科 人垂体腺瘤中的细胞凋亡

作者单位 : 210008 南京大学医学院附属鼓楼医院神经外科 (王嵘、蒋健 ) ;南京军区南京总医院神经外科 (史继新、刘承基、 印红霞 ) ;南京军区南京总医院病理科 (吴波 ) ·脑垂体瘤临床与基础· 人垂体腺瘤中的细胞凋亡 王嵘 　史继新 　蒋健 　刘承基 　印红霞 　吴波 　　【摘要 】　目的 　研究人垂体腺瘤中的细胞凋亡和凋亡相关基因 ( P53、Bcl22、Bax)达蛋白的情 况 ,其和临床特征的相关性。方法 　采用流式细胞仪检测 21例人垂体腺瘤中的凋亡和增殖细胞 比例 ,采用 TUNEL法检测 14例细胞凋亡 ,同时应用免疫组化技术检测 17例细胞增殖相关抗原 ( PCNA) ,凋亡相关基因 P53、Bcl22和 13例 Bax表达的蛋白产物。结果 　TUNEL法在 14例垂体腺瘤 中 12例检测到细胞凋亡 (占 85171% ) , 其凋亡细胞比例 011% ～810% ,流式细胞仪检测 21例中凋 亡细胞比例为 1177% ±2112% ,两者和垂体腺瘤临床特征无明显相关性。凋亡相关基因中 Bax阳性 率高 (16 /17, 92131% ) ,表达强度高 , P53有 2例阳性 , Bcl22仅 1例阳性。Bax表达和细胞增殖活性 相关显著。结论 　人垂体腺瘤中存在细胞凋亡 ,垂体腺瘤中 Bax高表达 , Bcl22 /Bax比值 < 110,这一 细胞内微环境有利于细胞凋亡的存在。垂体腺瘤的凋亡活性和其临床特征 (如增殖活性 ,侵袭性等 ) 无明显相关性。 【关键词 】　垂体腺瘤 ; 　流式细胞 ; 　凋亡 P53; 　Bcl22; 　Bax Apoptosis in p itu itary adenoma s of human WANG Rong, SH I J i2x in, J IANG J ian, et a l. D epartm ent of N eurosurgery, Gu Lou Hospita l, N an jing U niversity, N an jing 210008, China 【Abstract】　O bjective　This study was undertaken to investigate apop tosis and p roteins p roduced by apop tosis related gene ( P53, Bcl22, Bax) in p ituitary adenomas of human. M ethods　W ith the aid of flow cytometry ( FCM ) , p roliferation and apop tosis indexes have been determ ined by studying from the analysis of their cell cycle. Apop tosis was also assayed in 14 cases by the method of TdT2mediated bio2dUTP nick end2 labelling ( TUNEL). A t the same time, immunohistochem istry method was used in 17 cases to assay the p roducts of PCNA, P53, Bcl - 2, and 13 cases of Bax. Results　Apop tosis was found in 12 out of 14 cases (85171% ). The p roportion of apop tosis cell was 011% ～810%. The report of FCM of apop tosis index was 1177% ±2112%. Both of them were not relevant to p roliferation ability. 16 cases were stained for Bax with dyeing greatly, and only 2 cases were stained for P53, 1 case was stained for Bcl22. Conclusion s　 Apop tosis exists in p ituitary adenomas of human, possibly owing to the p rotein of Bax being p roduced. The exp ression of Bax is positive correlated to the p roliferation ability of p ituitary adenoma cells. There is no relationship between apop tosis and p roliferation, invasive ability of p ituitary adenomas of human being. 【Key words】　Pituitary adenoma; 　Flow cytometry; 　Apop tosis P53; 　Bcl - 2; 　Bax 　　垂体腺瘤属于良性肿瘤 ,但生长速度存在很大 差异 ,有的是微腺瘤 ,在人颅内终生处于静止状态 , 尸检时才被发现 [ 1 ] ;有的快速生长 ,术后早期复 发 [ 2 ]。研究表明垂体腺瘤生长受腺瘤细胞增殖活 性影响 [ 325 ] ,而腺瘤细胞凋亡活性对肿瘤生长影响的 研究较少 [ 6, 7 ]。本实验采用 DNA片段末端羟基原 位标记技术 ( TUNEL法 )和流式细胞仪 ( FCM )检测 细胞凋亡 ,并通过免疫组化技术检测细胞增殖相关 抗原 PCNA和凋亡相关基因 ( P53、Bcl22、Bax)表达 蛋白 [ 8, 9 ] ,进一步分析人垂体腺瘤中细胞凋亡情况。 材料与方法 11材料 :从 1997年 3月 - 9月间收治的 21例 垂体腺瘤手术病人 , TUNEL法检测细胞凋亡 14例 (Baolinman公司试剂盒 ) [ 7 ]。免疫组化链霉菌抗生 物素蛋白 (卵蛋白 ) -过氧化物酶连接法 ( SPAP法 ) 检测 17例细胞增殖相关抗原 ( PCNA ) ,细胞凋亡相 关蛋白 P53 (克隆号 DO7 )和 Bcl22 (均为福州迈新 公司 ) , 13 例 Bax ( Santa Cruz B iotechnology, Inc1 Cat#sc2930) [ 8 ]。 21计数方法 : 细胞增殖和凋亡采用标记 指数 (P I) , P I =标记阳性细胞数 /计数的总细胞数 ,在 ·641· 中华神经外科杂志 2005年 3月第 21卷第 3期　Chin J Neurosurg, March 2005, Vol 21, No13 检测中凋亡相关基因蛋白表达表现为 : P53细胞核染 色 ,Bcl22、Bax细胞浆染色。P53、Bcl22和 Bax计数方 法采用标记细胞比例的分级法 ,同时计算 Bcl22 /Bax 比值 (≥110或 < 110)。取 21例垂体腺瘤手术标本 , 体积足够大 ( > 015cm3 ) ,行流式细胞仪检测 ,流式细 胞仪 FACS Calibur,美国 BD (Bection2D ickinson)公 司 ,采用 Modifit2LT软件分析计算 G0 /G1 期、S期、 G2M期细胞比例 ,其中 S期细胞比例 ( SPF)是指处于 增殖周期中合成期 (S期 )细胞比例 ,直接反映细胞增 殖活性 ,同时测算细胞凋亡比例 [ 10 ]。 31统计学分析 :采用 SAS ( 610)统计软件处理 分析数据 ,以 P值 < 0105差异有显著统计学意义。 结 果 11 临床资料 : 21 例垂体腺瘤病人 , 年龄在 16～66岁 ,平均 4214 岁。女性 14 例 , 男性 7 例 (女 Ø 男 = 2 Ø 1) ,病程 5d - 16年 ,平均 217年 ,垂 体腺瘤类型包括 :泌乳素腺瘤 7例 ,生长激素腺瘤 4例 ,无功能腺瘤 8例 ,生长激素和泌乳素混合性腺 瘤 2例 ,肿瘤直径 112～417cm,腺瘤卒中 4例 ,侵袭 性垂体腺瘤 [ 11 ] 13例。 21垂体腺瘤细胞增殖和凋亡活性 :流式细胞仪 检 测 发 现 , 二 倍 体 垂 体 腺 瘤 SPF% 在 (2149 ±2173) % , 异 倍 体 细 胞 SPF% 在 (4161 ±2129) %。由于凋亡细胞发生细胞核染色体 的碎裂 ,并溢出细胞形成凋亡小体 ,细胞核 DNA含量 减少 ,经碘化丙啶 ( P I) DNA染色 ,在 DNA直方图出 现亚 G0 /G1 峰 ,可定量分析测算出凋亡细胞比例 ,反 映凋亡活性 [ 10 ] ,在垂体腺瘤中存在着细胞凋亡 现象 ,凋亡细胞比例在 (1177 ±2112) %。17例垂体 腺瘤细胞增殖相关抗原 PCNA的标记指数为 4% ～ 3918%。TUNEL法检测 14例垂体腺瘤 ,在 12例中检 出到凋亡细胞 (85171% ) ,阳性细胞的标记指数为 (1175 ±2164 ) % ( 011% ～ 810% )。 TUNEL 法和 FCM检测的细胞凋亡活性 (凋亡细胞比例和标记指 数 )和临床特征 (出血、坏死、侵袭等 )无明显相关性 , 和腺瘤细胞增殖活性 ( SPF%和 PCNA标记指数 )也 无明显相关性。 31垂体腺瘤细胞凋亡相关基因蛋白表达 :见 表 1。Bax在 13例中有 12例表达 ,检出的阳性着色 细胞所占比例高 ,着色较强。17例 P53中只有 2例 表达 ,且为个别细胞着色。Bcl22检测 17例中仅有 1例阳性 ,弱染色 (有阳性对照排除技术问 )。 11例Bcl22 /Bax比值 < 110。Bax表达程度和细胞增 殖活性有关 ,垂体腺瘤细胞增殖活性高 , Bax表达阳 性的细胞比例也高 , 9例 PCNA大于 10%的垂体腺 瘤 , Bax表达级数 (阳性细胞比例 )显著高于 4例 PCNA < 10%的垂体腺瘤 ( P = 01018)。 表 1　垂体腺瘤细胞凋亡相关基因表达蛋白 的免疫组化结果 检测 例数 阳性例数 (阳性率 ) + < 10% + + 10%～30% + + + 30%～50% + + + + ≥50% P53 17 2 (11175% ) 2 0 0 0 Bcl22 17 1 (5189% ) 0 1 0 0 Bax 13 12 (92131% ) 3 7 2 0 　　本实验仅有 1例 Bcl22 /Bax比值 > 110, P53和 Bcl22均为阳性 ,系男性 43岁 ,泌乳素腺瘤 ,以视力 下降为首发症状 ,病程 3个月 ,腺瘤直径 3 cm,侵袭 生长进入海绵窦侧壁 ,病理示细胞密度大 ,无出血坏 死 ,提示生长活跃 , SPF3158% , TUNEL法未检测出 凋亡细胞。 讨 论 细胞增殖和凋亡是人体自身调控细胞数目的平 衡机制。人垂体腺瘤中腺瘤细胞增殖活性和其临床 特征 (包括生长 ,复发 ,侵袭等 )有密切关系 [ 325, 12 ] , 当腺瘤细胞增殖活性高 ,提示进入增殖周期而处于 增殖状态的腺瘤细胞比例高 ,临床表现为快速增长 的垂体腺瘤 ,侵袭生长 ,术后残余肿瘤易快速复发。 本实验着重研究细胞凋亡 ( apop tosis)在垂体腺瘤中 的情况。用 TUNEL法检测凋亡细胞 ,其阳性着色细 胞的形态符合凋亡细胞特征 ,细胞体积缩小 ,细胞核 小而色深 ,形态不 ,明显区别于坏死细胞 [ 13 ] ,通 过 TUNEL法和 FCM检测 ,证实在垂体腺瘤中存在 细胞凋亡 ,但未发现凋亡活性和增殖活性、侵袭、卒 中等临床特征有相关性 , 这和其他研究结果 一致 [ 627 ]。 B细胞淋巴瘤 /白血病基因 2 (B cell lymphoma / leukem ia gene22,Bcl22)表达蛋白抑制细胞凋亡 ,并附 着于细胞内膜 (线粒体内外膜、核膜、内质网膜 )上 ,和 本实验 Bcl22阳性细胞表现为细胞胞浆着色一致。 Bax属于 Bcl22家族 (Bcl22 associated X p rotein) ,其表 达蛋白产物和 Bcl22蛋白的氨基酸序列高度重复 ,两 者可相互结合形成异二聚体 ,从而使 Bcl22抑制细胞 凋亡的作用灭活 ,拮抗 Bcl22的功能 ,所以 Bax高表达 ·741·中华神经外科杂志 2005年 3月第 21卷第 3期　Chin J Neurosurg, March 2005, Vol 21, No13 有利于细胞凋亡 [ 14 ]。研究认为细胞内 Bcl22 /Bax比 值更有意义 [ 15 ] ,决定细胞是生存或是死亡 ,若 > 110 则有利于抑制细胞凋亡而生存 , < 110则有利于发生 细胞凋亡。本实验 13例垂体腺瘤中 11例 Bcl22 /Bax 比值 < 110,证明垂体腺瘤细胞内的微环境有利于凋 亡 ,和垂体腺瘤中发现细胞凋亡相印证。 实验中 17例垂体腺瘤 P53免疫组化检测 2例 阳性 (11175% ) ,标记阳性细胞均很少 ( < 5% ) ,提 示垂体腺瘤 P53免疫组化检测阳性可能是野生型 P53半衰期延长所致 [ 16 ]。抑癌基因 P53 (野生型 ) 参与促进细胞凋亡 [ 17 ] ,当野生型 P53蛋白存在时间 延长和垂体腺瘤中凋亡的关系有待进一步研究。 参 考 文 献 1 Sanno N, Teramoto A, O samura RY, et al. 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(收稿 : 2002206225　修回 : 2004212228) (本文编辑 :陈玉平 ) 【专家点评 】 近年来 ,许多证据已经证实 :垂体腺瘤是源于单一的突变 细胞 ,随后在多种内分泌信号的不规则调节和刺激下不断克 隆扩增 ,形成肿瘤。由于参与因素众多 ,各种调控机制复杂 , 虽有众多研究 ,至今仍未能充分阐明其发生及生物学行为。 本文系对垂体腺瘤细胞凋亡活性对肿瘤生长影响的研究 ,国 内尚少报道。 文中作者对 21例不同类型垂体腺瘤 ,采用 FCM、TUNEL 法及免疫组化技术检测了腺瘤中的细胞凋亡和凋亡相关基因 表达蛋白 ,并与垂体腺瘤临床特征进行联系。读后受益颇多。 如众周知 ,细胞凋亡对维持组织稳定起着重要作用。当 这种程序性调控出现异常 ,可促进或参与肿瘤的发生。本项 研究证实了 :人垂体腺瘤中存在细胞凋亡。垂体腺瘤中 Bax 高表达 ,Bcl22 /Bax比值 < 110,这一细胞内微环境有利于细胞 凋亡存在。但未发现凋亡活性与肿瘤增殖活性、侵袭、卒中等 临床特征有相关性。国内一组 90例垂体腺瘤生物学行为的 研究 (中华神经外科杂志 , 1999, 15 Ø 371. ) ,认为 : PCNA、 P53、nm23H1 基因蛋白的异常表达与垂体腺瘤发生及生物学 行为改变有关 ,可作为评价肿瘤侵袭性及复发的参考指标。 此外 ,也有报道外周血 VEGF表达可反映垂体腺瘤的增殖和 大小。由此可见影响该瘤临床特征的复杂性。 综上述 ,本研究无疑为了解垂体腺瘤的生物学特性做了 有益的工作。为了解决临床难题 ,希望继续深入下去。 北京市神经外科研究所　赵雅度 ·841· 中华神经外科杂志 2005年 3月第 21卷第 3期　Chin J Neurosurg, March 2005, Vol 21, No13