大肠杆菌检测

第 19 卷第 3 期 中　　国　　兽　　医　　学　　报 V o l. 19, N o. 3 1 9 9 9 年 5 月 Ch inese　Jou rna l　of　V eterinary　Science 　　　M ay 1 9 9 9 用 PCR 鉴定大肠杆菌O157∶H73 周志江　黄上媛3 3 　郑明光　汪力亚3 3 　王　丽3 3 李景云3 3 　 (解放军农牧大学兽医学院, 长春 130062) 摘要　根据大肠杆菌O 157∶H 7 的编码 eae 蛋白的 eae A 基因和大肠杆菌编码H 7 抗原的 f liC 基因的核甘 酸序列, 合成了 2 对寡核苷酸引物, 建立了一个检测大肠杆菌O 157∶H 7 的 PCR 方法。对 11 株已知大肠杆 菌O 157∶H 7 (NM ; 无运动性)株和其他不同属的 42 株已知肠道致病菌的检测结果表明, 该方法只从大肠杆 菌O 157∶H 7 (NM ) 株的DNA 中产生预期的扩增产物, 而从其他菌株的DNA 中未扩增出任何DNA 产物。 该方法从基因水平直接确定大肠杆菌的血清型, 特异性强, 克服了以往血清学方法有非特异性反应的缺陷, 为检测和鉴定大肠杆菌O 157∶H 7 (NM )提供了一个新方法。 关键词　聚合酶链反应　 eae A 基因 　f liC 基因　大肠杆菌O 157∶H 7 中图分类号　S8521612 　　肠道出血性大肠杆菌 (en terohem o rrhag ic E scherich ia coli, EH EC) 可引起出血性结肠炎、 溶血性尿毒综合征和血栓形成的血小板减少性紫 癜[ 1～ 3 ], 根据其主要血清型O 157∶H 7 为山梨醇 阴性的特点建立的血清学鉴定仍有一定缺陷。根 据 EH EC 菌株产生V T 毒素 (vero tox in) 而建立 的检测方法, 如组织培养法[ 4 ]、血清学检测法[ 5, 6 ]、 DNA 杂交和 PCR [ 7, 8 ]等也不能作为检测 EH EC 特别是大肠杆菌O 157∶H 7 的特异性方法。为建 立大肠杆菌O 157∶H 7 的特异性检测、鉴定方法 进行了本研究。 1　材料与方法 111　菌株　在 54 株试验菌中, 有 4 株由日本友 人提供, 4 株购自山东省卫生防疫站和中国药品 生物制品检定所, 另有 2 株为解放军 302 医院微 生物研究室保存菌种, 其余菌株为农牧大学兽医 学院保存菌种 (表 1)。 112　全细菌D NA 的提取　表 1 所列菌株分别 　　收稿日期: 1998206210 　　第 1 作者: 周志江, 男, 1960 年生, 硕士, 副教授 　　3 国家自然科学基金资助项目 (39670563) 　　3 3 解放军 302 医院微生物研究室, 北京 100039 表 1　本试验所用菌种一览表 菌　　种 血 清 型 菌株数 毒　素 大肠杆菌 O 157∶H 2 1 V T 2 大肠杆菌 O 157∶H 7 10 V T 1, V T 2 大肠杆菌 O 111∶H 2 1 V T 1 大肠杆菌 O 26∶H 11 1 V T 1, V T 2 大肠杆菌 O 26∶K60 (B)∶H 46 1 大肠杆菌 O 111∶K58 (B 4)∶H 2 1 ET EC 4 L T ET EC 4 ST ET EC 4 L T , ST E IEC 6 EPEC 1 痢疾É 型志贺氏菌 1 ShT 福氏志贺氏菌 5 宋内氏志贺氏菌 1 鲍氏志贺氏菌 1 鼠伤寒沙门氏菌 1 乙型副伤寒沙门氏菌 1 小肠结肠耶尔森氏菌 1 副溶血性弧菌 4 霍乱弧菌 1 拟态弧菌 1 溶藻弧菌 1 嗜水气单胞菌 1 普通变形杆菌 1 接种到 3 mL 适当液体培养基中, 经适当时间培 养, 培养物于 3 000 röm in 离心 10 m in 收集菌体, 沉淀物悬于含 25 mm o löL T ris2HC l (pH 810) , 10 © 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. mm o löL ED TA 和 50 mm o löL 葡萄糖的溶液中, 并按 1 göL 加入溶菌酶和 1% SD S, 室温下作用 30 m in。用等体积 1 m o löL T ris2HC l (pH 810) 饱 和苯酚, 苯酚ö氯仿 (50% )和氯仿进行抽提以纯化 DNA , 加 2 倍体积无水乙醇至上述抽提的水相液 中, 经沉淀离心制备DNA , 将DNA 溶于 T E 缓冲 液 (10 mm o löL T ris2HC l, 1 mm o löL ED TA )中备 用。 113　PCR　所用寡核苷酸引物见表 2。引物 eae A O 157 根据已发表的大肠杆菌 O 157 ∶H 7 株 EDL 933 的 eae 核苷酸序列 ( EM BL accession N o. Z11541) 而合成; 引物 f liC h7根据已发表的大 肠杆菌 O 1∶K1∶H 7 株 U 5241 的核苷酸序列 (accession num ber L 07388) [ 14 ]合成。PCR 反应体 积为 50 ΛL , 含有 1 Λg DNA , 10 mm o löL T ris2 HC l (pH 814 ) , 50 mm o löL KC l, 210 mm o löL M gC l2, 012 Λm o löL 各寡核苷酸引物, 012 mm o lö L 各 dA T P, dCT P, dGT P 和 dT T P, 215 U T aq DNA 聚合酶 (华美生物工程公司)。扩增循环参数 是: 94℃ 15 s, 65℃ 15 s, 72℃ 75 s, 每个循环重复 35 次, 最后一个循环在 72℃反应 5 m in。 表 2　试验用寡核苷酸引物 引　物 寡核苷酸序列 在基因内的位置 预期扩增引物大小 (bp ) eae A O 157 EA E1572F CA GGTCGTCGT GTCT GCTAAA 1 959～ 1 979 EA E1572R TCA GCGT GGT T GGA TCAA CCT 3 047～ 3 027 1 087 f liC h7 FL ICH 72F GCGCT GTCGA GT TCTA TCGA GC 69～ 91 FL ICH 72R CAA CGGT GA CT T TA TCGCCA T TCC 694～ 671 625 2　结果 　　本试验用 eae A O 157和 f liC h7 2 对引物从 10 株 标准 EH EC O 157∶H 7 中分别扩增出了所预期的 1 087 bp 和 625 bp 的 DNA 片段, 从 1 株标准 EH EC O 157∶H 2中扩增出了 1 087 bp 的 eae A 基因的DNA 片段, 未扩增出 625 bp 的 f l iC 基因 的DNA 片段, 未从另外 2 个常见 EH EC 血清型 O 26 和O 111 菌株中扩增出任何DNA 产物, 也未 从试验用其他不同属 39 株已知肠道致病菌株中 扩增出任何DNA 产物。部分标准阳性 EH EC 菌 株的 PCR 结果见图 1。 3　讨论 　　自 1982 年以来, EH EC, 特别是大肠杆菌 O 157∶H 7 在美国和日本等地引起了多起疾病暴 发事件, 在我国也有散发病例的报道。因此, 近年 来关于大肠杆菌O 157∶H 7 及其所致疾病的研究 备受关注, 其中大肠杆菌O 157∶H 7 的检测和鉴 定是学者们研究的重点之一。 最近的研究表明, 大多数 EH EC 拥有 eae A 基因, 一些 EPEC 菌株也拥有 eae A 基因, 而且已 　图 1　EH EC eae A 和 f liC 基因的 PCR 结果　 M 1M arkers (pBR 322 DNA öH ind É ) ; 11 大 肠杆菌 O 157∶H 7 91229281; 21 大肠杆菌 O 157∶H 2E32511; 31 大肠杆菌 O 111∶H 2 E45035; 41 大肠杆菌O 26∶H 11 9637; 51 大肠杆菌O 157∶H 7 9628; 61 大肠杆菌 O 157∶H 7 9629; 71 大肠杆菌 O 157∶H 7 9630; 81 大肠杆菌O 157∶H 7 (山东省卫生 防疫站临床分离株) 发现大肠杆菌O 157∶H 7 的 eae A 3′末端和别的 菌株的该基因有序列上的差别, 即具有O 血清型 的特异性。有人利用这一特性设计出寡核苷酸引 物, 从所有试验用的大肠杆菌O 157∶H 7 (NM ) 中 扩增出了 DNA 产物, 唯一的例外是从 V T EC O 145 和 EPEC O 55 中扩增出了DNA 产物[ 9 ]。本 942第 3 期 周志江等: 用 PCR 鉴定大肠杆菌O 157∶H 7 © 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 研究采用 Gannon 等[ 9 ]设计的引物, 从试验用的 所有 10 株大肠杆菌O 157∶H 7 中扩增出了预期 大小的DNA 产物, 未从其他不同属的 43 株肠道 致病菌中检出任何DNA 产物。本研究根据大肠 杆菌U 4125 O 1∶H 7 的H 7 鞭毛抗原的核苷酸序 列合成了 1 对寡核苷酸引物, 从所有 10 株大肠杆 菌O 157∶H 7 中检出了 f l iC 基因, 而未从大肠杆 菌O 157∶H 2中检出 f l iC 基因, 也未从所有其他 43 株试验菌中扩增出任何DNA 产物。这个结果 表明, 尽管引物是根据大肠杆菌O 1∶H 7 的 f l iC 基因核苷酸序列设计的, 但大肠杆菌 O 157 的 f l iC 基因和大肠杆菌O 1∶H 7 的 f l iC 基因具有 较高的同源性。 尽管用 eae A O 157 引物可从 V T EC O 145 和 EPEC O 55 中扩增出DNA 产物, 用 f liC h7引物可 从大肠杆菌O 1∶H 7 和大肠杆菌O 55∶H 7 等菌 株扩增出 DNA 产物[ 10 ] , 本研究是 eae A O 157 和 f liC h7引物同时使用, 用 2 对引物都产生DNA 产 物的, 就是大肠杆菌O 157∶H 7。至于用 2 对引物 也可从大肠杆菌O 55∶H 7 中扩增出DNA 产物, 则可以用V T 特异性引物做 PCR 或用特异性鉴 定血清加以鉴别。作者认为, 本研究所建立的 PCR 法对于从临床样品中筛选大肠杆菌O 157∶ H 7 可能是一个有用的方法。 参　考　文　献 1　Hofm ann S L. Sh iga2like tox ins i hemo lytic urem ic syndrom e and th rom bo tic th rom bocytopenic purpura. JAM A , 1993, 306: 398 2 　 Karm ali M A , Petric M , L im C, et a l. T he association betw een idiopath ic hemo lytic urem ic syndrom e and infection by vero tox in2p roducing E scherich ia coli. J Infect D is, 1985, 151: 775 3　Siegler R L. H emo lytic urem ic syndrom e in ch ildren. Curr Op in Pediatr, 1995, 7: 159 4　Konow alchuk J , Sp iers J L , Strarvic S. V ero response to a cyto tox in of E scherich ia coli. Infect Imm un, 1977, 18: 775 5 　Basta M , Karm ali M , L ingwood C. Sensit ive recep to r2 specified enzym e2linked imm uno so rben t assay fo r E scherich ia coli verocyto tox in. J C lin M icrob io l, 1989, 27: 1617 6　Coa C Y, Yam asak i S, L in Z, et a l. Specific detection fo r vero tox in 2 varian t, V T 2vp l, by a bead2enzym e2linked imm uno so rben t assay. M icrob io l Imm uno l, 1994, 38: 435 7 　 H ii J , Gyles C L , M o rooka T , et a l. D evelopm ent of vero tox in 22 and vero tox in 2 varian t ( V T 2v ) 2specific o ligonucleo tide p robes on the basis of the nucleo tide sequence of the B cistron of V T 2v from E scherich ia coli E32511 and B2F1. J C lin M icrob io l, 1991, 29: 2704 8　Cannon V P J , King R K, Kim J Y, et a l. Rap id and sensit ive m ethod fo r detection of Sh iga2like tox in2p roducing E scherich ia coli in ground beef using the po lym erase chain reaction. A pp l Environ M icrob io l, 1992, 58: 3809 9　Gannon V P J , Rashed M , King R K, et a l. D etection and characterization of the eae gene of Sh iga2like tox in p roducing E scherich ia coli using the po lym erase chain reaction. J C lin M icrob io l, 1993, 31: 1268 10　Gannon V P J , D′Souza S, Graham T , et a l. U se of the flagellar H 7 gene as a target in m ultip lex PCR assays and imp roved specificity in iden tification of en terohemo rrhagic E scherich ia coli strains. J C lin M icrob io l, 1997, 35: 656 Iden tif ica tion of Escher ich ia coli O157∶H7 by PCR 　Zhou Zh ijiang　H uang Shangyuan3 　Zheng M ingguang　W ang L iya3 　W ang L i3 　L i J ingyun3 　 (V eterina ry Colleg e, U n iversity of A g ricu ltu re and A n im a l S ciences, Chang chun 130062) 　　Abstract　Tw o sets of o ligonucleo tide p rim ers derived from the sequences of the eae A gene of E scherich ia coliO 157 ∶H 7 and the f liC gene of E scherich ia coli respect ively w ere syn thesized, and a po lym erase chain react ion (PCR ) m ethod w as developed fo r the iden tificat ion of E scherich ia coliO 157∶H 7. A to tal of 10 E scherich ia coliO 157∶H 7 (NM ) and 43 o ther recogn ized en teropathogen ic bacteria of several genera w ere studied. T he expected PCR amp lificat ion p roducts w ere observed on ly in DNA s from recogn ized E scherich ia coli O 157∶H 7 (NM ) , and no amp lificat ion p roduct w as observed in the temp late DNA s ex tracted from o ther en teric pathogens. T h is m ethod w as ab le to determ ine the E scherich ia coli O 157∶H 7 sero type direct ly on the basis of specific genes, and show ed a h igh specificity. T h is PCR m ethod m ay be a new w ay fo r the detect ion and iden tificat ion of E scherich ia coli O 157∶H 7. 　　Key words　PCR; eae A gene; f liC gene; E. coli O 157∶H 7 　　3 D ep artm en t of M icrobiology , 302 H osp ita l of PL A , B eij ing 052 中　　国　　兽　　医　　学　　报 1999 年 © 1995-2004 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.