河南大学
硕士学位论文
蛇莓的组织培养及玻璃化法超低温保存离体茎尖
姓名:薄涛
申请学位级别:硕士
专业:遗传学
指导教师:王子成
20100501
河南大学2010届硕七研究生学位论文
摘要
本研究以宝天曼野生蛇莓(DuchesneaeIndicae)茎尖为外植体,建立了蛇莓的组织培养和快
速繁殖体系。另外,对蛇莓离体茎尖的玻璃化法超低温保存过程进行了初步研究。为蛇莓的进
一步研究提供了科学依据。主要研究结果如下:
(1)最佳诱导培养基为MS+2.0mg·L一6-BA,诱导分芽率为100%,平均分化系数为
19.87+1.51;最佳增殖培养基为MS+2.0mg·L.16-BA+0.01mg·L-1IBA,平均增值系数为
9.47士1.51;生根培养基使用MS,并且不添加任何激素时效果比较理想,平均根长和平均生根
数分别为(4.15士-0.92)cm和(6.73+1.58)条。
(2)以玻璃化法进行蛇莓离体茎尖的超低温保存初步研究。研究了低温锻炼时间、预培养
时间、预处理时间、PVS2处理时间、液氮保存时间对蛇莓离体茎尖超低温保存后存活率的影
响。结果
明,切取继代30d,4℃低温锻炼3-4周生长健壮的蛇莓茎尖1~2mm,在固体预
培养培养基(s0Iidpre-culturemedium,SPCM:MS+184.2g-L。1甘油+136.9g-L‘1蔗糖+7g·L.1琼
脂)中室温下培养4d后,转入无菌冷冻管。向冷冻管中加入液体预处理培养基(1iquid
pretreatmentmedium,LPTM:MS+184.2g.L以甘油+136.9g·L.1蔗糖),于20℃处理20--30min;
用植物玻璃化溶液2(plantvitrificationsolution2,PVS2:MS+300g'Ld甘油+150g'L。乙二醇
+150g-L~DMSO+136.9g-Ld蔗糖)取代液体预处理培养基,于0℃处理50---70rain后,换成
新鲜PVS2,快速投入液氮中保存1h,于40℃水中快速解冻1rain,洗液洗涤3次,每次10min,
取出茎尖,接种到再生培养-基(regenerationmedium,RM:MS+I.0mg·L1GA3+1.0mg·L.1
6-BA+30g-L。蔗糖+7g·L.1琼脂)。暗培养4d后,转入光照培养,7d后统计存活率。结果表
明,最高存活率可达(43.00-a:7.58)%。
关键词:蛇莓组织培养快速繁殖超低温保存玻璃化法
河南大学2010届硕士研究生学位论文
Abstract
Shoot-tipsofwildDuchesneaeIndicaewhichcamefromBaotianmaninHenanweFeusedas
explantsinthisresearchinordertoestablishingthesystemoftissueculture.Inaddition,Vitrification
WaSusedoncryopreservationofDuchesneaeIndicae.Thispapersupplymorescientificindication
forresearchingDuchesneaeIndicae.Themajorconsequencesaledisplayedasfollows:
(1)TheoptimalinductionculturemediumwasMS+2.0mg·L.16。BA,inductionratioreachedtO
100%,averagedifferentiationindexwas19.87士1.51;theoptimumreproductionmediumWasMS+
2.0mg·L’16.BA+O.01mgrL—IBA.averagereproductioncoefficientWas9.47圭1.51;whenMS
withoutanyhormoneaSrootingmedium,resultswerebetter,averagerootlengthandquantitycan
reach(4.15:£-0.92)cmand6.73士1.58separately.
(2)Theeffectofvariousfactorsofvitrification,forexample,cryoacclimationtime,pre—culture
time,pretreatmenttime,PVS2treatmenttime,cryopreservationtimeinLiquidNitrogen,WaSstudied
onsurvivalrateofDuchesneaeIndicaeshoottipsaftercryopreservation.Theresultsshowedthat
shoottips1--2mmlengthWascutfromDuchesneaeIndicaeafter30d subcultureand
cryoacclimatized3~4weeksat4℃;culturedinsolidpre—culturemedium(SPCM:MS+184.2g'L。1
glycerol+136.9g.L-1sucrose+7g-L"1agar)after4datroomtemperature;putthemintosterile
frozentubewithliquidpretreatmentmedium(LPTM:MS+184.2g'L’1glycerol+136.9g-L’1
sucrose)at20℃for20--,30rain;replacedLPTMwithPlantVitrificationSolution2(PVS2:MS+
300g'L11glycerol+150g.L’1ethyleneglycol+150g.L‘1DMSO+136.9g-L‘1sBcrose)at0℃for
50~70rain;changedfreshPVS2,preservedinLiquidNitrogenfor1h:threwrapidlyinto40"t2water
for1min;waShedtheshoottipswithsolutioncontainedMSand1.184.2g'L—sucrose3times.10
minatime;plantedtipstoregenerationmedium(RM:MS+1.0nag·L.1GA3+1.0rng·L.16-BA+30
g-L’1sucrose+7g-L。1agar)indarkfor4d;thennormallycultured,After7d,countedthesurvival
rate.Thebestsurvivalratewas(43.OO士7.584、%.
Keywards:DuchesneaeIndicae,TissueCulture,RapidReproduction,Cryopreservation,
vi喇fication
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缩略词表
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使用篷的材糟。与裁一阍工作妁戆事对本研究所徽的任僻贡献均已巷论交中锋
7明确的说明并豪示了谢意。
攀铱孝讶人《擘钮论文锋者>鍪名:蕴渣
20/o卑g-勇心曩
关于学位论文著作投使用授权书
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(涉及繇密癍客的攀位论克在群密戆适臻表授掇书)
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论文题目:蛇莓的组织培养及玻璃化法超低温保存离体茎尖
毕业院校:河南大学
论文类型:d硕士论文 口博士论文 口博士后研究报告 口同等学力论文
授权人签字:蔼滴
2010年5月1日
河南大学2010届硕士研究生学位论文
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本论文及相关图表、数据、结果等内容,未经论文作者和导师允许,不得公开或转载,特
此声明。
河南大学2010届硕士研究生学位论文
1前言
1.1蛇莓简介
蛇莓(DuchesneaeIndicae)为蔷薇科蛇莓属多年生宿根型双子叶草本植物,最早的记载出现
于《别录》,别名宝珠草、野杨梅、蛇含草、三匹风、地莓、一点红等【l】。在我国绝大区域包
括东部、南部、西南部和中部都有分布。自然条件下,在田埂、山坡、沟边、路边等处长势良
好,能形成大片群落吃蛇莓株高约16CITI;匍匐茎,茎长可达115.2cm。叶为三出掌状复叶,
新叶嫩绿,老叶深绿,高温或严寒时叶色变为紫红色。叶形美观,叶片多,覆盖面积大。花成
金黄色,盘状,整花直径1~1.2锄:花瓣卵形,5枚。花单生,着生于叶腋处。果球形,深
红色‘31。蛇莓移栽苗与扦插苗相比,在茎长、株高、单果重、茎粗、单株总叶面积、单张复叶
面积等方面不存在明显差异,但移栽苗的各项指标均高于扦插苗。表明蛇莓移栽苗时带根、带
叶,栽后容易成活,植株迅速生长。采用蛇莓匍匐茎扦插繁殖,生根率高。但因扦插后生根需
要一段时间,与移栽繁殖相比成坪时间和开花结果时间都有所延迟。另外,蛇莓的叶、花、果
有观赏价值,具有广泛的适应性和较强的抗逆性,可被广泛应用于城市园林绿化,是公认的较
有推广应用价值的野生花卉和有较高价值的乡土地被植物‘4,51。蛇莓在民间常用作草药,具有
消肿散瘀、清热解毒、止血凉血功效。民间主要用于治疗烫伤、肠炎、痢疾、疔疮肿毒、蛇咬
伤等。现代药理研究表明蛇莓具有较强的抗炎、抑菌、抗肿瘤、中枢神经系统抑制、降压以及
引起子宫兴奋等作用。蛇莓成熟果实内含丰富的木栓酮、蛋白质、糖类、单宁、维生素E、羽
扇豆醇等。种子里含的亚油酸可防止动脉粥样硬化。蛇莓全草含有多种化学成分,从蛇莓中分
离得到的化合物主要有三萜及其香豆素类、苷类、甾醇类、黄酮类等。近年发现该植物中含有
的酸酚和三萜类成分,具有显著的抗氧化和抗肿瘤等药理活性卜16】。因此,其研究得到重视。
目前对蛇莓的研究主要存在于化学成分分析、病理毒理研究、引种栽培和绿化环境等方面。对
蛇莓的组织培养研究仅见于1980年杨乃博f17】,但不系统。有关蛇莓种质资源保存的研究尚未
见报道。随着人类活动的加剧,蛇莓的自然生境受到很大的影响,开展蛇莓的组织培养研究和
超低温保存研究,对于蛇莓的保存和利用及进一步的生物学研究都具有重要的意义。
1.2植物种质资源保存
蛇莓的组织培养及玻璃化法超低温保存离体茎尖
1.2.1植物种质资源保存的意义
种质是决定生物遗传性状,并将遗传信息从亲代传递给子代的遗传物质的总称。植物种质
资源是指带有不同种质的各种栽培种及近缘种、野生种和杂草种的统称‘18】。种质资源是大自
然留给人类的宝贵财产,是重要的自然资源之一,是研究遗传学、物种进化及进行植物育种的
物质基础,同时也为我们的衣食住行提供原始资料,是关系到一个国家和民族竞争力的重要战
略资源【19+20l。
随着世界人口的持续增长,工业化进程的不断加快,人们消费水平的日益提高,使得自
然资源被过度地开发和利用。另外,不断加剧的环境污染和异常变化的全球气候,都使得种质
资源受到前所未有的严重威胁,特别表现在大量的野生种质资源的不断减少甚至丧失上【21~231。
一种种质资源是长期自然演化及自然和人工选择的结果。一旦丢失,物种就可能从此灭绝,其
基因也将一去不复返,如历史上著名的浙江苋桥地黄现已丢失【241。同时,由于现代农业的高
速发展,推广和种植由常规作物改良而成的品种成为一种趋势,而这些品种大多来自少数优良
品系,这就使得种植品种日趋单一化,从而使植物遗传基础越来越狭窄,导致抗病虫害和逆境
适应能力越来越低,加快了物种灭绝的速度f25】。历史上曾经出现过因作物的遗传多样性减少
而引发的灾难。最著名的是19世纪40年代,马铃薯疫病流行,导致爱尔兰大饥荒,100000
人因饥饿而死【2¨71。与国外情况相似,我国作物遗传资源多样性的破坏和丧失也异常严重。
1949年我国有10000个小麦品种在种植使用,但到70年代仅存1000个品种。另外,野生
水稻和野生大豆的原产地也遭到严重破坏,面积越来越少。有不少报道指出,种植的玉米、甜
菜、水稻等作物杂交种的遗传基础日趋狭窄,存在遗传脆弱性和突发毁灭性病害的隐患【28—321。
因此,可以认为保护种植资源就是保护生物多样性,是造福子孙后代的大事,已经得到世界各
国政府的高度重视。
另一方面,种质资源是基因的载体,是选育新品种和从事基因工程的基础【21,271。掌握种
质资源越丰富,对育种越有利。不论是近缘杂交育种、远缘杂交育种、倍性育种、辐射育种,
还是基于基因工程和细胞工程的现代育种,都不可能离开丰富的种质资源。作物育种的顺利进
行和突破性进展都与所需种质资源的发现、开拓和正确利用有关,如袁隆平杂交水稻培育的成
功,关键就在于发现了野生水稻中优秀的资源【221。随着生物技术的发展,特别是打破种界限
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的分子育种技术的进步,使得所有的遗传资源均有被利用可能和潜在价值。一旦克隆出某个有
益基因,就可以通过遗传转化来实现目的基因向目标种质的转移,从而有目的地对某个性状进
行遗传改良【33幽1,而这一切也是以车富的种质资源为前提的。没有丰富的种质资源就不可能
从中选取优秀的基因用于育种,也就不会出现优良的品种。由此可见,对植物种质资源的保护
势在必行。
1.2.2植物种质资源保存的方法
1.2.2.1原境保存
原境保存是指将植物在其原有生活地就地进行保存,以达到使其自我繁殖目的的保存方
法。主要采用建立自然保护区和天然公园等形式来保护野生物种‘35埘】。该种方法主要用于林
木和作物资源野生种的保护13¨71。在原境保存中,物种未经人工选择,分布面大,生境各异,
遗传变异极为丰富,作为种质资源保存方法,这是十分经济有效的,尤其对一些采种困难的物
种。原境保存被认为是生物多样性保护的最有力和最高效的方法。联合国粮农组织(FAO)认为,
野生种的原境保存应该是保护整个生态系统,是种质资源长期保存的最理想的方法。它不仅保
护了所在环境中的物种个体、种群或群落,而且还能维持所在区域生态系统中的能量流动和物
质循环,保证被保护物种的正常生长发育和种内遗传变异f20,3弘3引。拟定合理的原境保存计划应
该建立在充分的系统调查基础上。确定优先保护的种时,不仅应考虑它的稀少程度,还应考虑
它的经济价值、社会价值和遗传资源枯竭等情况Ⅲ】。原境保存时,还需注意按照不同的生态
区找出遗传变异丰富的保存群体‘411。但随着生态环境的严重破坏和急剧恶化,使得原境保存
越来越困难,许多野生资源遭到极其严重的破坏,对某些物种的多样性带来质的毁灭。
1.2.2.2异境保存
异境保存也称迁地保存,是指将种质资源保存于植物原产地以外,较为适宜的地方以达到
长期保存目的的保存方法【4舶。这种方法多用于抢救一些在自然界受到严重威胁的珍稀濒危物
种【43】,而且在相当长的一段时间内被认为是惟一的保护措施m1。植物园是异境保存稀有濒危
植物最主要的场所,据统计,约30%受到威胁的植物已保存在全球1800个主要的植物园中f45】。
我国植物园约有140个,引种保存了中国植物区系的植物约17000种,其中第一批国家重点
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蛇莓的组织培养及玻璃化法超低温保存离体茎尖
保护植物的85%被引种保存f46】。和动物相比,植物的异境保存相对方便,主要是因为植物的
管理和繁殖相对容易。大多数植物对环境条件的要求并不十分苛刻,在植物园中容易栽活,并
且植物具有多样化的繁育系统,其自然生殖和人工繁殖都比动物容易。但是,濒危植物的异境
保存也有其自身的特殊性。必须对保存对象的繁殖方法、生长发育特性和种子贮藏方法等进行
研究。而原始群体的取样、取样基因型在新环境下的生存及生长适应能力和取样个体在新环境
下的交配方式,仍是影响保存能否维持遗传完整性和多样性的关键因素‘47枷】。另外,植物园
在收集和引种过程中,普遍存在遗传混杂、来源不清和盲目定植等问题,这给被保护的植物带
来一系列的遗传风险,如遗传多样性丧失、近交衰退、杂交衰退、遗传适应等,特别是在濒危
物种的回归引种时,问题会显得更为突出【491。
1.2.2.3种子保存
种子是植物物质传递给子代的有性繁殖体,是最主要的种质材料。种子中蕴藏着极为丰富
的遗传信息,同时还可防止因单一保存无性系而造成的基因特异性丧失。1973年,Robens【50】
根据种子的贮藏特性,把种子分为正统型种子和顽拗型种子两类。正统型种子的含水量能被干
燥至5%以下而不受伤害,并且其贮藏寿命随种子含水量和贮藏温度的降低而增长,大部分林
木和栽培作物的种子属于此类型;顽拗型种子脱离母体时不经过成熟脱水期,其含水量相对较
高,通常不低于15%,且对脱水及低温敏感,因此不耐储藏,寿命短,干燥过程中往往发生
脱水损害,活力降低。龙眼、荔枝、芒果、椰子、咖啡等种子属于此类型【51~541。到目前为止,
对顽拗型种子的保存已取得阶段性成果,如黄皮种子、可可种子、木菠萝种子155~571。这些种
子经过适当处理后都可以不同程度的延长种子的保存时间。
利用种子进行种质资源保存是保存植物遗传资源最简单和最经济的方法,它主要用于野生
果树、砧木材料、无融合生殖类型和种子繁殖的果树以及某些实生繁殖(将种子播种于土中生
长成成苗的繁殖方法)的群体品种【5引。贮藏种子的目的是为了保存子代种质样本,延长种子寿
命和保持种子活力,后两者是最为基本的目标。1972年Harringtonl59】提出了两条延长种子寿命
的通则:种子含水量每降低1%(含水量在4%一14%之间),寿命可延长1倍;在一定温度范围
内,贮存温度每降5℃(温度在0--50℃之间),寿命可延长1倍。FAO和国际植物遗传资源委
员会(IBPGR)基于上述理论基础,提出了种质中长期贮藏的技术标准160“21:长期贮藏温度为.18
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℃或更低的温度,种子含水量为3%一7%;中期贮藏温度为0℃或0℃以下,种子含水量为
3%、一7%。所以,只要注意利用种子的遗传变异性和生理特性来控制保存环境、改变保存条件
就可以延长其保存时间。但以种子作为种质保存的方法也有其局限性,一些果树如苹果、柑橘
等多采用无性繁殖;香蕉、脐橙等,属于高度杂合性的多倍体不育种,难以产生种子,不能用
种子进行贮藏。此外,种子保存的方法多是基于降低含水量来达到延长种子寿命的目的,而目
前在实验条件下得到的种子最适含水量是否代表种子正常贮藏时的最适含水量,其是否随贮藏
温度而变化,种子最适含水量能否作为保存的判断依据,仍需要作更为全面而深入的研究【631。
1.2.2.4常温组织培养技术保存
20世纪50,--60年代,植物组织培养技术开始出现,并得到不断地发展和完善。1975年,
Henshaw和Morel等【641首次提出把组织培养技术用于保存植物种质资源。利用组织培养技术
保存种质资源具有占用空间小、免遭病虫害威胁等优点。保存的材料十分广泛,可使用原生质
体、未分化细胞、愈伤组织及其分化形成的芽或胚,但最理想的是茎尖和分生组织。因为它们
在遗传上较细胞或其他部位更稳定,最大优点是再生容易‘5引。属于顽拗型种子的材料,通过
茎尖培养方式保存更方便。组织培养保存主要有一般保存和缓慢生长保存。
一般保存是指在常规组织培养条件下,通过对组织培养物进行继代培养来实现保存植物种
质资源的保存方法,对种质资源的运输交换和脱除病毒很有帮助。保存的材料可以随时进行组
织快繁,因此利用起来较方便。多种植物种质资源的体外保存都采用这种方法【651。但由于需
要频繁继代,稍有不慎,就可能导致材料污染、混淆甚至丢失。另外,由于长时间频繁继代,
常会导致遗传变异的发生166两71。所以,不宜用于种质资源的长期保存,是一种短期保存方法。
缓慢生长保存是指通过改变培养物生长的环境条件,使其生长速度减慢,以达到减少继代
次数,延长继代时间的保存植物种质的方法。主要途径有:调整培养基养分,添加生长抑制剂
或延缓剂,控制生长环境条件等f67稍】,这些也被称作保存的技术因素。非技术因素主要是指
外植的体类型和生理状态、保存容器类型和体积以及封口材料等f68】。在具体操作中,通常是
多种因素同时作用效果最好。有报道显示,使用生长抑制物可能引起较大的遗传变异,而通过
控制生长环境条件和减少营养物来控制生长的保存方法一般不会导致遗传物质的变化‘7们。但
培养在甘露醇培养基上的马铃薯茎尖,DNA发生了甲基化变化f711。因此,有学者建议,为了
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蛇莓的组织培养及玻璃化法超低温保存离体茎尖
减少体细胞无性系变异的发生,应尽量避免在培养基中添加生长抑制剂或延缓剂、渗透调节剂
和生长调节剂等胁迫物质。另外,还有学者认为,随着培养世代数的增加,体细胞无性系变异
频率会不断增加【721。
1.2.2.5超低温保存
低温生物学诞生于19世纪末‘731。进入20世纪,特别是1949年Polge等㈣发现甘油能降低低
温对细胞伤害后,使得低温保存技术得到迅猛的发展。超低温保存是指在.80℃以下的超低温
中保存种质资源。超低温常用的冷源有干冰(-79℃)、深冷冰箱、液氮(-196℃)及液氮蒸汽相
(-140℃),其中应用最广泛的是液氮f73,75】。在超低温中,植物的各种生命活动几乎处在停滞状
态,可极大的延长材料的保存时间,而不产生变异173,76】,被认为是目前实现生物种质永久保存
的最佳方法。有关超低温保存成功的最早报道见于1973年Nag和S仃eet【77l对胡萝卜悬浮细胞的
保存。用于超低温保存的材料可以是愈伤组织、胚轴、茎尖分生组织、花粉、根尖、休眠芽、
原生质体等【73,7引。其中茎尖分生组织的细胞分生能力强,分化程度小,在保存后的再生过程中,
比其它细胞培养物的遗传稳定性更稳定,所以是超低温保存的理想材料。冻存的茎尖分生组织
可以直接分化生长成完整的植株,快速的进行无性繁殖,尤其对那些易产生体细胞无性系变异
和靠营养繁殖的物种来说,茎尖分生组织更是理想的保存材料【7蝴01。
1.2.2.5.1超低温保存理论基础及一般程序
细胞在降温到.10℃时,胞外介质开始结冰,而胞内尚未结冰,由此造成细胞内外蒸汽压
差。只要降温速率不超过脱水的连续性,胞内的水分就会不断地向胞外扩散,造成原生质体浓
缩,从而降低细胞内含物的冰点。这种逐步除去细胞内水分的过程称为保护性脱水【73,81】。它能
有效地阻止细胞质或液泡结冰,但也会造成溶液效应。这是因为过度脱水使细胞内pH值发生
变化、有害物质积累、盐浓度上升、蛋白质分子间形成二硫键、破坏蛋白质、酶、膜的完整性
等。此时若降温速度加快(10℃·min-1以上),细胞内的自由水来不及扩散到周围溶液,细胞内
就会产生大量冰晶,造成冰害,导致细胞死亡。这就是冷冻伤害的两因素假说f75】。但如果降
温速度很快,使细胞质溶液“固化”,胞内就形成对细胞不致伤害的微小冰晶或非结晶的玻璃化
状态。从理论上讲,细胞内含物一旦发生玻璃化就能避免细胞内结冰,避免对细胞器和细胞膜
造成伤害【73,75.82】。任何液体只要有足够的降温速度都可以进入玻璃化状态,但要使纯水发生玻
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璃化,降温速度需高达1010℃·S~,这是常规的冷却技术难以达到的。然而通过添加高浓度的
冷冻保护剂,可以促进被保存材料在结冰早期进行保护性脱水,阻止冰晶生长,从而使之容易
达到玻璃化状剁731。因此,进行植物种质超低温保存时,控制降温速度及添加冷冻保护剂对
防止细胞内结冰,发生玻璃化是至关重的‘83埘】。冷冻保存过程中的处理也是以此为基础的,
以避免产生冷冻伤害为目的的。
超低温保存的一般程序为:(1)选择适宜年龄和生长状态的材料;(2)对生物材料进行预处
理,主要是减少细胞内自由水的含量,使材料达到最适于超低温保存的生理状态;(3)将材料
装入试管或其他保存容器中,放入冰浴中;(4)在冰浴条件下加入0℃预冷的冷冻保护剂处理;
(5)采用不同的降温方式进行冷冻,直至放入液氮中;(6)保存后的化冻。一般采取在37—40℃
温水中快速化冻。(7)材料化冻后的活力鉴定。通过进行再培养,观察材料恢复生长的速度及
植株的再生能力,分析冻后材料或再生植株的遗传性状【73,85】。
1.3.2.5.2超低温保存方法
(1)慢冻法通常是以(O.5~1.0)℃·min。1的降温速度,从0℃降到-30~-40℃,然后投入液
氮,或者以缓慢的速度连续降到.196℃。在有些情况下,在.30—40℃预冻一段时间,然后才
浸入液氮,此方法称之为两步冷冻法或分步冷冻法,主要用于悬浮细胞和原生质体的超低温保
利蚓。Brison等1871采用两步冷冻法,成功保存了两个桃砧木品种的离体茎尖,存活率分别为
69%和74%。这种方法需要程序降温器,步骤较为繁杂。
(2)快冻法该方法是将材料从0℃或从其他预处理温度直接投入液氮或其蒸汽相中,其
降温速度可达300~1000℃.min~,远远超过部分学者认为的40℃·minll78】。快速降温可使细
胞内的水还未形成冰核,就降到了.196℃的安全温度,从而减小了细胞内结冰的危险【73.跚。
此方法简单,不需复杂、昂贵的设备,比较适用于高度脱水的植物材料。
(3)玻璃化法在冷冻前,使用高浓度的冷冻保护剂,即玻璃化液在25℃或0℃处理一段
时间,然后投入液氮保存,此时冷冻保护剂和被保存材料一同进入玻璃化状态。Kobayashi等
【891将脐橙珠心细胞经玻璃化过程后,放入液氮中保存la,平均存活率超过90%。通过DNA
及形态学
显示遗传物质及再生的植株形态与保存前都没有变化。Sakai等‘901将脐橙、葡萄、
柚等6种植物的珠心细胞通过玻璃化方式.在液氮中保存4个月,存活率也在90%左右。玻
7
蛇莓的组织培养及玻璃化法超低温保存离体茎尖
璃化法简单易行,省时省力,在植物的超低温保存研究中得到了广泛的应用[81,84】。但保护液中
的一些成分对植物材料的毒害作用较大,并且较难在同一时间内处理大量的材料。另外,脱水
胁迫作用也影响保存的存活率。
(4)包埋/脱水法该法是基于人工种子技术,结合超低温保存需要,将包埋和脱水相结合
产生的。用海藻酸盐包埋茎尖,在含高浓度蔗糖的液体培养基中脱水后,再用无菌风或硅胶处
理,使其进一步脱水,然后进行超低温保存。此方法容易掌握,脱水过程缓和,脱水程序简化,
一次能处理较多材料,不使用对细胞有毒的冷冻保护剂,但在一些植物中,成苗率低,与玻璃
化法相比,组织恢复生长较慢,脱水所需时间长。Niino等f9l】利用包埋/脱水方式在液氮中保存
苹果、梨及桑树离体茎尖5个月后,检测存活率在80%以上;而将这三种材料胶囊化后,再
经过一个脱水过程(含水量在40%左右),放入.135℃下保存5个月,仍都能再生成苗。
(5)包埋/玻璃化法它是结合玻璃化法和包埋/脱水法的优点建立起来的。首先应用于康乃
馨茎尖分生组织的保存,并获得成功【92】。随后在芥菜【931、草莓【州、百刽951、辣根‘蚓等植物的
超低温保存中得到应用。与包埋/脱水法的不同之处在于用玻璃化溶液处理代替了干燥过程,
进行材料脱水处理,然后包裹珠与玻璃化溶液一同进入玻璃化状态。该方法具有能同时处理大
量材料,操作简单、脱水时间短、成苗率高等特点。
1.2.2.5.3影响超低温保存的因素
影响植物种质超低温保存效果的因素很多,任何一个环节处理不当,均可能导致整个系统
的失败。
(1)材料大小材料太小,切取困难,而且加大切取时对材料的伤害;材料太大,影响预
处理效果,冻存中易受冷冻伤割971。
(2)植物材料的特性植物材料间基因型差异及培养物所处的发育时期和生理状态不同,
导致保存后的效果也不同。细胞分裂旺盛、细胞体积小、原生质稠密、液泡小而少和含水量少
的材料,利于超低温保存。因为这种细胞冻存时结冰小而少,化冻时再结冰的危险性小,故冻
存存活率高f98】。
(3)预处理其目的是提高细胞分裂频率和分化的同步化,减少细胞内自由水的含量,增
强植物的抗冻力。预处理的方式主要有低温驯化和在培养基中添加保护剂两种方式。一些本身
R
河南大学2010届硕士研究生学位论文
具有较强抗寒力的植物材料经低温驯化,可明显提高存活率。预处理中更常用的方法是在培养
基中添加一至几种保护性物质。其中,使用高蔗糖培养基预处理的最多,一般用0.3~o.7mol·L-1
蔗糖MS培养基。此外,DSMO使用也较多,因为DMSO冰点低,它进入细胞后,不仅降低
材料含水量,而且可降低细胞内溶质的结冰点‘吟1051。
(4)降温材料冻害的发生主要存在于降温过程中,为了减少冻害,提高存活率,必须尽
量阻止细胞内冰晶的形成。液泡小和含水量少的细胞,如茎尖分生组织,可采用快速降温方式。
液泡大和含水量高的细胞宜用慢速降温方式。到目前为止,尚未找到一种适于植物冷冻保存的
通用降温方法【1咻10甜。因此,选择一种适宜的降温方法对材料冷冻保存至关重要。
(5)冻存一般认为冻存过程不会发生什么伤害,只要不断补充液氮,就可长期保存冷冻
材料。一般情况下,材料在液氮中保存的时间长短可能不是影响保存效果的重要因素‘105,1091,
但仍需进一步研究证明。
(6)解冻的速度此项是超低温保存技术的关键,贮藏于液氮中的材料,缓慢升温时,细
胞内会再次结冰,因此在解冻时应迅速通过巧O—40℃冰晶生长区,避免细胞再次结冰而造成
伤害。生长季节中的材料,一般37—40℃温水中快速化冻比在室温下慢速化冻要好,而果树
植物的冬芽在超低温保存后却必须在0℃低温下进行慢速化冻。另外,化冻速度与降温速度也
有一定关系。一般样品脱水程度愈高,对化冻速度愈不敏感Ⅲ∞111】。
(7)后处理若解冻后残留于细胞内的冷冻保护剂能影响到细胞的恢复与继续生长,应将
其除去。在采用稀释法洗涤时,温度和速度非常重要,最常用的是在含有1.1mol·L。1蔗糖培养
液中,于25℃下洗涤10min。也有人用含1.5m01.L-1甚至2.01m01.L-1山梨醇的培养液洗涤【112】。
此外,光照对恢复生长也有影响。大多实验表明,超低温保存后的材料在恢复生长初期,置于
黑暗或弱光下培养效果较理想㈣。
1.3本研究的内容、目的和意义
蛇莓在我国分布广泛,移栽易成活。但仅靠野生蛇莓和移栽仍不能满足研究需求,并受到
季节和地域等限制。有关蛇莓组织培养的报道极少,且不详实,为蛇莓组织培养体系的建立带
来了一定困难。另外,蛇莓作为重要的乡土植被和中草药,对其种植资源的保存是十分必要的。
本文以蛇莓茎尖为外植体,初步建立起蛇莓组织培养体系;以蛇莓茎尖为材料,初步研究了其
0
蛇莓的组织培养及玻璃化法超低温保存离体茎尖
超低温保存过程。其意义在于,为后人对蛇莓组织培养的进一步研究提供科学依据,为建立蛇
莓种植资源保存提供切实可行的方法参考。
2材料和方法
2.1材料
2.1.1供试材料
供试材料蛇莓取自河南省宝天曼国家级自然保护区。
2.1.2仪器设备及试剂
液氮罐、2ml冷冻管、胶头滴管、100ml三角瓶、烘箱、超净工作台、恒温水浴锅、恒
温控光培养室、组织培养和超低温保存常用器械等。
蔗糖、琼脂、甘油、7,_--醇、二甲基亚砜(DMSO)、液氮、制备MS培养基所需试剂等。
所用试剂的纯度均为分析纯。
2.2方法
2.2.1蛇莓的组织培养
2.2.1.1外植体的处理与消毒
采集健壮的蛇莓匍匐茎;用洗洁精清洗,去除表面污渍;流水冲洗1h;在超净工作台上
用75%酒精消毒30s;再用升汞溶液消毒7mira无菌水冲洗5“次;用无菌滤纸吸干茎段表
面水分;取含有茎尖的部分,并只保留一个;接种到基本MS培养基上,筛选灭菌成功的材料。
2.2.1.2诱导培养
将灭菌成功的外植体分为7组,分别接入含有O.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4.0和5.0mg·L。1
6-BA的,以MS为基本培养基的诱导培养基中。每组3瓶,每瓶为1次重复。每瓶5棵。
30d后统计诱导出的芽总数。期间观察其生长情况,筛选合适的诱导培养基,并在后续的培养
中加以应用。
2.2.1.3增殖培养
10
河南大学2010届硕士研究生学位论文
以MS为基本培养基。在基本培养基中附加2.0rag·L.16-BA及0.01、0.05、0.1和O.5mg·L1
IBA或NAA。将诱导出的丛生芽在超净工作台上分为只带有一个茎尖的试管苗,接入增殖培
养基。每组3瓶,每瓶为1次重复,每瓶5棵。30d后统计增殖培养后的出芽总数,计算繁
殖系数,筛选最佳的增殖培养基。
2.2.1.4生根培养
选取生长健壮且长势基本一致的试管苗进行生根培养。要求苗高2~3cm,每株带有2~3片
叶。生根培养基以MS、1/2MS和I/4MS为基础,并附加O.00、0.05、0.1和0.2mg·L-1IBA。
每组3瓶,每瓶为1次重复。每瓶5棵。30d后观察生根培养效果,统计生根率、平均根长
和平均根数,筛选最佳的生根培养基。
2.2.1.5培养条件
所有培养基附加30g.L。1蔗糖和7.0g.L。1琼脂,pH值为5.8。室内培养温度为(24士1)℃,
光照时间为12h.d.1,光照强度为30urn01.m-2.s-1。
2.2.2蛇莓的超低温保存
2.2.2.1低温锻炼
将继代生长30d的试管苗置于4℃冰箱中低温锻炼0、1、2、3、4、5和6周。观察植株
变化,并记录。
2.2.2.2预培养和预处理
取低温锻炼后的试管苗,在无菌条件下切取1~2mm长的茎尖。置于固体预培养培养基中,
室温培养l、2、3、4、5、6和7d,然后转入无菌冷冻管中。并向管中加入液体预处理培养基,
在20℃下处理10、20、30、40、50和60rain。固体预培养培养基(solidpre—culturemedium,SPCM)
为MS+184.2g.L~'1拙+136.9g-L’1蔗糖+7g·L-1琼脂,pH值为5.8。液体预处理培养基(1iquid
pretreatmentmedium,LPTM)为MS+184.2g'L’1甘油+136.9g.L‘1蔗糖,pH值为5.8。
2.2.2.3玻璃化保护剂处理
用无菌胶头滴管吸出LPTM,加入玻璃化保护剂2(protectionofvitrifiablesolution2,PVS2)。
蛇莓的组织培养及玻璃化法超低温保存离体茎尖
在冰水混合物中处理0、30、50、70、90、110和130rain后,换成新鲜的PVS2。PVS2成分
为MS+300g.L。1甘油+150g'L。1乙二醇+150g.L~DMSO+136.9g·L.1蔗糖,pH值为5.8。
2.2.2.4材料的冷冻、化冻、洗涤与再生
将装有新鲜PVS2和材料的冷冻管装入自制纱布袋中,迅速投入液氮,保存1、12、24、
48、72、96和120h后,将冷冻管从液氮中取出。立即将冷冻管放入40℃水浴锅中,迅速化
冻lrain。除去保护液,20℃下用含410.9g-L以蔗糖的MS洗涤液洗涤3次,每次10min。然
后取出茎尖,用无菌滤纸吸去残留在表面的洗涤液,接种于再生培养基。再生培养基为MS+I.0
mg·L~GA3+1.0mg·L‘16-BA+30g-L"1蔗糖+7g-L"1琼脂,pH值为5.8。暗处理4天,转到正
常条件下。培养温度为(24士1)℃,光照12h.d-1。7d后统计存活率。存活率计算公式如下:
存活率:(玻璃化超低温保存后成活的茎尖数/保存的总茎尖数)x100%
3结果与分析
3.1蛇莓的组织培养
3.1.1不同6.BA浓度对诱导分芽的影响
表1不同6-BA浓度对诱导分芽的影响
Tab.1Effbctofdiffematconcentrationof6-BAonSub.budinduction
注:同列内相同字母表示在O.05水平上差异不显著,不同字母表示存在显著差异。下表同。
Note:Itemsignedbythesameletterarenotsignificantlydifferentat0.05.Differentlettersmeanssignificant
difference.Followingtablesaresame.
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河南大学2010届硕士研究生学位论文
由表1可知,平均分芽数随6-BA浓度的增加呈先增加后减小的趋势。由最初的(11.334-1.54)
个,升高至U(19.87士1.51)个后,又回落为(8.53士2.36)个。使用MS+2.0mg·L16-BA作为诱导
培养基时达到最高。且在显著性水平为0.05时,与其他处理相比存在显著性差异。另外,试
验中观察发现,在植株基部有翠绿色愈伤组织存在(图1),随6-BA浓度的升高愈伤组织逐渐
增大。上述使用的7种诱导培养基,在培养过程中试管苗均无玻璃化现象出现,且生长良好,
均可用于下步试验。
3.1.2不同激素浓度及组合对外植体增殖的影响
表2不同激素浓度及组合对外植体增殖的影晌
Tab.2Effectofdifferentconcentrationandhormoneontheproliferationofexplants
由表2看出,就总体而言,平均分芽数随使用的增殖培养基不同呈现逐渐下降得趋势。
但存在个别上升情况。使用IBA时最高可达(9.47士1.51)个,最低可达(5.40-士0.83)个;使用
NAA时最高可达(6.40-士-0.83)个,最低可达(2.20士0.77)个。在仅考虑激素种类时,IBA对外植
体的增殖效果要明显好于NAA。分别来看,不论是IBA,还是NAA其增值能力都随浓度的
增加而减小。使用0.10mg·L。IBA与使用O.50mg·L.1IBA相比,虽然数值上存在上升情况,
但统计后发现不具有统计学意义,两者不存在显著性差异。另外,试验过程中发现,在使用
IBA时能明显的诱导出大量匍匐茎,而NAA较少。
13
蛇莓的组织培养及玻璃化法超低温保存离体茎尖
3.1.3不同生根培养基对外植体生根的影响
由表3可知,整体而言平均根长和平均根数的变化不存在明显的规律或趋势。在以基础培
养基为依据时,将处理分为3组。在单独考察每组组内时,存在一定的规律。以MS为基本培
养基时,组内4种组合的平均根长,在显著性水平为0.05时,不存在显著性差异;以MS和
MS+0.05mg·L.1IBA为生根培养基与MS+0.10mg·L。1IBA和MS+0.20mg·L_IBA为生根培养
基的两组相比,平均根数存在显著性差异,而两组内各成员间不存在显著性差异。以1/2MS
和1/4MS为基础培养基时,组内四种组合的平均根长和平均根数都不存在显著性差异。
从总体看,相对其它植物而言蛇莓生根较容易,所使用的生根培养基均能使蛇莓生根,且
生根率均可到达100%。从根长来看,MS+0.10mg·L.1IBA生根培养基与1/2MS+0.10mg·L.1
IBA、1/2MS+0.20mg·U1IBA在显著性水平为0.05时存在显著性差异,但与其它生根培养基
相比无显著性差异。从根数来看,MS+0.10mg·L以IBA和MS+0.20mg·L-1IBA生根培养基与
其它生根培养基都存在显著性差,而其两者之间不存在显著性差异。另外,试验观察发现,所
有生根培养基根系诱导出的根系呈放射状,而且根密色白(图2)。
表3不同生根培养基对外植体生根的影响
Tab.3Effectofdifferentrootingmediumonroot
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河南大学2010届硕士研究生学位论文
3.1.4移栽
将已生根的试管苗连瓶置于室温炼苗,3d后打开瓶盖,暴露于空气中;3d后取出试管苗,
小心洗净根上附着的培养基,移栽至装有蛭石:东北营养土=l:l的营养钵中,温度20—24℃,
空气相对湿度50%--60%,每天上午7时,下午l8时对叶片喷水,保持叶片湿度。7d后移栽
至大田。移栽初始适当遮荫、喷水,避免温度过高叶片灼伤,造成移栽植株死亡。一般情况,
移栽存活率可达80%以上(图3)。
3.2蛇莓的超低温保存过程优化
3.2.1低温锻炼对离体茎尖超低温保存存活率的影响
试验选取继代培养30d的蛇莓试管苗。经过超低温保存后发现,低温锻炼能显著影响保存
后茎尖的存活率。由表4可知,未经低温锻炼的茎尖保存后存活率仅为(7.00士2.74)%;锻炼4周
时达到最高,存活率达至U(28.00-士5.70)%。随锻炼时间继续延长,保存后茎尖存活率呈现下降
趋势。当锻炼达到5~6周时,试管苗逐渐变黄脱叶,保存后的存活率显著下降,存活率分别
降至(19.OO士6.52)%和(3.00-士4.47)%。方差分析,低温锻炼4周与锻炼3周相比,在显著性水平为
0.05时,不存在显著性差异。
表4低温锻炼对离体茎尖超低温保存存活率的影响
Tab.4Effectofcrvoacclimation011shoottipsinvitrobycry.opreservation
处理时间倜
Timeoftreatmenffw
存活率/%
SurvivairateJ%
7.0=也.74de
12.0士5.70cd
】8.o士5.70bc
24.O士5.47ab
28.0a:5.70a
l9.0士6.52bc
3.O士4.47e
15
蛇莓的组织培养及玻璃化泫超低温保存离体茎尖
3.2.2预培养对离体茎尖超低温保存存活率的影响
表5预培养对离体茎尖超低温保存存活率的影响
Tab.5Effectofpro-cultureonshoottipsinvitrobyeryopreservation
处理时间/天
Timeoftrestment/d
存活率惕
Survivalrate/%
l3.O士2.74c
22.0-a:5.70b
24.o士4.18b
33.O士5.70a
20.0士3.541)
10.0士3.54c
0.0士0.Od
从低温锻炼4周的蛇莓上切去1~2mm长的茎尖,将其转入SPCM,观察不同处理时间对
保存后茎尖存活率的影响(图4)。发现室温条件下,预培养对提高超低温保存后茎尖的存活率
有显著作用。在预培养过程中发现,随时间的延长保存前茎尖的生活力已经出现变化。预培养
3d时,开始有个别茎尖变成黄绿色;到7d时只有个别茎尖呈黄绿色,大部分变为褐色。结果
表明,茎尖存活率随预培养时间的延长呈现先升高后降低的趋势。处理4d,超低温保存后其
效果最好,存活率达至U(33.00-士5.70)%;5d后呈急剧下降趋势,7d时降为0。经方差分析发现,
处理4d与处理其它时间相比,在显著水平为0.05时,存在显著性差异(表5)。
3.2.3预处理对离体茎尖超低温保存存活率的影响
预处理也称装载,是对材料进行脱水的过程,也可减少渗透压剧烈变化给材料带来的伤害。
将低温锻炼4周,预培养4d的蛇莓用于试验。由表6可知,随处理时间的延长,存活率呈现先
增加后减小的趋势。处理10min时,存活率为(25.00士3.54)%;在处理30min时,成后率最高,
达(38.00-士4.47)%:处理70rain时,又下降为(8.00-士5.70)%。经方差分析,在显著性水平为0.05
时,处理20rain和30rain对保存后存活率的影响不显著
16
河南大学2010届硕士研究生学位论文
表6预培养对离体茎尖超低温保存存活率的影响
Tab.6EffectofpretreatmentOnshoottipsinvitrobyeryopreservation
处理时间/分钟 存活率/%
TimeoftrcatmenVmin SurvivalrateP/6
lO 25.0圭3.54bc
20
30
40
50
60
32.0士2.74ab
38.O-a=4.47a
29.肚6.52bc
22.0士5.70cd
l7.0-a:4.47d
70 8.0士5.70e
3.2.4玻璃化保护液处理对离体茎尖超低温保存存活率的影响
将低温锻炼4周,预培养4d,预处理30min的蛇莓用于试验。由表7可知,随着PVS2处理
时间的延长,保存后茎尖存活率逐渐提高。70min时最高,由最初处理30min的(21.00-士2.24)%
提高到(42.00-士2.74)%。随着处理时间的继续延长,存活率又逐渐下降,150min时存活率下降
至U(17.Oo圭5.70)%。经发差分析,在显著性水平为O.05时,处理50和70min能收到相同的效果。
表7PVS2处理对离体茎尖超低温保存存活率的影响
Tab.7EffectofPVS2onshoottipsinvitrobycryopreservmion
处理时间/分钟