香蕉叶制取叶绿素铜钠盐工艺研究

香蕉叶制取叶绿素铜钠盐工艺研究 林秀兰，郑德勇，高君强 (福建林学院林产工业系，福建　南平　353001) 摘要：试验研究了以香蕉叶为原料制取叶绿素铜钠的工艺步骤，通过正交试验找出较佳工艺条件：用75% 乙醇在60℃萃取，5% NaOH溶液皂化30min，20% CuSO4溶液铜化20min，2%NaOH溶液成盐. 所得香蕉叶叶绿素铜钠产品符合GB3262-82，得率0.65%～0.70%（以鲜蕉叶计）. 关键词：香蕉叶；叶绿素；叶绿素铜钠 　　近20a研究明，合成色素中不少品种具有不同程度的毒性和致癌性，长期食用将严重危及人类的健康，因此对天然食用色素的开发研究成了引人注目的课题，特别是以农林副作物和果蔬类作为原料的天然无害色素. 　　叶绿素铜钠是联合国粮农组织、世界卫生组织（FAO/WHO）和我国食品添加剂标准委员会批准使用的一种天然食用色素，叶绿素铜钠以其固有的鲜亮绿色性，较叶绿素对光、热有较好的稳定性及其特有的杀菌除臭性能而被广泛用于食品、医药卫生和日用化学工业，同时又是一种价值很高（3.2万日元/kg）前景广阔的出口创汇商品之一［1］. 　　在国外，前苏联有用松树嫩枝叶生产叶绿酸钠和脱镁叶绿素；日本、美国有用苜蓿生产叶绿素铜钠的报道［2］.在我国，生产叶绿素铜钠一直以蚕砂为原料，有文献报道过周维纯、马自超、李严巍等分别对松叶、竹叶、苎麻叶色素进行过系列研究［3～5］，利用香蕉叶提制色素的研究未见报道. 为充分利用农副可再生资源,变废为宝，开拓天然色素生产新原料，对香蕉叶制取叶绿素铜钠工艺进行研究. 　　香蕉(Musa paradioiaca Li.var.sapientum O.Kze)属芭蕉科芭蕉属，单子叶高大常绿草本植物，我国粤、桂、闽、台、滇、川等地均有大面积栽培. 据不完全统计，全国种植面积约20万hm2. 香蕉叶大，呈椭圆形.从萌芽起计算总叶数为60～70片，长势旺盛的植株、开花时青叶保存数为10～15片，一般植后10～14个月挂果，收果时还保留5～7片绿叶［6］. 当采果后，剩余的香蕉茎、叶等副产品便弃之不用，其数量可观，体积庞大，由于含水量大，腐烂时间长，既占土地又招虫害，既影响蕉园环境又造成二次污染，若能开发利用，变废为宝，意义深远. 1　材料与方法 1.1　试验材料 　　试验用香蕉叶：取自福建省漳州市天宝五峰林场香蕉园. 除去发黄和霉变的叶子，经洗净、晾干、切碎、杀酶、烘干、粉碎、过筛，取粒径2～5mm，含水率≤16%作为试验材料备用. 试验用试剂：乙醇：食用级；丙酮、乙酸乙酯均为分析纯；HCl,NaOH,CuSO4.5H2O为化学纯. 1.2　叶绿素铜钠提制方法 　　称取一定重量原料在改制的索氏抽提器中用有机溶剂萃取、过滤，滤液用ZFQ85A型旋转蒸发仪真空浓缩、回收有机溶剂，接着加定量碱液使叶绿素皂化，形成水溶性衍生物，并用溶剂萃取、分离不皂化物，在酸性条件下，使皂化物与加入的铜盐螯合成叶绿素铜酸，烘干后再与碱反应成盐，最后经真空干燥即得墨绿色带金属光泽、有特殊胺味的叶绿素铜钠成品. 其工艺步骤如下： 　　　　　　　　 有机溶剂　　　　NaOH　  溶剂　　HCl　 CuSO4　　　　NaOH                                           ↓                        ↓          ↓        ↓            ↓              ↓ 　香蕉叶→预处理 →萃取→ 浓缩 → 皂化 → 分离 →调酸 → 铜化 → 过滤 → 成盐 → 干燥 → 产品 2　结果分析 　 图1　不同溶剂对叶绿素得率的影响 　Figure 1　The effect of the different kind of solvents on the yield of Chlorophyllin 　注：1-乙醇　2-85%乙醇　3-乙醇：丙酮=1∶1　4-乙醇：乙酸乙酯=1∶1　5-丙酮：乙酸乙酯=1∶1　6-丙酮　7-乙醇：丙酮：乙酸乙酯=1∶1∶1　8-HCL∶85%乙醇=1∶4 　 　 图2　不同乙醇浓度对叶绿素得率的影响 　Figure 2　The effect of the different concentration of ethanol on the yield of Chlorophyll 2.1　工艺条件选择 　　根据萃取机理和反应原理分析，影响叶绿素铜钠得率和质量指标的关键是萃取、皂化、铜化和成盐反应. 下面分别对各工序的主要工艺条件进行探讨： 2.1.1　萃取剂的选择　根据原料的特性，选择能溶解叶绿素且在食品添加剂生产中允许使用的溶剂，如乙醇、丙酮、乙酸乙酯及其各种混合比的溶剂，在相同条件下进行萃取比较试验. 萃取液用721分光光度计在535nm波长下进行检测（试验得叶绿素在波长535nm处有最大吸光度）. 不同溶剂对叶绿素得率的影响结果见图1和图2. 从图1可见：任一溶剂的叶绿素萃取均随时间增大而增大，萃取20h后，除4号和8号溶剂的萃取率仍有较大增长趋势外，其余溶剂萃取率趋向稳定；在相同条件下，不同溶剂对叶绿素萃取率不同，1∶4 HCl-乙醇溶剂萃取率最高，溶液呈褐绿色，85%乙醇溶液次之，溶液呈绿色. 由于叶绿素容易与酸反应［7］，稀盐酸能分离出Mg使叶绿素转变为暗褐色的去镁叶绿素a和b，去镁叶绿素易溶于乙醚，氯仿，但难溶于乙醇. 在浓盐酸作用下，除了代换Mg外，可使去镁叶绿素迅速分解出叶绿醇，并形成去镁叶绿酸，使溶液呈褐绿色，化学反应式如下： (C32H30ON4Mg)COOCH3COOC20H39+2HCl=(C32H32ON4)COOCH3COOC20H39   +MgCl2 　　　叶绿素a　　　　　　　　　　　去镁叶绿素a (C32H32ON4)COOCH3COOC20H39+H2O=(C32H32ON4)COOCH3COOH+C20H39OH 　　　　去镁叶绿素a　　　　　　　　去镁叶绿酸a　　　　　叶绿醇 可见HCl-乙醇溶液对叶绿素的萃取虽高于乙醇，但产品纯度和品质下降. 从图2可见，不同浓度乙醇溶液对叶绿素提取率有影响，同等条件下，75%乙醇的萃取率是85%乙醇的2倍多，且溶液色泽碧绿. 综合分析，选择75%乙醇溶液为本试验的萃取剂. 2.1.2　萃取条件的选择　从菲-爱公式［8］ G=-K0(T/η).F.(ΔC/L).t 推理,扩散速率与萃取温度、时间成正比，但对于热敏性的叶绿素而言，过高的温度和过长的时间将影响溶液质量、萃取率和设备的生产率. 为寻找适宜的工艺条件，采用L9（34）正交试验组合表，对萃取时间、萃取温度和料液比的各因次进行正交试验，结果见表1. 从表1可见，极差RA，RB，RC均大于空列，说明A，B，C三因素对质量指标影响是可靠的，影响顺序为RA>RB>RC. 对表1的结果进行方差分析，结果见表2..表2表明，萃取温度、萃取时间是影响叶绿素得率的显著因子，料液比对萃取率有影响，但不显著. 　　综上所述，选择A3B3C1组合即萃取温度为60℃，萃取时间为8h，料液比1∶8为本试验萃取工艺条件.　　　　 2.1.3　皂化、铜化、成盐反应条件选择　采用L9（34）正交试验组合法，对皂化、铜化和成盐等因素的各因次进行优选试验，结果见表3. 　　从表3极差R值分析结果可见CuSO4是影响铜钠盐得率的主要因素，其次是皂化用碱量，再次是成盐用碱量.综合考虑,优选本试验条件下的工艺条件∶以75%乙醇作为溶剂,在温度60℃,时间8h,料液比为1∶8的条件下回流萃取,加5%NaOH溶液皂化,用量按风干蕉叶重∶碱液量=3∶1计,20% CuSO4溶液铜化,用量按风干蕉叶重∶铜盐液量=2∶1,2% NaOH 溶液成盐,用量按干铜酸量∶碱液量=1∶8计. 2.1.4　验证试验　为进一步证实优化组合的可靠性和合理性,对所选择的工艺条件作验证试验.重复3次.叶绿素铜钠得率分别为鲜叶重的0.65%、0.69%、0.70%、平均0.68%得率较高，是由竹叶制取叶绿素铜钠得率0.25%～0.3%的2.47倍，是由苜蓿提制叶绿素铜钠得率0.25%的2.72倍，可见本试验所选择的工艺条件是适宜的. 香蕉叶是提制叶绿素铜钠的又一好原料. 表1 　正交试验结果 Table 1　The results of orthegonal experiment 试 验 号 萃取温 度A/℃ 萃取时 间B/h 料液比 C/g.ml-1 空列 吸光度 A535nm 得率 /% 1 1(40) 1(4) 3(1∶12) 2 0.62 0.789 2 2(50) 1 1(1∶8) 1 1.10 1.305 3 3(60) 1 2(1∶10) 3 1.08 1.303 4 1 2(6) 2 1 0.84 1.028 5 2 2 3 3 0.88 1.094 6 3 2 1 2 1.40 1.637 7 1 3(8) 1 3 1.20 1.415 8 2 3 2 2 1.40 1.665 9 3 3 3 1 1.40 1.684 R 1.383 1.358 0.781 0.288 表2 　表1中叶绿素铜钠得率的方差分析 Table 2　Variance analysis of table 1 at yield of copper chlorophyllin 　 来源 平方 自由度 均方 F值 Fα A 0.323 2 0.162 20.25* F0.05(2.2)= B 0.331 2 0.166 20.75* C 0.101 2 0.051 6.375 误差e 0.016 2 0.008 总和T 0.772 8 　　*显著因子 图3　两种叶绿素铜钠制品光谱特性 Figure 3　Spectra of two kinds of sodium copper chlorophyllin) 　 2.2　产品质量检验 2.2.1　产品光谱特征　配制0.01%叶绿素铜钠溶液，用721分光光度计测定消光值，得图3.从图3曲线看，0.01%香蕉叶叶绿素铜钠（曲线1）在405nm，630nm处有强吸收峰，与国内市售蚕砂叶绿素铜钠（曲线2）的特征吸收光谱吻合，消光比值E405/E630 = 3.6-3.8，说明2种产品组成基本一致，质量接近. 2.2.2　产品质量分析　产品各项指标及分析方法均按国标GB3262-82食品添加剂叶绿素铜钠盐产品要求进行，结果如表4所示. 2.2.3　经济效益估算　采用双重回归估计法［9］测定样地蕉叶生物量，得平均种植香蕉1 950株/hm2，每株（不包括地下球茎及蕉果）平均生物量22.44kg，叶重占生物量的7.52%，则可得绿叶3 385kg/hm2,扣除备料、提制铜钠盐生产过程损失30%，按鲜叶制铜钠盐得率0.68%计，可得产品15.6kg/hm2，按市场价，叶绿素铜钠670元/kg，产值10 870.1元/hm2，扣除成本约7 500元/hm2则每公顷香蕉叶可获利3 000元左右，漳州市香蕉种植面积达1万hm2，若能开发利用，效益相当可观. 表3 　优选试验结果 Table 3　The results of the optimum seeking test 　 试 验 号 因　子 空 列 叶绿素铜 钠量 /g 得率 /% 风干叶重/ 碱量 A/g.ml-1 风干叶重/ 硫酸铜量 B/g.ml-1 干铜碱量/ 碱量 C/g.ml-1 1 1(3∶2) 1(4∶3) 3(1∶9) 2 0.1022 2.04 2 2(2∶1) 1 1(1∶7) 1 0.1087 2.17 3 3(3∶1) 1 2(1∶8) 3 0.1069 2.14 4 1 2(5∶3) 2 1 0.1166 2.33 5 2 2 3 3 0.1103 2.21 6 3 2 1 2 0.1151 2.30 7 1 3(2∶1) 1 3 0.1185 2.37 8 2 3 2 2 0.1396 2.79 9 3 3 3 1 0.1374 2.75 R 0.0221 0.0777 0.0208 3　结语 　  溶剂选择试验表明75%乙醇是本试验条件下比较理想的香蕉叶绿素提取剂. 通过正交试验得香蕉叶制取叶绿素铜钠最适工艺：风干蕉叶与75%乙醇溶液以1∶8配比（W/V）在60℃水浴回流萃取8h，用5%NaOH皂化30min，用量按风干蕉叶量∶碱液量 = 3∶1（W/V）计，加20%的CuSO4溶液铜化20min，用量按风干蕉叶重∶铜盐液 = 2∶1（W/V）计，加20%NaOH成盐，用量按干铜酸重∶碱液 = 1∶8（W/V）计. 　　试验结果还表明，香蕉叶是提制叶绿素铜钠的又一好原料. 以香蕉叶为原料，采用本研究的工艺制取叶绿素铜钠，产品质量好，符合国家食品添加剂GB3262-82标准，得率高0.65%～0.70%（以鲜叶计），经济效益显著，开发利用香蕉叶提制叶绿素铜钠，变废为宝，减少环境污染,具有明显的经济、社会和生态效益. 表4 香蕉叶叶绿素铜钠盐质量指标 　　Table 4　The specification of sodium copper chloropnyllin from banana leaves 　 项目 自制产品 GB3262-82标准 pH 10.15 9.0～10.7 干燥失重 /% 　　3.0 　　 ≤4.0 硫酸盐灰分 /% 28.6 ≤36.0 E1%1cm405 　616 ＞568 总铜量 5.2 4～6 游离铜 /% 0.002 ≤0.025 Pb ppm / ＜5 As ppm / ＜2 消光比值E405/E630 3.8 3.2～4.0 参考文献： ［1］ 张世全. 蚕砂制取叶绿素及综合利用［J］. 林产化工通讯， 1990,(6)：15. ［2］ 周维纯. 苏联树叶化学产品生产研究现状［J］. 苏联科学与技术， 1984,(6)：28-33. ［3］ 周维纯, 王金秋. 松针叶绿素铜钠盐的研制和运用［J］. 林产化学与工业，1986,(2):37-42. ［4］ 马自超, 吴伟志, 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