河豚毒素的研究进展

天然产物化学文献报告—— 河豚毒素的研究进展 概述 “河豚”，学名河鲀，古名肺鱼，俗称气鼓鱼、气泡鱼、吹肚鱼、鸡泡鱼、青郎君等，一 般泛指鲀形目中二齿鲀科、三齿鲀科、四齿鲀科以及箱鲀科所属的鱼类。河豚普遍分布在世 界各地北纬 45 度至南纬 45度之间的海水、淡水等水域。河豚普遍具有膨胀身体的能力，能 够将大量的水或空气吸入极具弹性的胃中，使身体大小膨胀数倍，以吓阻掠食者。大多数四 齿鲀科以及箱鲀科的河鲀，分别具有剧毒河豚毒素及箱豚毒素，依品种分布于内脏、肌肉、 血液、皮肤等等不同部位，毒性并随季节有所变化。河豚肝最毒，但富含ω-3脂肪酸，而且， 味道可口，1975 年，日本传奇歌舞伎演员八代目坂东三津五郎吃了四份河豚肝，七小时后 中毒身亡，日本政府随后便下令禁吃河豚肝。 图 1红鳍多纪鲀 河豚毒素(tetrodotoxin,TTX)是鲀鱼类（俗称河豚鱼）及其它生物体内含有的一种生物碱。 它是一种强力的神经毒素，目前并没有有效的解毒剂，它会和神经细胞的细胞膜上的快速钠 离子通道（Voltage-gated ion channel）结合，令神经中的动作电位受阻截。它的名字来自鲀 形目，因为此目下的鱼类大多带有这种毒素，包括河豚、二齿鲀、翻车鲀及鳞鲀等。虽然河 豚毒素常见于这些鱼类和其他生物体内，事实上，它是由鲀形目鱼类体内的一种学名 Pseudoalteromonas tetraodonis 的细菌所产生，其作用原理在 1960年代早期由杜克大学的楢 桥敏夫博士发现。河豚毒素也存在于各种不同动物中，如加州蝾螈（学名：Taricha torosa） 的卵中（毒素名为"tarichatoxin"，已废用）、鹦哥鱼、斑蟾、蓝圈章鱼（毒素名为 "maculotoxin"）、 海星、神仙鱼、扁形虫、箭虫、纽虫和石蟹等。在 1964 年和 1978年, Tarichatoxin 和 Maculotoxin 分别地被证实就是河豚毒素。 在公元前 2500 年前的中国和埃及，人们就已知道有些鲀形目鱼类有毒，河豚毒素之名， 也因河豚而起。因这些鱼体形似豚，常在河口捕获，故江浙一带俗称其“河豚”。中国是全世 界河豚产量最多的国家，现初步查明的 54种河豚中，中国有 35种，大部分为东方鲀属（Fugu）， 分布在东海、黄海、渤海等水域。年产量约在 3~4 万吨，占世界河豚总产量的 70%左右。 随着几种主要东方鲀品种的人工繁殖与苗种培育的成功，加速推进了中国河豚人工养殖的发 展。此外，河豚毒素纯品的国际市场价每克可达 21万美元，具有极高商业价值。 Abstract From: Wikipedia 分离提纯与结构确定 河豚毒素的发现要追溯到 1909 年，日本科学家 Yoshizumi Tahara 博士发现并命名了河 豚毒素，但其分离结晶工作直到 1950 年才由日本科学家 Yokoo实现，其分离步骤如下图[1]。 图 2 河豚毒素分离结晶方法图解 河豚毒素是一个罕见的几乎每个碳原子都具有手性的小 分子，其结构如右图[2]。 河豚毒素在自然状态下以原甲酸酯 A、原甲酸酐 B 和内 酯 C三种形态的平衡混合物存在，如下图[3]，由于其难以预测 的结构与不同寻常的化学性质，直到在 1964年，Hirata-Goto[4]、 Tsuda [5]、Woodward[2]三人才几乎同时独立推出它的化学结构。 而河豚毒素的绝对构型则是在 1970 年由日本科学家 Furusaki 采用 X-ray晶体衍射方法得以确定。 图 3 河豚毒素分子结构 图 4 河豚毒素分子三种形态的平衡图 Abstract From: [1] A. Yokoo, J. Chem. Soc. Jpn. 1950, 71, 590. [2] R.B. Woodward, Pure. Appl. Chem. 1964, 9, 49. [3] N. Ohyabu, T. Nishikawa, M. Isobe, J.Am.Chem.Soc. 2003, 125, 8798. [4] T. Goto, Y. Kishi, S. Takahashi, Y. Hirata, Tetrahedron. 1965, 21, 2059. [5] K. Tsuda, S.Ikuma, M. Kawamura, et. al, Chem. Pharm. Bull. 1964, 12, 1357. A B C 化学全合成 河豚毒素分子的结构之复杂曾一度被认为是不可能合成的分子，它含有 9个不对称中心， 由氧杂的类金刚烷结构与胍基合并而成，其普遍的逆合成思路如下图。 图 5 河豚毒素的普遍逆合成分析思路图 河豚毒素的化学合成的难点有以下几点。 1、由于 TTX 对碱敏感，如何选择酸性分解的保护基 2、如何构建四取代的 C6和 C8a 3、如何引入 C8a 上的胺基 4、如何避免 C9的差向异构化和 C5的β-羟基消除反应 5、如何引入和确定手性 河豚毒素的第一次外消旋体的全合成在 1972年由日本科学家 Y. Kishi及其合作者共同 完成，其逆合成分析如图所示[1]。 图 6 Y. Kishi 第一次河豚毒素全合成的逆合成分析图 Kishi以对苯二醌取代的乙酮肟为底物，首先一步非对映选择性的 Diels-Alder 成环构建 两个六元环骨架，通过肟的 Beckmann重排引入取代胺基，而后进行双键的环氧化和醚键交 换形成氧杂六元环。随后，通过不对称羟基化引入 C9 的手性烷氧基，同时利用烷氧基难以 差向异构化，避免手性翻转。紧接着，利用 Baeyer-Villager 反应和分子内酯交换反应引入 C10 位内酯基，初步构筑原甲酸酐的骨架。然后，通过分子内亲核加成，构建原甲酸酯结构。 最后，引入胍基，完成全合成，其具体的反应步骤如下六部分图解[2-4]。 第一部分：通过 DA反应和 Beckmann重排实现胺基取代双环己烷的桥环骨架合成 第二部分：C8手性中心的引入和 C11 烯丙位甲基的羟基化 第三部分：C9烷氧基的引入 第四部分：内酯环的手性合成 第五部分：胍基结构的部分构建 第六部分：外消旋体全合成的完成 总结 Kishi 的河豚毒素全合成路线，共计 32 步反应，它的成功之处有三：一是采用了 含有肟结构的独特的亲双烯体；二是通过高效率地底物控制引入多个手性中心；三是发展出 一种新颖的胍基前体的合成方法。 直到三十年之后的 2003 年，河豚毒素的第一次手性全合成才由名古屋大学的 Minoru Isobe教授和斯坦福大学的 J. Du Bios教授几乎同时独立完成，他们的文章发表在同一期美 国化学会志上，两种不同路线的逆合成分析思路请见下两图。 Isobe的逆合成分析如下[5]。 Du Bios 的逆合成分析如下[6]。 Isobe 分九个阶段进行全合成[5]。第一阶段，通过 Sonogashira 偶联反应和 Claisen 重排 反应初步构建含手性中心的环己烷骨架。 第二阶段，引入 C5和 C11 位的羟基基团。 第三阶段，通过炔基水合和分子内羟醛缩合反应构建六元环骨架。 第四阶段，通过底物控制的烯烃氢化反应在 C8位引入手性。 第五阶段，通过 Overman重排反应在 C8a 引入含氮官能团。 第六阶段，通过分子内偶联加成反应引入含氮官能团。 第七阶段，引入含手性中心的内酯结构。 第八阶段，构建胍基前体。 第九阶段，合成胍基，完成全合成。 Du Bios 分五个阶段进行全合成[6]。第一阶段是采用含手性中心的底物，利用钌催化的 C-H 插入反应，引入 C6、C7、C8三个手性中心，同时构建出一个六元环骨架，如下图。 第二阶段，通过底物控制的钌催化氢化反应在 C8a 和 C9位立体选择性地构建两个手性 碳原子，同时在 C5位引入羟基。 第三阶段，实现环己烷骨架和内酯结构的构建。 第四阶段，引入胍基，完成全合成。 Isobe 通过 69 步反应得到立体选择性的产物，反应步骤之多，实为罕见。Isobe 采用了 25 次基团保护控制，但为了实现中间体的 Overman重排，采取了过多的步骤进行底物准备。 相比之下，Du Bios 仅经过 22 步反应就完成了手性全合成，通过 5步官能团保护和 C-H 活 化实现关键位点的官能团化，精确地引入手性中心，大大简化了合成路线，方法之巧妙令人 叹为观止。两种方法各有所长，不管是扎实而坚韧的 Isobe 合成方法，还是巧妙而独到的 Du Bios 合成路线，他们都实现了河豚毒素的第一次手性全合成，分别凸显合成化学家们坚 持不懈而富有创新精神的精神品质。 Abstract From: [1] Y. Kishi, et. al, J. Am Chem. Soc. 1972, 94, 9219. [2] Y. Kishi, et. al, J. Am Chem. Soc. 1972, 94, 9217. [3] Y. Kishi, et. al, Tetrahedron. 1970, 59, 5127. [4] Y. Kishi, et. al, Tetrahedron. 1970, 59, 5129. [5] M. Isobe, T. Ohyabu, T. Nishikawa, J. Am Chem. Soc. 2003, 125, 8798. [6] A. Hinman, J. Du Bios, J. Am Chem. Soc. 2003, 125, 11510. 毒性与生理作用 1982年，美国植物学家韦德-戴维斯发现，海地巫毒教中的回魂大师在药物中使用含有 从河豚组织中提取的毒素粉末，整个过程里中毒者大脑能完全保持清醒，如果能挺过 24h， 他们就会很快恢复正常，且不会出现并发症。这使人们相信他们有使人“死而后生”的能力， 即所谓的“还魂术”。其实，这是由于河豚毒素的特殊结构使其像塞子一样，凝固在神经轴突 的钠离子通道的入口处，阻碍钠离子透过细胞膜传导神经的冲动，从而关闭神经系统。由于 河豚毒素不能越过大脑中血液细胞的屏障，因此，受害者就会处于大脑清醒的无助状态之中。 几小时或几天过后，当河豚毒素最终开放钠离子通道时，大多数受害者已经死亡。[1] TTX 是典型的钠离子通道阻断剂，它能选择性与肌肉、神经细胞的细胞膜表面的钠离 子通道受体结合，阻断电压依赖性钠离子通道，从而阻滞动作电位，抑制神经肌肉间兴奋的 传导，导致与之相关的生理机能的障碍，主要造成肌肉和神经的麻痹。构效关系表明，TTX 的活性基团是 1、2、3 位的胍氨基和附近的 C4、C9、C10 位的羟基，胍基在生理 pH 值下 发生质子化，形成正电活性区域与钠离子通道受体蛋白的负电性羰基相互作用，从而阻碍离 子进入通道。钠离子受体至少有 6 个特异性靶分子结合位点，TTX 是与钠通道受体部位 I 结合。TTX 受体位于可兴奋细胞膜外侧、钠通道外口附近，TTX 与受体部位结合，阻碍钠 离子接近通道外口。研究表明，TTX 特异性作用于钠通道，对钾、钙通道和神经肌肉的突 触及胆碱指酶无直接影响。此外，毒素能通过血脑屏障进入中枢，对中枢产生明显的抑制作 用。总的来说，TTX 对呼吸和心血管的抑制是对中枢和外周的共同作用结果。[1] 河豚毒素的毒理作用的主要表征是阻遏神经和肌肉的传导。除直接作用于胃肠道引起局 部刺激症状外，河豚毒素被机体吸收进入血液后，能迅速使神经末梢和神经中枢发生麻痹， 继而使得各随意肌的运动神经麻痹；毒量增大时会毒及迷走神经，影响呼吸，造成脉搏迟缓； 严重时，体温和血压下降，最后导致血管运动神经和呼吸神经中枢麻痹而迅速死亡。TTX 可选择性地抑制可兴奋膜的电压，阻碍 Na+通道的开放，从而阻止神经冲动的发生和传导， 使神经肌肉丧失兴奋性。[2]此后，多数研究工作都是围绕着 TTX 阻断可兴奋组织的 Na+通道 而展开。 图 7 钠离子通道示意图 河豚对 TTX 具有抵抗力和免疫性。研究发现，3×10-6 M的河豚毒素对 Arothron hispidus 等 7种河豚鱼肌肉的动作电位没有影响，而 3×10-7 M的河豚毒素却阻断了 3种不含河豚毒 素的其他鱼的动作电位。河豚毒素的结合位点位于钠离子通道内高度保守的成孔区域 （P-loop），对河豚毒素敏感的钠离子通道（TTX-sensitive Na+channel）在该区域有与 TTX 高度亲和的芳香性氨基酸。如果该区域出现由芳香性氨基酸向非芳香性氨基酸的氨基酸置换， 就会显著影响它与 TTX 结合的灵敏度，从而使钠离子通道成为抗河豚毒素的钠离子通道 （TTX-resistant Na+channel）。[3]在对河豚毒素没有免疫力的生物体内，钠通道的α-亚基上存 在河豚毒素的受体，河豚毒素与α-亚基门孔附近的氨基酸残基结合，阻止钠离子进入细胞内， 引起河豚毒素中毒。而河豚体内细胞的构造与其他生物不同，河鲀体内还存在可以与河豚毒 素结合的其他蛋白质，从而使河鲀对体内的河豚毒素具有免疫力。比较红鳍东方鲀、黑青斑 东方鲀和斑马鱼的基因序列图谱，发现红鳍东方鲀和黑青斑东方鲀骨骼肌的 Nav1.4 通道发 生了变异，正是这种变异使河鲀具有抵抗河豚毒素的能力。红鳍东方鲀和豹纹东方鲀的变异 类似，都是在 Nav1.4 通道的 401 位点上发生了取代，取代为一个折叠程度更高的不饱和氨 基酸。河豚的这些氨基酸是不与河豚毒素结合的，从而也就不能对河豚的钠离子通道造成影 响。通过克隆调控豹纹东方鲀骨骼肌 Nav1.4 通道表达的 cDNA，发现 Nav1.4 通道区域Ⅰ401 位点处存在一个不饱和氨基酸，即天冬酰胺。通过基因把不饱和氨基酸移植到对河豚毒 素敏感的小鼠骨骼肌 Nav1.4 通道处，移植的不饱和氨基酸的折叠程度越高，小鼠抵抗河豚 毒素的能力越强。当不饱和氨基酸的折叠程度大于取代位点氨基酸折叠程度的 2500 倍时， IC50（50%Na+通道发生阻断时河豚毒素的浓度）提高至 47 μmol/L。[4] 在捕食与防御的长期进化过程中，在北美西部，一些束带蛇对河豚毒素也具备了一定的 耐受力，而且，不同地区的束带蛇对河豚毒素的耐受力也有明显差异。对这些束带蛇的Nav1.4 通道进行分析发现，他们的芳香氨基酸在 401 位点是保守的，但在结构域 IV的成孔区域发 生了几处氨基酸置换。[5]在 WillowCreek 地区的束带蛇的 Nav1.4 通道的结构域 IV 包含有 3 个氨基酸的置换，该地区束带蛇对 TTX 的耐受力比 Benton地区的高两个数量级，因为后者 只包含 1个氨基酸替代。只在河豚鱼与束带蛇中发现它们对河豚毒素的耐受性与其骨骼肌和 神经元的钠离子通道发生了氨基酸替代有关。这两种生物之间的一个主要差别就是，几乎所 有的河豚鱼对 TTX 都有一定的耐受性，而且，有相同耐受机制，但是，只有一部分束带蛇 具有对 TTX 的耐受力。[6] Abstract From: [1] Y. J. Nagashima, K. Yamamoto, K. Shimakura, et. al, Toxicon, 2002, 40, 753. [2] B. Venkatesh, S. Q. Lu, N. Dandona, et. al, Curr. Biol, 2005, 15, 2069. [3] C. K. How, C. H. Chern, Y. C. Huang, et. al, Am. J. Emerg. Med., 2003, 21, 47. [4] S. L. Geffeney, F. Esther, D. B. Edmund, et. al, Nature, 2005, 434, 759. [5] M. B. Tanu, Y. Mahmud, K. Tsuruda, et.al, Toxicon, 2001, 39, 937. [6] O. R. Pires, A. Sebben, E. F. Schwartz, et. al, Toxicon, 2002, 40, 761. 毒素方法 在河豚毒素发现之初，人们就在不断寻找其更好的检测方法。河豚毒素检测常用的方法 有小鼠检测法、酶联免疫法、薄层色谱法、柱后衍生高效液相色谱检测法、气质联用法和液 质联用等。国外较多地采用气质联用、液质联用的方法检测河豚毒素。[1-4] 小鼠生物法（以 30分钟内将一体重 20 克小鼠致死所用河纯毒素的量为一鼠单位）是最 常用、最直观的检测方法，通过小鼠死亡前所呈现出的典型的河豚毒素中毒症状，可迅速地 将河豚毒素与其它致死性物质区分开。最早对河毒素进行定量分析研究是在 1941 年，当时 斯坦福大学在研究蝾螈毒素时引进了鼠单位（Mouse unit，MU）概念。其原理是，一定体 重的小鼠经腹腔注射 TTX 后，其死亡时间的倒数与注射 TTX 剂量之间存在着线性关系，因 此，可根据小鼠死亡时间推断 TTX 的含量。此法测得的毒力用小鼠单位（mouse unit，MU） 表示。黄登福等采用同样的方法，使用 ICR品系小鼠建立了测试TTX毒素的方法，1MU=0.178 μgTTX。但实际使用时，因个体差异大、重现性不好，而且，需有一定规模才能客观反映实 验结果，因此该法的应用受到限制。[5] 免疫酶技术是 20世纪 60年代发展起来的新的免疫测定法，它是抗原抗体的免疫反应与 酶的高效催化作用原理的有机结合。Watabe等首先于 1989年建立了用牛血清白蛋白（BSA） 连接河豚酸（TDA）作为抗原的酶联免疫吸附检测（ELISA）法，检出限为 0.3~1000.0 mg/L。 [6]李世平等应用小鼠生物试验和间接竞争抑制酶联免疫吸附试验（ELISA）同步检测 17 份 河鲀肝组织和 20 份河鲀肌肉组织中的河豚毒素含量，并对 2 种方法的检测结果进行比较。 结果表明，ELISA 法与小鼠生物试验法测得的结果相符合。由于 ELISA 法测定程序简便易 行，速度快，灵敏度高，因而在河豚毒素的定量检测以及预防河鲀中毒方面具有广泛的应用 前景。[7] 高效液相色谱是分析、制备领域应用最为广泛也最为成熟的技术之一，它具有分离效率 高、分辨率好及速度快等特点。张虹等采用醋酸与 TTX 结合形成离子对在 ODS柱上采用紫 外检测器直接测定 TTX 含量，该方法操作简单、快速、准确，最低检测限 50 ng。[8]王小逸 等还利用蒸发光散射检测器进行 TTX 测定，该法可用于微克水平河豚毒素含量的测定。刘 海新等采用柱后衍生高效液相色谱法检测水产品中的河豚毒素含量，样品先由 0.1%乙酸提 取，再经过 C18 固相萃取柱净化。以庚烷磺酸钠为离子对试剂，应用反相离子对液相色谱 分离河豚毒素，采用在线柱后衍生系统，荧光检测器定量检测。河豚毒素在 5-1600 ng的范 围内呈良好的线性相关，相关系数 r = 0.9997，1、2、8 μg/g，3个浓度水平添加样，日内和 日间的回收率为 80.9~91.2%，相对偏差为 1.93% -5.57%，方法定量限为 1 μg/g。高效液 相色谱荧光检测器要比紫外检测器具有更低的检测限，而 TTX 没有荧光吸收，所以必须先 要衍生化成具有荧光吸收的物质，操作比较繁琐。[9] 图 8 河豚毒素及相关衍生物的 HPLC谱图 图 9 河豚毒素及其衍生物的总离子流色谱图 随着质谱技术的发展，质谱所具有的超强定性能力使色谱质谱联用成为分析行业最有效 最准确的分析方法之一。1993 年 SaitoT 利用气-质联用从刀鱼中检测到 TTX 及其同分异构 体的存在。Nagashima 等利用气-质联用从暗纹东方鲀肝脏含有的高分子物质中检测到河豚 毒素的存在。吴平谷等用 2%乙酸/甲醇提取出河豚毒素，用正己烷脱脂，然后用碱将河豚毒 素水解成 2-氨基-8-羟基-6-羟甲基-喹唑啉（C9 碱），水解液经过 C18、SLH 固相萃取柱净化， BSTFA 衍生，采用气相色谱—质谱法全扫描方式测定。液相色谱质谱法比气相色谱质谱法 具有更广的应用范围，不需要衍生化，大大简化了分析手段。[10]Tsai 等采用了液相/质谱联 用法来测定河鲀中的 TTX。[11]李爱峰等应用 C18 反相色谱柱和 HILIC亲水作用色谱柱，建 立了河豚毒素（TTX）的液相色谱—电喷雾离子阱质谱联用分析方法。[12]郑雍怡等建立了 在大鼠腹腔注射给药后，测定其血浆中河豚毒素的高效液相色谱—质谱联用（LC/MS）定量 检测方法。[13]王洪允等建立了 LC-MS-MS 测定血浆中河豚毒素的检测方法，其检测限浓度 为 1ng/mL。[14] 图 10 河豚毒素的质谱图 荧光法是最早建立的定量检测 TTX 的仪器分析方法。1976年，Saito等首先提出了荧光 法，原理是加碱水解后生成 2-氨基 6-羟甲基 8-羟基喹唑啉（简称 C9 碱），该物质发荧光， 建立了最早的荧光分析法；其后，又有研究对荧光检测法进行了改进，建立了连续自动荧光 分析方法。[15]但由于荧光分光光度计在中国应用不如紫外分光光度计普遍，因此根据 TTX 碱水解生成 C9碱的同时定量地生成草酸钠，此结构在紫外区有明显吸收峰的特点，陈玉仁 等建立了紫外分光光度法。该法与荧光法相比，二者最低检出限接近，但后者仪器设备较便 宜。[16] Nagashima等建立了薄层色谱快原子轰击质谱的测定方法。先在 LHP-K板上进行 TLC， 纯化 TTX 及其衍生物，然后用质谱定量，最低检出限为 0.1 g。此法可以区分在其它 TLC 方法中难以区分的 TTX 和脱水 TTX，其优点还在于不需 TMS硅烷化，甚至当被测物的 TLC 行为不清时也可以测定。[17]1988 年，王健伟研究建立了不需水解的薄层色谱（TLC）分析 方法用于 TTX 的定量检测。采用火焰离子检测器，不需将 TTX 降解为 C9碱，避免了衍生 反应过程中可能存在的干扰。[18] Abstract From: [1] 黄海龙，青岛海洋大学学报，2002. [2] 郭柏坤，中国海洋大学学报，2006. [3] S. Watabe, Y. Sato, M. Nakaya, et. al, Toxicon, 1989, 27, 79. [4] 李世平，焦新安，黄金林等，扬州大学学报（农业与生命科学版），2004，25. [5] 张虹，柳正良，黄蓓琳等，中国现代应用药学杂志，2001，18. [6] 刘海新，张农，董黎明等，水产学报，2006，30. [7] 吴平谷，赵永信，沈向红等，中国卫生检验杂志，2009，19. [8] Y. H. Tsai, D. F. Wang, C. Cheng, J. Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 2006, 832. [9] 李爱峰，于仁成，周名江等，分析化学，2007，35. [10] 郑雍怡，王彦，张计，等，药物分析杂志，2008，28. [11] 王洪允，江冀，分析测试学报，2004，23. [12] T. Saito, Fac Mar Sci Tech Nol Tokai Univ TokiakiyoKaiyogakubu，1993, 88. [13] 陈玉仁，程军，海洋药物，1984，10. [14] Y. Nagashima, S. Nishio, T. Noguchi, et. al, AnalBiochem, 1998, 175, 258. [15] 王健伟，国外医学—卫生学分册，1995，22. [16] F. T. Chang,B. J. Benton, J. L. Salyer, et. al, Brain Research, 1990, 528, 259. [17] 翟国锁，临床误诊误诊，2002，15. [18] 符凤英，库宝善，马行等，中国临床康复，2006，10. 医学药理作用 河豚毒素的显著作用之一是产生严重的低血压，5×10-4 μg·g-1 就可产生降压作用。Kao 等的实验证实，在 α和 β肾上腺素受体阻断剂存在时，TTX 具有血管舒张作用。TTX 使血 管逐渐麻痹，外周血管阻力减小，造成血压下降。在培养的牛肾上腺髓质细胞，TTX 尚可 抑制肾上腺细胞释放儿茶酚胺。尽管腹腔注射极微量 TTX（4×10-4 μg·g-1）不影响猴的收缩 压和舒张压，当微量的 TTX 与心得安合用时可短时降低舒张压；与戊脉安合用时能降低收 缩压和舒张压。国产河豚毒素 0.05×10-3---2.0×10-3μg·g-1 给家兔静脉注射、0.5×10-3 ~2.0×10-3 μg·g -1给大鼠静脉注射均能产生降压作用。离体血管及离体心脏实验证明，TTX 无直接扩张 血管作用，但可明显抑制心脏，推测河豚毒素的降压作用与抑制心脏作用有关。[1] 河豚毒素中毒所致昏迷患者中有“假性昏迷”的存在。假性昏迷的原因推测为：运动神经 肌肉接头处被阻滞，出现四肢瘫痪、腱反射消失、压眶反射消失及周围性呼吸肌麻痹；部分 脑干受抑制，而大脑皮质未受到完全抑制，导致四肢瘫痪、血管运动中枢和呼吸中枢麻痹。 确切机制仍需进一步探讨。[2] 由于河毒素独特的作用机制，使人们对其结构产生了浓厚兴趣。因此，通过对毒素分子 母核的研究，有可能人工合成一系列控制神经肌肉细胞膜作用机制的药物。临床上，河毒素 针剂可以代替吗啡、杜冷丁、阿托平和南美筒箭毒等，用于治疗神经痛，镇痛的时间可达 12~20h。河毒素的毒性较大，在使用上受到一定限制，但在临床上可有以下几方面的用途[3-4]： （1）镇痛，含 TTX 的注射剂曾用于治疗神经痛、癌痛、关节痛、肌肉痛、麻疯痛以及 因创伤、挫伤、烧伤引起的疼痛。 （2）局部麻醉，由于河毒素的麻醉作用比一般的局部麻醉药要强上万倍，故国外已有 河毒素与普通麻醉药配伍而作为麻醉药的专利出售。 （3）镇静，可用作瘙痒镇静剂，对于皮肤瘙痒症、疥癣、皮炎等可以止痒，进而促使 其痊愈。也可用作呼吸镇静剂，治疗气喘和百日咳等症。 （4）镇痉，作为解痉剂，用于松弛肌肉痉挛、胃痉挛和其它痉挛，对破伤风痉挛的解 痉效果尤为显著。 （5）降压，河毒素有独特的降血压效果可以考虑在临床上用来抢救高血压患者。 （6）抗心律失常，河毒素有明显的抗心律失常活性，若与其他抗心律失常药物配用， 可显著增强对心律失常的疗效。 （7）其它，作尿意镇静剂，用于遗尿症的治疗，对男性阳痿及妇女性欲缺乏症等也有 一定的疗效。 神经生物学家证实微量毒液就有治疗作用。河豚毒素也可作为局部麻醉药，其局部麻醉 作用比一般麻药强。国外已有将河豚毒素与普通麻药配伍作为局部麻药的专利出售。河豚毒 素对癌痛的镇痛也很有效。研究人员发现癌症病人 24h持续杜冷丁治疗收效甚微，而注射河 豚毒素，每天 2次，连续 3天疼痛便缓解。河豚毒素不仅可以有效缓解晚期癌症引起的剧烈 痛楚，还可治疗顽固性哮喘等。中国研究人员发现，河豚毒素还是一种戒毒良药。研究人员 对吸毒者进行试验，在注射极微量的河豚毒素后，所有各种“戒毒综合症”在 30 min 后全部 消失。连续注射 5 d后可完全戒除毒瘾，且没有副作用。1998 年，加拿大国际韦克斯技术公 司利用河豚毒素成功研制成一种名为 tetrodin的戒毒新药。利用河豚毒素来戒除毒瘾，可谓 “以毒攻毒”的一大创举。[5] 限制河毒素成为药物的最大问题在于有效剂量与有毒剂量十分接近，临床用药方面的应 用应以降低毒性为前提。因此如采用化学合成、修饰技术，对 TTX 进行改构，特异性地增 强镇痛作用而降低毒性，则能推动河豚毒素的商品化进程。[6] 河豚毒素是特异性强的 Na+通道阻断剂。当其位于膜外侧与钠离子通道受体部位Ⅰ结合， 能阻止钠离子进入细胞内，从而阻断电压依赖性钠通道，影响细胞膜动作电位的产生和传导， 阻滞动作电位，抑制与之相关的生理活动。研究表明，河豚毒素对 Na+通道的影响可能是其 镇痛的机制。[7] 中枢性镇痛药吗啡对各种疼痛均有强大的抑制作用，但因对之容易产生耐受性和成瘾性 而不能广泛和连续使用，而河豚毒素对多种钝痛及锐痛均有缓解作用，且不会对之产生依赖 性，可减轻晚期癌症患者的疼痛。单独使用河豚毒素也具有一定镇痛作用，能够抑制甲醛引 起的炎症性疼痛和水肿；河豚毒素与茚虫威联合应用有协同镇痛抗炎作用，在早期两者联合 使用，其镇痛强度与吗啡相差不多，在晚期给药作用极其显著，镇痛强度远远超过吗啡；小 剂量河豚毒素和阿司匹林联合使用能明显提高镇痛疗效。河豚毒素也具有很强的局部麻醉作 用，其效力比常用局麻药强千倍以上，持续时间也明显延长；河豚毒素具有镇痛作用，用醋 酸刺激引起小鼠腹膜炎症而产生疼痛，表现为扭体反应。微量河豚毒素或者微量河豚毒素联 合小剂量的戊巴比妥钠注射到小鼠体内后，小鼠扭体的频率降低。河豚毒素对器官的缺血性 损伤具有保护作用，可明显降低脑梗死的体积及神经功能缺失的症状。河豚毒素对常规心律 失常具有较好的拮抗作用，特别是在抗室颤方面效果显著。但是以上实验均是在小鼠或兔子 身上做的，还没有应用到临床医学上。动物实验发现，河豚毒素对吗啡戒断反应具有明显的 抑制作用，可以用作阿片类毒品的戒毒药物。加拿大科学家已经将其应用于临床，效果比较 显著。另外，河豚毒素在治疗癌症、延缓衰老和提高免疫力等方面也取得了显著的成效。[8-10] 临床上若使用河豚毒素剂量过大，会导致远端神经受损，而神经损害可累及神经根、植 物神经和中枢神经。因此，为了避免河豚毒素在临床应用中产生全身毒性反应，已研制出河 豚毒素微胶囊，将其分散地移植到坐骨神经的细胞膜下，既能起到局部麻醉的作用，又能降 低对神经系统的毒性。河豚毒素微胶囊的研发成功，可以使河豚毒素在临床上得到广泛应用。 河豚毒素与神经变性有关。用河豚毒素处理神经胶质细胞，导致 692 个细胞基因表达发生异 常。因此，河豚毒素作为一种神经毒素，为研究基因的表达规律及神经衰退机制提供了一条 新途径。另外，河豚毒素还可治疗与睡眠相关的疾病。在网状脑桥嘴核和蓝斑下核内微量注 射河豚毒素，它们的活性受到抑制，导致快速眼动睡眠时间和非快速眼动睡眠时间减少，证 明河豚毒素能降低脑桥区的活性，影响生物的睡眠—觉醒状态。[11-12] Abstract From: [1] 徐英，张永鹤，库宝善，中国药理学通报，2003，19. [2] 徐英，库宝善，胡刚等，江苏临床医学杂志，2001，5. [3] M. J. Lee, Cheorlho Kim, Appl. Environ. Microb, 2000, 4. [4] 张凤云，库宝善，姚海燕，中国临床康复，2006，10. [5] 张一，傅军军，施益民等，中华老年医学杂志，2005，10. [6] 李密，刘彦红，蔡志基，北京医科大学学报，1991，23. [7] 陈素青，任雷鸣，黄致强，中国药理学与毒理学杂志，2001，15. [8] C. Sowerbutt, Chron. Canc. Thera, 2003, 5, 102. [9] V. N. Martinov, A. Nja, J. Neurosci. Meth, 2005, 141, 199. [10] 张一，傅军军，施益民等，华老年医学杂志，2005，10. [11] L. D. T. Sanforda, T. L. Yanga, X. Tanga, et. al, Brain Research, 2005, 1044, 42. [12] D. Hwang, T. Noguchi, Adv. Food Nutr. Res, 2007, 52, 141. 总结 在河豚毒素发现至今，已有一百多年的历史，它以其奇妙的化学结构、特异的生理作用 让世界各国科学家为之着迷。1909 年得以发现并命名，1950 年成功实现大量分离提纯，1964 年正式确定化学结构，1972 年第一次实现化学全合成，2003 年第一次实现手性全合成。河 豚毒素无疑是自五十年代天然产物全合成大发展时期以来，人类又一次挑战自然、征服自然 的壮举。河豚毒素由于其独特的生理活性，不仅在在基础科研中可以用作钠离子通道阻断剂， 对于人类理解和认识神经系统有突出作用，并且，在生理学、药理学、医学、医药、疾病治 疗等领域都有特殊功用。相信，在未来的自然科学和生产生活中，对于河豚毒素的研究会进 一步深化，对于它的应用也会进一步拓展。人类在了解自然的基础上，终能改造自然，并尽 可能为之所用，但，我们仍应对自然常怀敬畏之心，正所谓“物极必反”，把握利用的限度， 才能更好地将自然赋予全人类的物质财富传承于我们的下一代。 撰稿人：化学 91 黄泽寰