大鼠侧脑室置管方法的改良

M ar. 2005� � 21 ( 2) � 207~ 211 神 经 解 剖 学 杂 志 ( Chinese Journal of Neuroanatomy) 大鼠侧脑室置管方法的改良① 于海明 � 王百忍* � 李改丽 � 邝 � 芳 � 段小莉 � 鞠 � 躬 (第四军医大学全军神经科学研究所 � 神经免疫调节研究室, 西安 710032) 摘 � 要 � 国际上公认的实验动物脑室内给药方法是先在侧脑室内埋置固定于颅顶的套管, 5 ~ 10 d后待动物从埋管过程造成的 应激反应恢复后再经内管给药,这可以去除插管过程造成的应激对实验结果的干扰。但目前此种方法所用的管道系统多依赖进 口,价格昂贵,且为一次性使用,其代价是很多国内难以承受的。故国内神经生物学实验中动物脑室内给药的方法多为在 颅骨钻孔后以微量注射器或玻璃微电极直接插入脑室内即刻给药,这种方法显然是有缺陷的。为克服这一问,我们研究出了 重复使用进口管道系统的方法,自行了置管时将管道固定在立体定向仪上的装置以取代国外公司昂贵的相关产品并可适用 于国产定向仪。实验结果证实了这种方法是可行的。本文对这一实验方法的改造进行了详细的描述。 关键词 � � 脑 � 侧脑室 � 侧脑室注射� 大鼠 AMODIFIEDMETHOD OF IM PLANTING CANNULAE INTO THE LATERAL VENTRICLE OF THE RAT YuH aim ing, Wang Bairen, Li Gaili, K uang Fang, Duan X iaoli, Ju Gong ( Departm en t ofN euro imm unom odulation, Inst itu te ofNeu roscience, PLA, FourthM ilitary M ed icalUn iversity, X ia'n 710032, C h ina) Abstract� � The most accep table m ethod of in tracerebroven tricu lar ( .i c. v. ) in ject ion in the w orld is perform ed by u sing a cannu la sys- tem that has been im p lan ted stereotaxically in to the lateral ven tricle 5- 10 days b efore the agen t is adm in istered. W ith the procedu re, the in fluen ce of stress caused by imp lant ing surg ical operation on the experim en tal results cou ld be m in im ized. H ow ever, th e cannu la sys tem for th ism ethod is im ported from ab road, d isposab le and too expens ive for most Ch inese labs to afford. Thus, an altern at ive way is appl ied inm ost of th e dom estic researchw orks, inw h ich a need le is inserted directly in to the ven tricle and in ject ion is fol low ed righ t after. To solve th is prob lem, w e developed a w ay to re-u se th is im ported cannula system and d evised inst rum en ts for f ixing th e cannu la on the stereotaxic dev ice m ade in Ch ina asw ell as other stereotaxic dev ice. In ou r study, it has been proved that th ism od ifiedm ethod is feas ible andw e de- scribed the m ethod here in deta i.l Keyw ords� � brain, lateral ven tricle, intracerebroven tricu lar in jection, rat � � 中枢神经给药是神经生物学研究中常用的实验 手段, 多用于观察目的核团或脑区对某些药物刺激 的反应。其优点有二: 一是将药物注入脑内可直接 作用于在体状态下感兴趣区域的神经元及胶质细 胞,比其他途径给药更直接。二是得出结果较体外 实验如细胞培养等更接近正常生理状态下的反应。 国内以微量注射器或玻璃微电极插入颅内后即 刻给药的方法存在的缺陷有: ( 1)麻醉、立体定向仪 上固定时对动物外耳道及鼓膜的损伤、颅骨钻孔以 及注射针侵入脑实质造成的损伤等等使实验动物在 术后几小时甚至几天内仍处于手术应激状态, 从而 干扰甚至掩盖了给药早期应有的对药物的反应。笔 ① 国家自然科学基金 (N o. 39830130, 30270441 )资助项目 � � * � 通讯作者 � 电话: 029-83374489� E-m ai:l w brn im@ fmm u. edu. cn 者在实验中发现,单纯的颅骨钻孔针刺皮层就可使 针刺侧的皮层 c- fos表达较对侧出现明显的广泛升 高,这一升高在 3 h时仍然很明显。 ( 2)针道损伤破 坏了血脑屏障的完整性, 使血细胞及血中的各种免 疫因子进入脑,严重干扰了神经元和胶质细胞周围 的微环境,背离了使结果接近正常生理状态反应的 初衷。 ( 3)不适合于重复给药。 目前国际公认的脑内直接给药方法为: 在立体 定向仪的引导下将一合适直径和长度的带内芯的管 道埋置于需要的位置, 用牙科水门汀和小螺丝将管 道的外露部分固定于颅骨表面。术后 5 ~ 10 d(此 过程中一般要对动物进行驯养 )时认为手术应激已 消失,血脑屏障已修复。此时再在动物清醒状态下 将内芯抽出,将一内针插入管道到达目的部位注射 给药后将内针抽出, 再插入内芯封闭管道以再次给 药。此法基本避免了应激及血液因素的干扰, 从而 得到更可信的结果 [ 1-6]。但这种管道是设计成一次 性使用的,在取材时由于牙科水门汀已经将管道紧 密固定于颅骨上,在取管道时必然很易使脆弱的管 道变弯,无法再次使用。此管道不仅价格高,而且国 外公司销售的相关配套器材如置管时将管道固定于 立体定向仪上的装置、牙科水门汀、小螺丝等都是价 格不斐。此外,将管道固定于立体定向仪上的装置 没有适合国产定向仪的型号。国内有研究者曾尝试 以塑料管等来替代国外的管道系统, 但其硬度不理 想,易感染, 效果也不尽人意。 为了将国外这一技术引进国内, 结合我国国情, 在不影响实验的规范性的前提下, 笔者研究了重复 利用该管道系统的方法, 寻找到了相关配套器材的 替代办法,并设计了将管道固定于立体定向仪上的 装置, 使实验成本大大降低。 材料和方法 1. � 实验器材 1. 1� 套管系统 在 SD大鼠上进行侧脑室置管实验使用的外管 ( gu ide cannu la, 26-gauge)、相配套的内芯 ( dummy cannula)和内针 ( internal cannu la)属于美国 P lastics One公司生产的 Sing le Cannula System ( F ig. 1, 引自 www. plast ics1. com,图中注释为笔者所加 )。并用该 公司配套销售的 PE50管。 管道系统的直径和长度选择: 应根据需注射的 脑区的坐标进行选择。笔者在侧脑室置管实验中使 F ig. 1� C annu la system. For detailed descrip tion, see www. p las- t ics1. com. F ig. 2� Schem atic d raw ing show ing the design of cannu la p rotector and attach ing apparatus for f ixing th e cannu la on the Jiang- w an Type I C stereotaxic device. Th e shape of the instru- m ent f ixed on stereotax ic device can be m ade accord ing to the type of the stereotaxic device. N ylon nut 1 wh ich screw s w ith th e w horls on the pedestal of th e guide cannu la is join ed w ith the in strum ent fixed on s tereotax ic device as show n, and b e screw ed off gen tly w ith instrum ent fixed on stereotaxic device as a w hole after concreting of th e den tal p lastic. The typ e ofNy lon nu t 2 ( cannu la p rotector) is as the sam e asNylon nu t 1, but it w ill not be screw ed off after f irst su rgery un til th e b rain is tak en out. 208 神经解剖学杂志 � � 第 21卷 � � 第 2期 � � 2005年 3月 Fig. 3� Sch em at ic draw ing show ing the sect ion p lane of th e design of cannula protector and attaching apparatus for fix ing the can- nu la on the Narish igi stereotaxic device. The shape of the in strum en t fixed on stereotaxic dev ice can be m ade accord- ing to the type of th e stereotaxic device. The h old ing device of cannu la system is m ade from a m etal tube and a half of the tube is show n in th is f igu re. The tube w ith the inner d-i am eter ( ID) of 6. 3 mm ( th e cap d iam eter of th e dumm y cannula) is cut into two equal parts along its vert ical line. A screw goes though the two h olesw h ich are made on each halfm etal tube and screw s w ith the nut w elded on the tube as show n. A spring w ith its tw o end s resp ectively w eld ed on the tw o halves of th e tub e is perforated by the screw. When the screw is screw ed leftw ard s, the tw o half tubes goes nea- rer each oth er to fasten the cup of the dummy cannu la tigh-t ly. When the screw is screw ed righ twards, the sp ring pu- shes the tw o halves of the tube apart to loosen th e cannu la. 用的外管在底坐下的长度为 3. 2 mm (尖端做成斜 面 )。此长度在 300 g重的 SD大鼠刚好可以垂直到 达侧脑室上方的胼胝体纤维中, 在 200~ 250 g SD 大鼠则刚穿透皮层进入脑室,这样就基本避免了定 位偏差时相对粗大的外管对海马和纹状体的损伤。 内芯和内针 (尖端做成斜面 )的长度为其尖端长出 外管下端 1. 1 mm,这样即使外管定位时发生轻微倾 斜不能到达脑室时,仍能使药物打进侧脑室。 1. 2� 套管的固定 固定用螺丝选用长度为 1~ 2 mm、直径 0. 5 mm 左右的钟表螺丝,购自深圳市龙裕钟表配套经营部 ( www. lyw atch. com )。牙科自凝塑料 (上海医疗器 械股份有限公司生产 )。 502胶 (市购 )。底座保护 套用 6-32型尼龙螺母,购自上海义文机电有限公司 ( www. evan. com. cn)。 F ig. 4� The rest ricting bag for rat. The bag is m ade of b lack soft cloth and its sh ape is designed accord ing to the shape of the rat. A plastic ring is sew ed on the bag en trance in order to let the rat going in to it conven iently. A little hole on the end of th e bag ism ade for the rat b reathing. Th reew ide and soft ropes are used to frap the b ag gen tly from the out s ide ( at the p lace po inted w ith arrow s) wh en the rat is in the right p lace. A s lide fastener is then open ed to expose the cannu- la. Do n ot leave any thrum s in th e inner side of th e bag, oth erw ise th e rat can n ot b e rem oved from the bad easily a-f terw ards. 1. 3� 灭菌棉球 用新洁而灭浸泡消毒过的手术器械; 10%双氧 水; 灭菌蓝墨水。 1. 4� 置管时管道固定于立体定向仪上的装置 设计图纸见 Figs. 2, 3。 Fig. 2所示装置是为固 定装置位于纵向坐标的游标卡尺最下端的立体定向 仪 (如江湾Ⅰ型 C国产立体定向仪 )专门设计。该 装置的优点是:可在将套管最终固定在颅顶之前就 可观察是否有脑脊液的流出, 从而判断埋管的准确 性并及时调整位置。 Fig. 3所示装置是为本所购买 的日本 Narishig i公司的立体定向仪所设计。 1. 5� 大鼠保定袋 设计以及使用见 Fig. 4。 2. � 手术方法 ( 1)雄性 SD大鼠 (体重 300 g左右 ) , 1%戊巴 比妥钠腹腔注射麻醉 ( 60 mg /kg)。 ( 2)将动物固定 于立体定向仪 (日本 Narish ig i公司 )上, 齿杆前上缘 低于耳杆中心 3. 3mm。头顶皮肤剃毛,消毒。 ( 3) 切开颅顶皮肤筋膜,以棉球蘸少量双氧水涂擦颅骨 表面清楚暴露 Bregma点,并用蓝墨水标记。进针点 定位于 Bregma点后 0. 8 mm,矢状缝右侧 1. 5 mm。 ( 4)在拟埋管及固定螺钉处钻孔 (直径 0. 5 mm左 右 ) ,共钻 4孔, 注意将颅骨钻透但不要伤及脑实 质。 ( 5)用消毒棉球和电吹风止血, 干燥术野。选 用长度为 1~ 2mm、直径 0. 5mm左右的钟表螺丝。 209于海明等: 大鼠侧脑室置管方法的改良 Fig. 5� Th e sch emat ic draw ing show ing the overview of location of th e cannu la and screw s on the sku l.l 将螺丝以 502胶垂直埋置于钻好的孔中。 ( 6)管道 用 F ig. 3所示装置垂直固定于立体定向仪的纵向坐 标上, 精确定位于 Bregm a后 0. 8 mm,旁开 1. 5 mm 处。将管道埋入至底座与颅骨紧密相贴 ( F igs. 5, 6)。再次干燥术野。采用牙科自凝塑料作为粘和 剂将螺母,颅骨, 螺丝紧密粘合 ( F ig. 6)。将粉剂和 溶剂按比例混合后凝固时间为 5 ~ 10 m in。应避免 粘和物体表面有水, 否则粘和不牢。 ( 7)待牙科自 凝塑料完全凝固后松开固定管道的装置。将内芯缓 慢旋出, 2~ 3 s后见脑脊液流出, 将内芯归位。缝合 伤口。 ( 8)将大鼠放回笼, 驯养一周。每日训练一 次,使大鼠习惯术者以后对其触摸及进行各种操作。 ( 9)注射,引导大鼠由大鼠保定袋后部的塑料圆圈 钻进, 用棉绳将袋子轻轻收紧, 拉开前方的拉链, 暴 Fig. 6� The schem at ic draw ing show ing the section p lane of th e rela- t ion sh ip am ong guide cannu la, internal cannu la, ny lon nu t, screw s, dental p last ic, sku ll and lateral ven tricle. 露套管。在大鼠清醒安静状态下将内芯旋出, 将以 PE50管连接微量注射器的消毒的内针插入 ( F ig. 4)。以手在袋外轻柔以限制大鼠的活动,同时缓慢 将药物推入,留针。将内针拔出, 内芯归原位。大鼠 回笼。如需重复给药, 此操作可反复进行。 ( 10)在 所需时间处死,取材。取材时应将内芯先取出,将管 道与螺母和牙科自凝塑料和粘在下面的颅骨一并取 下, 然后将底座于颅骨颅腔面旋出。以便重复使用。 讨 � � 论 术后大鼠对植入物耐受好, 行为无异常。术后 7 d仍可见脑脊液流出,经套管注射 Evans蓝可见脑 室及部分蛛网膜下腔被染蓝。取材时未见管道移位 和周围出血的现象。有以下几个问题值得注意。 大鼠头部环绕管道处因不能对合, 会于术后出 现持续渗出, 引起问题有二 ( 1)易感染; ( 2)渗出物 凝固后与管道粘连,在注射药物前将内芯取下时会 引起大鼠疼痛,影响实验结果。 解决方法: 使用耳鼻喉科止血用油纱布或脱脂 棉保护环绕管道之创面,起到止血,缓冲的作用。牙 科自凝塑料对动物是异物,难免有刺激,可于缝皮前 在已经凝固的牙科自凝塑料表面涂一薄层红霉素软 膏起润滑和防感染的作用, 并可用红霉素软膏填充 术野内潜在的腔隙来进一步减少感染的可能。手术 后两天内因为涂抹抗生素软膏故很少出现感染, 但 随后的驯养过程中如果饲养环境温度和卫生不理 想, 管道周围一直不能愈合的皮肤创面会出现感染 征象,故此处创面如若出现渗出增多应及时以碘酒 消毒。如果饲养环境卫生差,可考虑给予抗生素,但 鉴于术后早期血脑屏障严重受损, 不要给予大 量青霉素类抗生素, 以免青霉素可能入脑致痫。给 药前可在管道周围滴少量局部麻醉药以减轻疼痛。 为避免术后大鼠抓挠伤口引起感染, 可将其爪尖剪 掉, 但应注意不可剪过多以免出血和感染。 因管道相对于大鼠的侧脑室仍很粗, 埋管位置 与预定位置若有偏差可能会伤及海马伞或纹状体。 因此立体定向的准确性很重要。以上实验过程的埋 管数据是根据 Pax inos和W atson图谱决定的, 适用 于 300 g左右体重的 SD大鼠。若为其他体重的 SD 大鼠,应于定位时同时暴露 Bregma点和 Lambda点 并调整齿杆高度,使两点处于一条矢状水平线上,然 后根据两点之间的实际距离和图谱上两点之间的标 准距离 ( 9 mm )的比值按比例适当改变埋管前后位 210 神经解剖学杂志 � � 第 21卷 � � 第 2期 � � 2005年 3月 置。埋管旁开的位置为 1. 3~ 1. 5 mm。因颅骨钻孔 时可能会使骨性标志变模糊,影响定位,故建议于钻 孔前用蓝墨水将 B regma点事先标记好。 安装底座保护套时, 内径与底座罗纹相合的尼 龙螺母由外管底座上方旋入并向下旋到不能旋转为 止 (由于底座最底部的螺纹是阻塞的, 当螺母旋至 螺母底部与底座底部平齐时即不能再向下旋转 )。 牙科自凝塑料将螺母表面与颅骨粘和后, 螺母亦不 能向上旋,故可牢固地与底座结合。 大鼠的驯养对于实验的结果是至关重要的。笔 者于实践中证实,通过适当的驯养,大鼠在注射时是 可以配合操作的。驯养前应洗净双手, 避免喷香水 或身上有各种刺激性的味道。驯养过程不应戴手 套,应在固定场所进行,环境要求安静明亮。自术后 第 2 d起到第 7 d, 由先将手接近大鼠,过渡到触摸 其背部皮毛,到将大鼠抓起。应循序渐进,让大鼠有 一适应的过程, 切不可将大鼠激惹。人手在整个过 程的动作应轻柔而不迟疑,切忌迅速的伸出和躲闪。 驯养一日一次,时间不宜过长, 1~ 5 m in即可。 给药时利用鼠类喜好钻洞和黑暗的习性, 可轻 易引导大鼠钻进图示的袋子中。为使大鼠爬到袋子 的最前端可轻拍其臀部。此袋子可明显使大鼠安 静。若对应激要求不高, 甚至可以不经驯养直接使 用此袋打药。 灌注前麻醉非常重要。腹腔注射时的疼痛刺激 会引起应激。应用小号针头垂直于腹壁快速进针。 并于驯养过程中以钝针头戳相应部位腹壁使之适 应。 (收稿 2004- 09- 22 ) 参 � 考 � 文 � 献 [ 1] GonzalezM C, Ab reu P, Barroso-ch inea P et al. E f fect of in tracere- b roventricu lar in ject ion of l ipopolysaccharide on th e tuberoin fund ib- u lar dopam inergic system of the rat. Neu roscience, 2004; 127: 251 - 259 [ 2] Xia Y, K rukoffYL. D ifferen t ial neuronal act ivat ion in th e hypotha- lam ic paraven tricu lar nucleu s and autonom ic/neuroendocrin e re- spon ses to .i c. v. endotoxin. N euroscien ce, 2003; 121: 219- 231 [ 3] Sunter D, H ew son AK, D ickson SL. Intracereb roven tricu lar in jec- tion of apelin-13 redu ces food intake in the rat. N eurosci L ett, 2003; 353: 1 - 4 [ 4] Proeschold tMG, Chakravarty S, Foster JA et al. Intracerebroven- tricu lar bu t not in travenou s interleuk in-1� indu ces w id espread vas- cu lar-m ed iated leukocyte in filterat ion and immune s ignalmRNA ex- oression follow ed by brain-w ide g lial act ivat ion. N euroscien ce, 2002; 112: 731- 749 [ 5] W allen ius K, W allen iu sV, Sunter D et al. Intracereb roventricu lar in terleuk in-6 treatm en t decreases body fat in rats. B ioch em B iophys Res C omm un, 2002; 293: 560- 565 [ 6] H odgson DM, Y irm iya R, Tay lorAN. In tracerebroventricular in ter- leuk in-1� im parirs clearance of tum or cells from th e lungs: role of b rain prostagand ins. JN euro imm uno,l 2001; 119: 57- 63 211于海明等: 大鼠侧脑室置管方法的改良