福尔马林保存的动物标本基因组DNA的提取方法

动物学报 　48 (2) :264～269 , 2002 A cta Zoologica S inica 　　　　　 　 方法和观点 Methods and Viewpoints 福尔马林保存的动物标本基因组 D NA 的提取方法 3 徐来祥①②　张知彬①33 　宋铭晶①　曹小平①　王福生①　张春光③ ( ①中国科学院动物研究所虫鼠害综合治理研究国家重点实验室 , 北京 100080) ( ②曲阜师范大学生物系 , 山东曲阜 273165) ( ③中国科学院动物研究所动物进化与系统学研究中心 , 北京 100080) 摘 　要 　从在福尔马林长期保存的动物物标本中提取基因组 DNA 用于分子生物学研究一直是一个未得到彻底解 决的难题。本文提出了一种从浸泡在福尔马林的大仓鼠肝脏和日本鳗鲡肌肉标本中提取基因组 DNA 的新方法。 取浸泡于福尔马林中的大仓鼠肝脏或日本鳗鲡肌肉适量 , 用 PBS 溶液冲洗 , 放在灭菌的吸水纸上将其揩干 , 于 超净工作台内用无菌剪刀将材料剪成 50 mg 的小块 , 放入 PBS液浸泡 12～24 h ; 然后转入 70 %的乙醇中处理 12 ～24 h。依次换入下列梯度酒精中处理 : 80 %乙醇 , 2 h , 重复一次 ; 90 %乙醇 , 2 h , 重复一次 ; 95 %乙醇 , 2 h , 重复一次 ; 100 %乙醇 , 1 h , 重复一次。然后将材料放入 1/ 2 倍的 PBS 液中浸泡 12 h , 其间更换一次溶液。 提取方法参考 Sambroock 等人 (1989) , 加蛋白酶 K的量按标准量 (100μg/ mL) , 在 50～56 ℃温浴 3～6 h 处理 过程中 , 不断轻摇混匀 , 视消化效果可以重复加入标准量的 1/ 2 倍蛋白酶 K进行消化 , 直至将材料完全消化为 止 ; 酚氯仿抽提最后一次的上清液移入透析袋中透析 ; 沉淀 DNA 时 , 在 - 20 ℃下 20 min 效果为宜。该方法主要 特点在于对标本进行预处理 , 在保证不使 DNA 进一步降解的前提下 , 首先去除标本中所含的福尔马林溶液的成 分 , 然后利用改进的酚氯仿抽提法提取该类标本的基因组 DNA , 再进一步用透析法纯化 DNA。研究结果明 , 采用该方法提取和纯化被试标本基因组 DNA 能较好地应用于 RAPD、微卫星位点的 PCR 扩增、Southern 和斑点 杂交。 关键词 　福尔马林 　动物标本 　基因组 DNA 　大仓鼠 　日本鳗鲡 　 2001210208 收稿 , 2002201220 修回 　3 国家自然科学基金 (No. 39730090 ; 39825105) 、中国科学院重要创新方向 ( KSCX22SW2103 , KSCX221203) 和中国博士后基金资 助项目。33 通讯作者　E2mail : zhangzb @panda. ioz. ac. cn 　第一作者简介　徐来祥 , 男 , 41 岁 , 博士 , 教授。研究方向 : 分子遗传学和分子生态学。 　　核酸的分离与纯化是分子生物学研究中重要的 技术 , 现有的 DNA 提取与纯化方法一般只适用于 新鲜材料 , 虽然对于一些较为特殊材料的 DNA 提 取已提出一些专一方法 , 但是对于福尔马林长期保 存生物标本基因组 DNA 的提取至今未能彻底解 决。作为生物标本的保存液 , 福尔马林的优点在于 渗透力强、防腐杀菌效果好、固定速度快 , 具有能 快速杀死生物细胞以固定生物大分子的功能。因此 在过去的若干年中 , 世界各国生物学家采集了大量 生物标本并保存于福尔马林中 , 这些标本在研究物 种起源、系统进化、特定物种基因资源保护以及生 物多样性等方面具有很高的学术研究价值。如不能 正常提取基因组总 DNA , 就会给从分子水平上比 较研究这类生物带来障碍。 利用经典方法从福尔马林长期保存的动物标本 中提取基因组 DNA 非常困难 (王义权等 , 1999) 。 对福尔马林浸泡人体组织中分离和纯化 DNA 的方 法进行的研究表明 , 所提取的 DNA 分子片段降解 得十分严重 , 仅可用于限制性内切酶的消化和经典 分子杂交 , 而且实验结果较差 ( Goelz et al . , 1985 ; Dubeau et al . , 1986) 。PCR 技术普及应用 以后 , 就不同生物固定剂保存的材料提取的 DNA 的 PCR 研究结果显示 , 保存于福尔马林中的材料 所提取的 DNA 片段大小仅为 1 个 kb 以下 , 难以进 行 扩 增 反 应 ( Dieffenbach et al . , 1986 ; Dieffenbach et al . , 1995 ; Crisan et al . , 1990 ; Ben2Ezra et al . , 1991 ; Greer et al . , 1991) 。近年 来 , 虽然通过各种方法提取的 DNA 已用于扩增基 © 1995-2006 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. duwa Highlight duwa Highlight duwa Highlight 因组中的基因研究 (庞峻峰等 , 2001) , 但由于所 提取片段长度的限制 , 不能保证所扩增基因的完整 性 , 尤其是根本达不到构建物种基因组文库的需 要。因此 , 目前从福尔马林浸泡的动物标本中提取 并纯化 DNA 的方法远远不能满足现代分子生物学 研究的需要。本文提出一种从长期保存于福尔马林 的动物标本中提取基因组 DNA 的方法。 1 　材料与方法 111 　实验材料 供试 材 料 是 保 存 于 福 尔 马 林 中 大 仓 鼠 ( Cricet ul us t riton) 肝脏 , 由中国科学院动物研究 所鼠类生态学实验室提供 , 大仓鼠为 1984～1990 年采集于中国河北省固安县农田 , 阳性对照的新鲜 材料采集 于 同 一 地 区 ; 日 本 鳗 鲡 ( A nguilla japonica) 由中国科学院动物研究所鱼类标本馆提 供 , 整体保存于福尔马林溶液中 , 包括 1932、 1937、1956、1974、1977、1982、1986 和 1990 年 的标本。 112 　标本的预处理 取浸泡于福尔马林中的大仓鼠肝脏或日本鳗鲡 肌肉适量 , 用 PBS 溶液冲洗 , 放在灭菌的吸水纸 上将其揩干 , 于超净工作台内用无菌剪刀将材料剪 成 50 mg 的小块 , 放入 PBS 液浸泡 12～24 h 后转 入 70 %的乙醇中处理 12～24 h。依次换入下列梯 度酒精中处理 : 80 %乙醇 , 2 h , 重复一次 ; 90 % 乙醇 , 2 h , 重复一次 ; 95 %乙醇 , 2 h , 重复一 次 ; 100 %乙醇 , 1 h , 重复一次. 然后将材料放入 1/ 2 倍的 PBS 液中浸泡 12 h , 其间更换一次溶液。 113 　基因组 D NA的提取与纯化 提取方法参考 Sambroock 等人 (1989) , 部分 步骤加以改进。加蛋白酶 K 的量按标准量 (100 μg/ mL) , 在 50～56 ℃温浴 3～6 h 处理过程中 , 不 断轻摇混匀 , 视消化效果可以重复加入标准量的 1/ 2 倍蛋白酶 K进行消化 , 直至将材料完全消化为 止 ; 酚氯仿抽提最后一次的上清液移入透析袋中透 析 ; 沉淀 DNA 时 , 在 - 20 ℃下 20 min 效果为宜。 018 %琼脂糖凝胶电泳检测。 114 　标本 D NA的 PCR扩增 选择通用引物 OPA18 (5′A GGTGACCGT3′) , 使用 PTC2100 PCR 仪 ( MJ RESEARCH) 对大仓 鼠标本的基因组 DNA 进行随机扩增 PCR , 基本程 序按常规方法进行。115 %琼脂糖凝胶电泳检测结 果。 对日本鳗鲡甲醛保存标本的基因组 DNA 进行 微卫星位点的 PCR 扩增 , 选择微卫星引物 Odont07 ( F : GTCTGAAA GCA TCGA GTGAC ; R : TCTTTTTCTACA TCCCAA GC) (Behereregaray et al . , 2000) , 基本程序按常规方法进行 , 115 %琼 脂糖凝胶电泳检测结果。 115 　标本 D NA的分子杂交 大仓鼠标本 DNA 斑点杂交 , 探针 415 S RNA 基因使用 DIG标记 (徐来祥等 , 2000) , 使用多孔 过滤进样器按浓度递减点样 , 起始点样量为 10 ng。 日本鳗鲡标本DNA 的 Southern 杂交 , 用 B am H Ⅰ 消化 , 使用人工合成寡核苷酸 ( CA) 8 作探针 , 探 针标记和分子杂交方法参照蓝翎等 (1993) 。 2 　结　果 211 　标本基因组 D NA的鉴定 图 1 　大仓鼠福尔马林浸泡标本基因组 DNA的鉴定 Fig. 1 　Identif ication of genomic DNA of rat like hamster samples preserved in formalin 1 : (λDNA/ Hi nd Ⅲ + EcoR Ⅰ标准分子量 (λDNA/ Hi nd Ⅲ + EcoR Ⅰmolecular weight marker) 2 : 新鲜材料 DNA (DNA of fresh samples) 　3～8 : 未经处理标 本 DNA (DNA of unpretreated samples) 　9～12 : 预处理标本的 基因组 DNA (DNA of pretreated samples) 提取标本基因组 DNA 之前的预处理 , 目的在 于去除标本组织细胞中的福尔马林的各种成分 , 该 程序是提取标本 DNA 成败的关键。梯度酒精的处 理过程根据需要可以重复 , 直至彻底去除标本所含 甲醛等成分。对 1984 年～1990 年保存的大仓鼠标 本 , 选择 1984、1986、1988 和 1990 年保存完好的 标本 , 即将整个肝脏仍然浸泡在福尔马林中 , 与未 经处理的标本对照 , 提取的基因组 DNA 经 018 % 琼脂糖凝胶电泳检测 , 如图 1 所示 , 经过预处理的 标本所提取的 DNA 量明显多。提取的 DNA 片段 大小 , 经 1 %琼脂糖凝胶支撑的 013 %琼脂糖凝胶 电泳检测 , 证实应有大于 100 kb 以上的分子存在 , 5622 期 徐来祥等 :福尔马林保存的动物标本基因组 DNA 的提取方法 　　 © 1995-2006 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 对照组标本提取的 DNA 电泳时只有痕迹 DNA 的 显示。被试材料与新鲜材料相比 , 所提取的 DNA 量同等情况下要少得多。所提取的 DNA 透析处理 后 , 使透析物 OD270小于 0105 , 紫外分光光度计检 测 OD260/ OD280值在 1175 左右。 图 2 　鳗鲡福尔马林浸泡标本基因组 DNA的鉴定 Fig. 2 　Identif ication of genomic DNA of Japanese eel samples preserved in formalin 1 : (λDNA/ Hi nd Ⅲ + EcoR Ⅰ标准分子量 (λDNA/ Hi nd Ⅲ + EcoR Ⅰmolecular weight marker) 2 : 新鲜材料 DNA ( DNA of fresh samples) 　3 : 1932 年标本 DNA (DNA of samples preserved since 1932) 　4～6 : 1956 年标 本 DNA (DNA of samples preserved since 1956) 　7～8 : 1972 年 标本 DNA (DNA of samples preserved since 1972) 　9～10 : 1982 年标本 DNA (DNA of samples preserved since 1982) 　11～12 : 1990 年标本 DNA (DNA of samples preserved since 1990) 取日本鳗鲡标本的肌肉组织 , 采用同于上述大 仓鼠肝脏标本的处理过程 , 提取的基因组 DNA 分 子大小明显优于大仓鼠标本 , 经 1 %琼脂糖凝胶支 撑的 013 %琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度计 检测均能达到研究的要求 , 而未处理标本根本不能 提取出基因组 DNA。与所提取的大仓鼠标本 DNA 相比降解的程度较轻 , 即电泳的泳道中弥散带较 轻 , 一方面是鳗鲡标本保存于玻璃缸中 , 而且用石 蜡封口 , 密闭较好防止了标本的氧化过程 ; 另一方 面与取材的组织差异有关 , 肌肉组织比肝脏组织含 有较少的降解 DNA 的核酸酶。 212 　标本基因组 D NA的 PCR扩增 大仓鼠被试标本 DNA , 经过随机引物 OPA18 扩增 , 所得产物电泳结果如图 3 所示 。新鲜材料 与 1984、1986 年标本 DNA 扩增的结果虽然具有 共享带但存在明显的差异 , 这种差异既有条带的有 无 , 又有条带的宽窄。 日本鳗鲡基因组微卫星位点 Odont07 的扩增 , 选择 1932、1956、1974 和 1990 的标本基因组 DNA 为 , 结果见图 4 所示。由图可见 , 条带 的大小在 100～2 000 bp 之间 , 不同年限之间存在 差异 , 但大部分条带相统一 , 其中接近 2 kb 的条 　　　　　　　 图 3 　大仓鼠标本 DNA OPA18 RAPD 产物鉴定 Fig. 3 　RAPD pattern of rat like hamster DNA using random primer OPA18 1 : (λDNA/ Hi nd Ⅲ + EcoR Ⅰ标准分子量 ( (DNA/ Hind Ⅲ + EcoR Ⅰmolecular weight marker) 2～3 , 6～7 : 新鲜材料 DNA 扩增产物 (DNA amplification products of fresh samples) 　4～ 5 : 1984 年标本 DNA 扩增产物 ( DNA amplification products of samples preserved since 1984) 　8～9 : 1986 年 标本 DNA 扩增产物 (DNA amplification products of samples preserved since 1986) 　10～11 : 阴性对照 (Negative control) 图 4 　鳗鲡微卫星引物 Odont07 PCR扩增产物鉴定 Fig. 4 　PCR pattern of Anguilla japonica DNA using microsatellite primer Odont07 1 : DL22 000 标准分子量 (DL22 000 molecular weight marker) 　 2 : 1932 年标本 DNA 扩增产物 (DNA amplification products of samples preserved since 1932) 　3～5 : 1956 年标本 DNA 扩增产 物 (DNA amplification products of samples preserved since 1956) 　 6～7 : 1974 年标本 DNA 扩增产物 (DNA amplification products of samples preserved since 1974) 　8～9 : 1990 年标本 DNA 扩增 产物 (DNA amplification products of samples preserved since 1990) 　10～11 : 阴性对照 (Negative control) 662 动 　　物 　　学 　　报 48 卷 　 　　 © 1995-2006 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 带只在 1974 和 1990 年的被试材料中出现。 213 　被试标本 D NA的分子杂交 选择 1986 年大仓鼠标本提取的 DNA , 稀释成 一定浓度 , 按照浓度梯度依次点样进行斑点杂交。 梯度 DNA 量依次为 10 ng、5 ng、3 ng、2 ng、1 ng、015 ng、0125 ng、01125 ng、010625 ng 和 0103125 ng , 点样时使用多孔过滤进样器操作保证 了点样的均一性和可比性 , 每个斑点点 1 μl 的 DNA 溶液 , 结果如图 5 所示。可以看出随着点样 量的增加 , 杂交的斑点依次增大 , 这说明被试材料 被探针杂交是有效的 , 能够证明被试材料是可以用 于杂交检测的。 图 5 　大仓鼠 1986 年标本 DNA的斑点杂交 (以 415 S RNA基因为探针) Fig. 5 　Dot hybridization of DNA samples of rat like hamster samples preserved since 1986 with 415 S RNA gene used as a probe 选择 1932、1956、1974 和 1990 年鳗鲡肌肉所 提取的基因组 DNA , 经限制性内切酶消化后电泳 转膜 , 用于实验的各年限 DNA 量分别是 20 ng、 100 ng、50 ng 和 200 ng , 进行的 Southern 杂交结 果如图 6 所示。图中显示的结果 , 说明杂交有效 , 由于不同年代的被试标本 DNA 点样的量多少不 同 , 杂交带出现差异 , 1990 年的杂交效果最显著。 3 　讨　论 福尔马林中含有的化学成分为 : 甲醛为 36 %、 甲醇 8～12 %和游离酸 0102 % , 另外还有极少量的 氯化物、硫酸盐、重金属和铁。用于长期保存生物 标本的福尔马林溶液含 10 %甲醛 , 所保存的生物 标本的一般形态结构被固定的较好 , 但生物大分子 是否被破坏研究得较少。甲醛在空气中易氧化成甲 酸 , 而甲酸对 DNA 有较强的降解作用 , 通过实验 图 6 　鳗鲡标本 DNA的 Southern 杂交(以( CA) 8为探针) Fig. 6 　Southern blotting of DNA samples of Japanese eel using probe ( CA) 8 1 : 1932 年标本 DNA (DNA of samples preserved since 1932) 　2 : 1956 年标本 DNA (DNA of samples preserved since 1956) 　3～4 : 1974 年标本 DNA (DNA of samples preserved since 1974) 　5～6 : 1990 年标本 DNA (DNA of samples preserved since 1990) 　 研究发现 , DNA 的降解程度与标本的保存质量密 切相关 , 凡是用玻璃瓶装且密封好的标本所提取的 DNA 较为完整 (朱平 , 1992) 。本研究中大仓鼠肝 脏被保存在瓶口没有被密封的小塑料瓶中 , 瓶内福 尔马林液较少 , 而鳗鲡标本尽管保存时间较长 , 但 标本瓶为玻璃瓶 , 又用石蜡密封瓶口 , 实验结果显 示后者基因组 DNA 较为完整。由此可见福尔马林 保存的标本基因组 DNA 的破坏程度与保存时间没 有直接的关系 , 主要与保存液是否被暴露于空气中 发生氧化有关 (Banerjee et al . , 1995) , 这是福尔 马林保存的标本所提取的基因组 DNA 电泳检测的 结果始终为弥散带的主要原因。甲醛溶于水可以生 成水合甲醛 , 因此可以用水冲洗标本 , 以除去标本 中的水合甲醛。但由于此反应是可逆的 , 随着甲醛 的减少 , 部分甲醛始终残留在标本中 , 造成下一步 实验的障碍。因此引入乙醇与标本中的甲醛反应 , 生成半缩醛和缩醛 , 再通过酒精的更换被清除出标 本。本实验利用水与乙醇清除相结合 , 使用酒精浓 度逐渐增高的方法 , 使甲醛以缩醛或水合甲醛的形 式逐渐从组织细胞中析出。预处理时 , 为防止标本 大量吸水造成细胞严重破坏影响进一步实验 , 本研 究使用中性 PBS 液代替水处理标本 , 取得了理想 的实验结果。由于不同时间或不同地点保存的标本 基因组 DNA 被破坏的程度有差异 , 在进行种群分 子生物学研究时 , 应该考虑到被研究材料 DNA 完 整程度的一致性 , 只有这样被研究材料之间才具有 可比性。此外 , 取材的组织一致性也十分重要 , 实 验结果显示肌肉组织比肝脏组织含有较少的降解 7622 期 徐来祥等 :福尔马林保存的动物标本基因组 DNA 的提取方法 　　 © 1995-2006 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. DNA 的核酸酶 , 提取的 DNA 较为完整。 为证实保存于福尔马林中的材料所提取的基因 组 DNA 能够应用于分子生物学研究 , 本研究应用 所提取的 DNA 进行了 PCR 扩增和分子杂交。结果 表明可以进行有效的 PCR 反应、斑点杂交及 Southern杂交 , 其中 Southern 杂交结果显示由于 不同年代的被试标本 DNA 点样的量多少不同 , 杂 交带出现差异 , 1990 年的杂交效果最显著 , 对于 模板 DNA 来说 , 影响 PCR 反应和分子杂交的的主 要原因在于 DNA 的质量。针对福尔马林的成分而 言 , 对 DNA 分子本身就有轻微降解的作用 , 亦可 能发生甲基化等不良作用 , 通过本研究的预处理 , 乙醇与甲醛的结合 , 又通过水的不断析出 , 使得这 一影响大大降低了 , 由大仓鼠 DNA 的 RAPD 和鳗 鲡 DNA 的微卫星位点 PCR 反应以及杂交结果可 见 , 效果与新鲜材料相比没有大的差异。由此可 见 , 通过本研究方法进行福尔马林保存生物标本的 基因组 DNA 提取和应用 , 是能满足该类分子生物 学研究要求的 , 但是福尔马林作为生物标本的保存 液 , 是否为一种最佳保存液还需要商榷。 参 　考 　文 　献 ( References) Ben2Ezra , J . , D. A. Johnson , J . Rossi , N. Cook and A. Wu 　1991 　Effect of fixation on the amplification of nucleic acids from paraffin2embedded material by the polymerase chain reaction. J . Histochem . Cytochem . 39 : 351～354. Banerjee , S. K. , W. F. Makdisi , A. P. Weston , S. M. Mitchell and D. R. Campbell 　1995 　Microwave based DNA extraction from paraffin2 embedded tissue for PCR amplification. 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All rights reserved. 　3 This work was supported by the National Natural Science Foundation of China (No. 39730090 ; 39825105) , Chinese Academy of Science Projects ( KSCX22SW2103 , KSCX221203) , and Chinese Postdoctoral Foundation Project33 Corresponding author 　E2mail : zhangzb @panda. ioz. ac. cn 外　文 　摘 　要 ( Abstract) A METHOD OF EXTRACTING GENOMIC D NA FROM ANIMAL SPECIMEN PRESERVED IN FORMAL IN3 XU Lai2Xiang①②　ZHAN G Zhi2Bin ①33 　SON G Ming2Jing①　CAO Xiao2Ping① WAN G Fu2Sheng①　ZHAN G Chun2Guang③ ( ① N ational Key L aboratory of Integrated pest Management , Instit ute of Zoology , Chi nese Academy of Sciences , Beiji ng 　100080 , Chi na) ( ② Depart ment of Biology , Quf u Normal U niversity , Quf u 　273165 , S handong , Chi na) ( ③ Systematics and Evol ution Research Cent re , Instit ute of Zoology , Chi nese Academy of Sciences , Beiji ng 　100080 , Chi na) The extraction of genomic DNA from long preserved animal specimen fixed with formalin and the application of this kind of DNA in molecular research is an unsettled problem until now. This paper reports a new method to extract genomic DNA from the liver specimen of rat like hamster ( Cricet ul us t riton) and muscle specimen of Japanese eel ( A nguilla japonica) preserved in formalin. First , took some liver tissue of the rat like hamster ( Cricet ul us t riton) and muscle tissue of the eel ( A nguilla japonica) ; second , cleaned them with PBS solution ; and dried them with sterilized water2absorbing paper ; third , cut them into the pieces about 50mg weight ; and put the pieces into PBS solution for 12～24 hours ; fourth , flooded them in two changes of 70 % alcohol for 12～24 hours each , then infuse them into alcohol as the following concentration : in two changes of 80 % alcohol for 2 hours each , two changes of 90 % alcohol for 2 hours each , two changes of 100 % alcohol for 1 hour each , after all of the above treatment , put the samples into 1/ 2 PBS solution for 12 hours , during this t reatment , changed the 1/ 2 PBS solution once. The extraction method was based on that described by Sambrook et al . (1989) with modification. The final concentration of proteinase k was 100μg/ ml. During the 3～6 hr2 incubation in water bath , the temperature was kept at 50 ℃ to 56 ℃, and the reaction tube was taken out and shook slightly again and again. If the specimen tissue was not digested well , more proteinase k must be added to the solution (usually half of the standard quantity) until all the tissue was digested completely. After the last extraction by phenol and chloroform , the supernatant fluid was transferred into dialysis bag. When deposited , the DNA should be deposited at - 20 ℃for 20 minutes. The key to this method was the pretreatment of the specimen. First , remove the formalin from the specimen under the condition that the genomic DNA is not further degraded. Second , extract the genomic DNA from the specimen with the improved phenol and chloroform extraction method. Finally , purify the genomic DNA with dialysis bag. The result showed that the purified DNA could be used in PCR using random primer , the amplification of microsatellite site , southern and dot blotting. Key words 　Formalin , Animal specimen , Genomic DNA , Rat2like hamster , Japanese eel 9622 期 徐来祥等 :福尔马林保存的动物标本基因组 DNA 的提取方法 　　 © 1995-2006 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved.