麻杏石甘汤对A型流感病毒感染小鼠的免疫保护作用

2010年第 38卷第 2期 Vo1．38，No．2，2010 中 医 药 学 报 Aeta Chinese Medicine and Pharmacology ·25· 麻杏石甘汤对 A型流感病毒感染小鼠的 免疫保护作用 李玲 ，卢芳国 ，熊兴耀 ，何迎春 ，朱应武 ，张薇 ，张波 (1．湖南中医药大学，湖南 长沙 410208；2．湖南农业大学，湖南 长沙 410128) 摘 要：目的：通过观察麻杏石甘汤对 A型流感病毒感染小鼠免疫器官重量指数和 IL一2、TNF—B蛋白 表达水平的影响，探讨该方对 A型流感病毒感染小鼠的免疫保护作用。方法：采用鼻腔接种法建立 A 型流感病毒小鼠肺适应株动物感染模型。实验设麻杏石甘汤组、利巴韦林组、抗病毒颗粒组、模型对照 组和正常对照组，经灌胃给药或给生理盐水后，检测小鼠体重、肺指数、脾指数、胸腺指数和肺组织中IL 一 2、TNF—B的蛋白表达水平。结果：麻杏石甘汤明显提高A型流感病毒感染小鼠的体重、脾重指数、 胸腺指数与肺组织中IL一2的蛋白表达水平，降低肺指数和肺组织呻 TNF—B的蛋白表达水平。结论： 麻杏石甘汤通过提高小鼠免疫器官重量指数、调节细胞因子的蛋白表达水平而对流感病毒感染小鼠起 保护作用。 关键词：麻杏石甘汤；A型流感病毒；IL一2；TNF—B 中图分类号：R254；R285；R373．1 3 文献标识码：A 文章编号：1002—2392(2010)02—0025—04 流感病毒(influenza Virus)有 A(甲)、B(乙)、C (丙)三型，A型流感病毒是人、禽 、猪、马等多种动物 流行性感冒(流感)的主要病原体。流感属中医学时 行感冒范畴，主要病因为外感风热毒邪，内袭于肺 ，基 本病机为痰热壅肺、肺气失宣。治疗当紧扣热毒、气 郁、痰浊这三个基本环节。麻杏石甘汤来 自《伤寒 论》，是辛凉解表剂的代表方，也是治疗感冒、支气管 炎、大叶性肺炎等呼吸道感染的良方⋯。前期研究结 果表明：该方体外能通过直接杀伤病毒、干预病毒吸 附、抑制病毒增殖 、保护宿主细胞、抑制宿主细胞凋亡 等而发挥抗流感病毒作用_2 J。为探讨麻杏石甘汤体 内抗流感病毒作用及其机理，我们在前期研究基础上 检测了该方对流感病毒感染小鼠的免疫保护作用，本 文对其结果进行了。 1 与方法 1．1 实验材料 1．1．1 药物 麻杏石甘汤组方及其煎剂的制备方法 收稿目期 ：2009—10—10 修回日期：2009—1l—O2 基金项目：湖南省 自然科学基金重点项 目(项 目批准号：06JJ2055)；湖 南省科技计划项目(2009SK3120) 作者简介：李玲(1983一)，女，硕士研究生，主要从事中医药抗感染性疾 病的免疫学机理研究。 }通讯作者：卢芳国(1961一)，女，教授，硕士生导师，从事中医药抗感 染性疾病的免疫学机理研究，TEL：13647310305；E—mail： lufangguo@ tom．tom。 参考国家中医药管理局统一组织编审的普通高等教育 中医药类规划教材《方剂学》。药材购 自湖南中医药 大学中医专家门诊部，煎剂浓缩至含生药 2g／mL的药 液。利巴韦林片由江西江仁药业有限公司生产，批号： 0601001，规格：每片0．1g。抗病毒颗粒由四川光大制 药有限公司生产，批号：z51020073，规格：每袋 12g。 1．1．2 病毒株 A型流感病毒小鼠肺适应株(A／PR／ 8／34)由湖南师范大学病毒研究室陈则教授惠赠。经 10日龄鸡胚尿囊腔接种培养传代，微量血凝试验滴定 病毒效价 ，血凝效价 1：640以上者可供试验用。正式 试验前测定小鼠病毒半数致死量(LD 。) j，正式试验 用 50个单位的 LD 。(50 LD如)的病毒液。 1．1．3 动物 6—8周 BALB／c小鼠50只，体重(20 ±2)g，雌雄各半，由湖南中医药大学实验动物中心代 购。 1．1．4 实验仪器 超净工作台，微量加样器，麻醉缸， 电子天平，YX型实验动物洁净饲养柜，精密轮转切片 机(RMZ135，德国 LEICA)，电热恒温干燥箱 (上海新 苗医疗器械 DGH一9003型)，光学扫描显微镜 +mot． iccam2306摄像头(ZEISS)，图像分析软件 (Motic Ad． vanced 6．0)。 1．1．5 试剂 免疫组化小鼠 IL一2、TNF一8多克隆 抗体(一抗)、SABC二抗试剂盒，DAB显色试剂盒，苏 木素、多聚赖氨酸(武汉博士德生物有限公司)， PBS缓冲液，蒸馏水，中性树胶。 · 26· 中 医 药 学 报 Acta Chinese Medicine and Pharmacology 2010年第 38卷第 2期 Vo1．38，No．2，2010 1．2 方法 1．2．1 制备模型 实验动物适应性饲养 2—3天后称 重，除正常对照组动物外，其余动物均制备成感染模 型。模型制备方法是：在乙醚轻度麻醉下，每只小鼠鼻 内接种50 LD∞流感病毒液0．05mL J。正常对照组动 物隔离饲养在同等条件下的房间，并按同样方法鼻腔 接种生理盐水 0．05mL。 1．2．2 动物分组 实验设正常对照组、模型对照组、 利巴韦林组、抗病毒颗粒组、麻杏石甘汤组，每组 12只 小鼠。 1．2．3 给药方法 利巴韦林组、抗病毒颗粒组、麻杏 石甘汤组于感染后 24小时开始灌胃给药，每天 1次， 每次 0．4mL，连续给7天。正常对照组和模型对照组 同步灌胃给生理盐水 0．4mL。最后一次给药后禁水、 禁食 8小时，取标本进行指标检测。动物给药剂量按 动物每公斤体重占人体表面积的比值计算 J。 1．2．4 标本采集及检测方法 称动物体重后，处死动 物，摘取胸腺、脾脏、肺脏，称重，计算脾指数、胸腺指 数、肺指数、肺指数下降抑制率、体重下降抑制率l6 J。 收集肺组织置于4％多聚甲醛液中固定，按常规脱水、 石蜡包埋、切片，免疫组织化学染色法检测 IL一2、 TNF一13的蛋白表达水平，用光学扫描显微镜观察与 扫描图片，用图像分析软件(Motic Advanced 6．0)测定 棕黄色颗粒的灰度值和阳性细胞百分率，然后求其均 值。 1．2．5 统计分析 所有实验计量数据均以均数 ±标 准差(元±s)表示，用 SPSS16．0统计软件分析，组间显 著性比较用 t检验，以P<0．05表示差异在统计学上 有显著性意义。 2 结果 2．1 麻杏石甘汤对 A型流感病毒感染小鼠一般状况 的影响 与正常对照组比较，模型对照组小鼠在感染 病毒48h后表现精神沉郁，耸毛，卷缩，毛发无光泽，活 动减少，体重下降，畏寒怕冷，呼吸急促，呈明显的腹式 呼吸等。与模型对照组比较，麻杏石甘汤组小鼠精神 良好，毛发光泽，活动较敏捷，呼吸、饮食正常，体重下 降不明显。 2．2 麻杏石甘汤对 A型流感病毒感染小鼠体重的影 响 由表 1可知：小鼠感染流感病毒后体重明显降低， 与正常对照组比较，差异显著(P<0．O1)。与模型对 照组比较，麻杏石甘汤组 、抗病毒颗粒组、利巴韦林组 小鼠体重明显增加(P<0．O1)，体重下降抑制率分别 为20．97％、21．54％、14．93％。麻杏石甘汤组和抗病 毒颗粒组 的小 鼠体重 明显高于利 巴韦林组 (P< 0．05)，麻杏石甘汤组和抗病毒颗粒组的小鼠体重无 差异显著(P>0．05)。 表 1 麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠体重 的影响(面±8，n：12) 注：与正常对照组 比较，一 P<0．0l；与模型对照组比较， P 0．O1；与利巴韦林组比较 ，。。P<0．Ol，。P<0．05；与抗病毒颗粒组比 较， P>0．05。 2．3 麻杏石甘汤对 A型流感病毒小鼠肺指数的影响 由表 2可知：流感病毒感染小鼠肺指数明显增加，与 正常对照组比较，差异显著(P<0．O1)。与模型对照 组比较，麻杏石甘汤组、抗病毒颗粒组、利巴韦林组肺 指数明显降低(P<0．O1，P<0．05)，肺指数抑制率分 别为 32．83％、38．48％、19．02％。麻杏石甘汤组和抗 病毒颗粒组小鼠肺指数明显低于利巴韦林组 (P< 0．01，P<0．05)，麻杏石甘汤组和抗病毒颗粒组小鼠 肺指数无差异显著(P>0．05)。 表 2 麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠的肺指数 的影响( ±s，n=12) 注：与正常对照组比较，一 P<0．叭；与模型对照组比较， P< 0．01， P<0．05；与利巴韦林组比较，。。P0．05。 2．4 麻杏石甘汤对 A型流感病毒小鼠脾指数、胸腺 指数的影响 由表 3可知：流感病毒感染小鼠的脾指 数、胸腺指数明显下降，与正常对照组比较，差异显著 (P<0．01)。与模型对照组比较，麻杏石甘汤组、抗病 毒颗粒组小鼠脾指数和胸腺指数明显增加，有显著差 异(P<0．05，P<0．01)，利巴韦林组小鼠脾指数和胸 腺指数增加不明显，无显著差异(P>0．05)；麻杏石甘 汤组和抗病毒颗粒组小鼠脾指数和胸腺指数明显高于 利巴韦林组(P<0．01，P<0．05)，麻杏石甘汤组与抗 病毒颗粒组小鼠脾指数和胸腺指数无显著差异(P> 0．05)。 2010年第 38卷第 2期 Vo1．38，No．2，2010 中 医 药 学 报 Acta Chinese Medicine and Pharmacology -27· 表 3 麻杏石甘汤对流感病毒感染小鼠的脾指数、胸腺指数 的影响(x±s，n=12) 注：与正常对照组比较 ，一 P<0．O1， P<0．05， P>0．05；与模型 对照组比较， P<0．O1， P>0．05；与利 巴韦林 组 比较 ，。。P< 0．O1，。P <0 ．05；与抗病毒颗粒组比较， P>0．05。 2．5 麻杏甘石汤对 A型流感病毒小鼠肺组织 IL一2、 TNF—B蛋白表达水平的影响 由表 4可知：流感病 毒感染小鼠肺组织中 IL一2蛋白表达水平降低，TNF — B蛋白表达水平升高，与正常对照组比较，差异显著 (P<0．01)。与模型对照组比较 ，利巴韦林组、抗病毒 颗粒组和麻杏石甘汤组小鼠肺组织中 IL一2蛋白表达 水平升高，TNF—B蛋白表达水平下降，差异显著(P< 0．O1)。与利巴韦林组比较，抗病毒颗粒组和麻杏石 甘汤组小鼠肺组织中 IL一2蛋白表达水平升高，TNF — B蛋白表达水平下降，差异显著(P<0．01)。与抗 病毒颗粒组比较，麻杏石甘汤组小鼠组织中IL一2蛋 白表达水平升高，差异显著(P<0．01)，麻杏石甘汤组 与抗病毒颗粒组 TNF—B蛋白表达水平无显著差异 (P>0．05)。 表4 麻杏甘石汤对流感病毒感染小鼠肺组织中 IL一2、TNF—B蛋白表达水平的影响(面± ，n=12) 注：与正常对照组比较 ，一 PO．05。 3 讨论 流感是常见的呼吸道感染性疾病。流感病毒感染 是否引起疾病取决于病毒与宿主之间的相互作用。流 感病毒侵入机体，在呼吸道上皮细胞中增殖，直接或间 接损伤细胞导致宿主细胞变性、坏死乃至脱落，造成粘 膜充血、水肿和分泌物增加，从而产生鼻塞、流涕、咽喉 疼痛、干咳以及其他上呼吸道感染症状，当病毒蔓延至 下呼吸道，则可能引起支气管炎和问质性肺炎。病毒 增殖产生的毒素样物质可导致高热、头痛、腓肠肌及全 身肌肉疼痛等全身反应。由于流感病毒感染会降低呼 吸道粘膜上皮细胞清除和黏附异物的能力，因此流感 后容易出现细菌等病原微生物的继发性感染。流感后 造成的继发性肺炎是流感的主要死因之一 J。本研 究发现：流感病毒感染小鼠表现精神沉郁，耸毛，卷缩， 毛发无光泽，活动减少，体重下降，畏寒怕冷，呼吸急 促，肺脏水肿、充血、肺指数值明显增加，麻杏石甘汤组 小鼠与模型对照组比较，一般状况得到改善，体重明显 增加(P<0．01)，肺重指数明显下降(P<0．01)，表明 该方在体内有比较明显的抗流感病毒作用。 流感病毒及其多种抗原，如：包膜糖蛋白血凝素 (hemagglutinin，HA)和神经氨 酸酶 (neuraminidase， NA)具有较强的免疫原性，能诱导机体产生特异性体 液免疫和细胞免疫。IL一2、TNF—B等是 活化 的 CD4 T细胞产生的细胞因子。IL一2能促进胸腺细胞、 T细胞和 B细胞的增殖。胸腺细胞和 T细胞经抗原、 有丝分裂原等刺激活化后 ，在有 IL一2存在的条件下 进入 S期，维持细胞的增殖，并产生多种细胞因子如 IFN一 、IL一4、IL一5、IL一6、TNF—p及 CSF等。IL一 2还能诱导 CTL、NK和 LAK等多种杀伤细胞的分化 和效应功能，活化巨噬细胞。目前重组 IL一2已用于 肿瘤与活动性肝炎、单纯疱疹病毒感染、结核杆菌感染 等感染性疾病等临床治疗。TNF—B除具有抗肿瘤作 用外，还有致热作用、促炎症反应等生物活性 J。本 研究发现 ：流感病毒感染小鼠肺组织中IL一2蛋白表 达水平降低，TNF—B蛋白表达水平升高，与正常对照 组比较，差异显著(P<0．01)。麻杏石甘汤组小鼠肺 组织中 IL一2蛋白表达水平明显升高，TNF—B蛋白表 达水平明显下降，与模型对照组比较，差异显著(P< 0．05或 P<0．01)。表明该方具有影响流感病毒感染 小鼠细胞因子蛋白表达水平，调节免疫网络的功能。 - 28· 中 医 药 学 报 Acta Chinese Medicine and Pharmacology 2010年第38卷第2期 Vo1．38，No．2，2010 中医学认为“正气内存，邪不可干”，这里的正气 包括了免疫功能在内的～切抗病能力，邪气则代表一 切可导致人体功能紊乱，内环境失衡的因素。正邪斗 争的消长盛衰决定着疾病的发生、发展及其转归。扶 正与祛邪作为治疗疾病的一个基本原则。胸腺、脾脏 是机体的免疫器官，其功能与机体的免疫应答水平、免 疫调节状况密切相关。本研究发现：流感病毒感染后 的小鼠胸腺重量指数、脾重量指数明显下降，与正常对 照组比较，差异显著(P<0．01)。麻杏石甘汤组小鼠 胸腺重量指数和脾重量指数明显升高，与模型对照组 比较，差异显著(P<0．01)。表明麻杏石甘汤对流感 病毒感染小鼠的免疫器官有保护作用，这也应该是该 方调节免疫应答的基础。 综上所述，麻杏石甘汤不但体内外有直接抗病毒 作用，而且还具有保护免疫器官、调节细胞因子蛋白表 达水平的功能。由于中药复方成分复杂，作用靶点繁 多，细胞因子在体内相互促进又相互制约，形成复杂的 细胞因子调节网络。因此，麻杏石甘汤抗流感病毒深 层次的免疫学机理的研究还有待进一步开展。 参考文献： [1] 段富津．方剂学[M]．上海：上海科技出版社 ，2003：28—32，72— 75． [2] 张薇，卢芳国，何迎春，等．麻杏甘石汤体外抗 A型流感病毒作用 的实验研究[J]．实用预防医学，2007，14(5)：1351—1353． [3] 卢芳国，何迎春，肖子曾，等．麻杏甘石汤体外抗 A型流感病毒的 作用靶点[J]．湖南中医药大学学报，2008，28(2)：5—9． [4] 卢芳国，何迎春，肖子曾．麻杏石甘汤对A型流感病毒感染的狗。爵 传代细胞凋亡的影响[J]．医学研究生学报，2009，2(3)：34—35． [5] 郭元吉，程小雯．流行性感 冒病毒及其实验技术[M]．北京：中国 三峡出版社，1997：111—112． [6] 沈斯瑶，刘军辉，田艳茹，等．双黄连片对小鼠流感病毒和腺病毒 感染的保护作用[J]．中国实用医药，2008，3(15)：50—51， [7] 陈奇．中药药理研究方法学[M]．北京：人民卫生出版社，1997： l103． [8] 金伯泉．医学免疫学[M]．北京：人民卫生出版社，2008：60—66． The Immune Protection of M axingshigan Decoction on M ice W hich W ere Infected by A —．type Influenza Virus LI Ling ，LU Fang—guo ，XIONG Xing—yao ，HE Ying—chun ，ZHU Ying—wu ，ZHANG W ei ，ZHANG Bo (1．Hunan University ofChinese Medicine，Changsha 410208，China； 2．Hunan Agricultural University of Changsha，Changsha 410128，China) Abstract：0bjective：By observing Maxingshigan Decoction(MXSGD)on immune organ weight index of mice which were infected by A—type influenza virus and levels of IL一2、TNF—p，to explore immune protection of mice which were in- fected by A —type influenza virus．Methods：Use nasal inoculation to establish mouse pulmonary infection model animals by A —type influenza virus．Set up MXSGD group，ribavirin group，Anti—virus particle group，model control group and normal control group．After gavaging drug or normal saline，detection of weight in mice，lung index，spleen index，thy— mus index，the level of TNF—B，IL一2 in lung tissue．Result：MXSGD can obviously improve mice which were infec— ted by A—type influenza virus：inhibited the rate of weight loss，spleen weight index，thymus index and the level of IL 一 2 in lung tissue by Immunohistochemical method，and reduce lung weight index and the level of TNF—B in lung tis— sue．Conclusion：MXSGD by enhancing mice’s immune function，regulating a variety of inflammation—associated factor secretion levels to protect mice which were infected by A —type influenza virus． Key words：Maxingshigan Decoction；A—type influenza virus；IL一2；TNF—B ’ 妻 欢迎订阅20 1 0年《中医药学报》 未 欢迎使用E—mail：zyyxbhl@sina．c。m投稿! 蓍 辔 心 哪 ．母 母 哪 一 穗 幢 穗 哪