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不同实验条件对染发剂染色体畸变试验结果的影响

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不同实验条件对染发剂染色体畸变试验结果的影响 环境与健康杂志 2010年 8月第 27卷第 8期 J Environ Health, August 2010, Vol.27, No.8 【论著】 基金项目:中日合作项目(200613) 作者单位:中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所(北京 100021) 作者简介:魏岚(1976-),女,助理研究员,硕士,从事环境毒理学研究。 通讯作者:白雪涛,E-mail:baixt@yahoo.com 文章编号:1001-5914(2010)08-0684-02 不同实验条件对染发剂染色体畸变试验结果的影响 魏岚,...
不同实验条件对染发剂染色体畸变试验结果的影响
环境与健康杂志 2010年 8月第 27卷第 8期 J Environ Health, August 2010, Vol.27, No.8 【论著】 基金项目:中日合作项目(200613) 作者单位:中国疾病预防控制中心环境与健康相关产品安全所(北京 100021) 作者简介:魏岚(1976-),女,助理研究员,硕士,从事环境毒理学研究。 通讯作者:白雪涛,E-mail:baixt@yahoo.com 文章编号:1001-5914(2010)08-0684-02 不同实验条件对染发剂染色体畸变试验结果的影响 魏岚,徐永俊,王翀,李立,张宏伟,白雪涛 摘要:目的 分析中日双方实验室在某些实验条件不同时对染发剂致突变性检测结果的影响。 中日双方实验 室在几种实验条件(细胞株,培养基,Ⅰ、Ⅱ剂混合作用时间,最高染毒浓度设定方法)不同的情况下,利用体外哺乳动物 细胞染色体畸变试验方法对 8种染发剂样品进行致突变性测试,并对其结果进行比对。结果 在 4种实验条件不一致 的情况下,8种染发剂测试样品中,有 2种样品在中日双方实验室测试均呈致突变阳性;其余 6种样品日方实验室测试 结果均为阳性,中方测试结果却均为阴性。在对细胞株和最高浓度设定方法等因素进行控制后,对其中 3种样品进行 重复实验,显示双方实验结论一致。结论 在对 8种染发剂测试样品的共同检测中,中日双方致突变性测试结果的一致 性比较,具有统计学差异(P<0.01)。改变染色体畸变实验中几个不同的实验条件后,可以较好地保证实验室之间结论的 一致性。 关键词:染发剂;染色体畸变试验;实验室比对 中图分类号:R994.6 文献标识码:A Effects of Different Experimental Conditions on Results of Chromosome Aberration Test for Hair Dyes WEI Lan, XU Yong-jun,WANG Chong,et al. Institute for Environmental Hygiene and Health Related Product Safety,Chinese Center for Disease Control and Prevention,Beijing 100021,China Corresponding author: BAI Xue-tao, E-mail:baixt@yahoo.com Abstract:Objective To analyze the results of mutagenicity test for hair dyes from Chinese and Japanese laboratories as the experimental conditions were inconsistent. Methods In different experimental conditions (cell lines , medium,reaction time of aniline and oxidant, the maximum concentration set), the bilateral laboratories employed the methods of mammalian cell chromosome aberration test in vitro to perform the mutagenicity test for eight kinds of hair dye samples and the results comparison was done between the bilateral laboratories. Results In four inconsistent experimental conditions, two of eight samples tested showed consistent mutagenicity positive in bilateral laboratories; as for the other six samples, the test results of Japanese laboratory were positive, but those of Chinese laboratory were negative. As controlling the cell lines and the maximum concentration set and other factors, the repeated experimental test results of three kinds of samples showed the same in bilateral laboratories. Conclusion The test results of mutagenicity of hair dyes from Chinese and Japanese laboratories are inconsistent in some samples for the experimental conditions inconsistent in bilateral laboratories. The consistent experimental conditions will be the precondition for the consistent results of bilateral laboratories. Key words: Hair dyes;Chromosome aberration test;Interlaboratory comparison 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验是一种周期短、敏感性 比较强,能较好反映被检测受试物是否具有致突变可能性的一 种实验方法[1]。本课组的中日双方实验室利用体外哺乳动物细 胞染色体畸变试验方法分别对 8种染发剂样品进行了致突变性 测试。双方在尽量统一实验方法和实验关键因素的前提下合作, 以便能较好地进行实验结果的比对工作,但由于某些客观因素 的存在,致使某些实验条件未能达成一致。笔者主要就实验过程 中不同实验条件对双方实验结果产生的影响以及日方在改进某 些实验条件并与中方试验条件一致后对双方实验结果的影响进 行分析。 1 材料与方法 1.1 样品 日方提供 8种氧化型染发剂产品,分别为 PS-N4,YL-10, BA,PS-N6,MAC,HT-6,DE 4/77和 EX 54。各样品均为 I剂(苯 胺类组分)和 II剂(氧化剂)包装,按使用说明配制比例(1∶1,1∶1, 1∶2,1∶1,3∶5,1∶1,1∶1,2∶3)混合后用于试验。 1.2 细胞株及主要试剂 使用中国仓鼠卵巢细胞株 CHO(中国协和医科大学细胞中心 提供),10%胎牛血清的 DMEM培养液。日方实验室使用中国仓鼠 肺细胞株 CHL,其中 3种样品进行重复实验时日方改选用 CHO, 培养液为 10%胎牛血清的 F12培养液。其余试剂均为分析纯。 1.3 细胞试验 试验设受试物组、阴性对照组和阳性对照组,并在加入和不 加入代谢活化系统的条件下进行。将细胞接种于直径为 6 cm培 养皿中,37 ℃、5% CO2条件培养 24 h,以含受试物的基础培养液 factorbata prior to renal fibrosis: Modification by calcium channel blockade in the salt replete rat 〔J〕. Nephrology, 2004,9:58-64. [12]张晓晖,宋善俊.砷剂介导的细胞凋亡信号转导途径〔J〕.国外医学 分子生物学分册,2001,23(3):181-184. [13]李艳芳,王旭东,梁永钜,等.三氧化二砷通过线粒体依赖性通路诱 导喉癌细胞株及其耐药株细胞凋亡〔J〕.癌症,2004,23(6):631-634. [14]Liu J,Liu Y,Goyer RA,et al. Metallothionein-Ⅰ/Ⅱ null mice are more sensitive than wild type mice to the hepatotoxic and nephrotoxic effects of chronic oral or injected inorganic arsenicals 〔J〕. Toxicological Sciences, 2000,55: 460-467. (收稿日期:2010-07-04 修回日期:2010-07-24) (本文编辑:杜宇欣) 684· · 环境与健康杂志 2010年 8月第 27卷第 8期 J Environ Health, August 2010, Vol.27, No.8 8种染发剂测试样品中,YL-10和 BA在中日双方实验室测试 均呈致突变性阳性;其余 6种样品日方实验室测试结果均为阳性, 中方测试结果均显阴性;中日双方实验室染发剂样品致突变性测 试结果的一致性(表 2)的统计分析显示差异有统计学意义(P<0.01)。 在统一了细胞株、最高浓度设定方法和尽量缩短Ⅰ、Ⅱ剂混 合作用时间 3种实验条件后,日方又对其中 3种样品进行了重 复试验,双方实验结果一致(表 3)。 3 讨论 体外哺乳动物细胞染色体畸变试验是一种操作简便、试验周 期短,能够从中观察到染色体结构异常诸多终点改变的致突变性 试验方法,目前被众多实验室作为化学物遗传毒性的早期筛检试 验[2,3]。本实验操作过程中比较关键的实验条件为:细胞的选择、培 养液的使用、最高浓度的设定、Ⅰ、Ⅱ剂混合作用时间、染毒时培 养皿中细胞终浓度、培养终了 4 h前加秋水仙素、结果判定选用 χ2检验。研究结果显示,中日双方实验室采用了相同的试验方法 及步骤,但试验结果却明显不一致,以下将就双方实验室在操作 过程中几个实验条件不同可能对实验结果的影响进行分析。 双方实验室选择的细胞株不同。虽然二者均为鼠源的成纤 维型细胞,都可用于染色体畸变试验,但细胞株来源部位不同, 对实验染毒的敏感性可能会有所不同。吴红英等[4]在抗放药物的 研究中得出了 CHO比 CHL对射线更敏感,CHO抗辐射性弱的 结论,但从本课题组双方的试验结果来看,CHL细胞的阳性检 出率要高于 CHO细胞。所以细胞株不同是否直接会影响实验结 果,这成为实验中的不确定因素,有待进一步研究。另外,通常情 况下氧化型染发剂Ⅰ剂以苯胺类组分为主,Ⅱ剂以氧化剂为主。 双方实验室约定,在Ⅰ剂、Ⅱ剂混合后立即进行染毒,但由于人 为操作控制的原因混合时间比较难确定,这有可能使功效成分 色原、偶合剂与过氧化氢(H2O2)等氧化剂混合反应生成的中间 产物有所不同,导致染发剂的致突变性不同。 日方采用半数增殖抑制浓度来设定实验最高浓度,而本实 验室采用的指标是可以比较客观地反映细胞增殖旺盛程度、试 验操作简便的有丝分裂指数。结果显示,在不加 S9活化系统的 条件下,本实验室 8种样品的最高浓度通过试验设定在 62.5~ 500 μg/ml之间,均低于日方最高浓度的设定。日方所得的试验结 果阳性率要高于中方。由此可见,最高浓度设定的大小会直接影 响双方试验结论的一致性。培养基可以为体外环境中生存的细胞 供给营养。DMEM和 F12均为合成培养基,加入 10%胎牛血清和 一些补充成分后,均可以较好地为细胞提供生存环境。目前还没 有报道指出不同培养基对 CHO、CHL细胞的培养有何影响。 综上所述,试验细胞株选取不同、试验最高浓度确定方法各 异以及染发剂Ⅰ剂和Ⅱ剂混合作用时间不同可能是导致中日双 方试验结果一致性欠佳的原因。在对 3种样品进行重复试验时, 日方在将细胞株更换为 CHO,使用了有丝分裂指数作为最高浓 度设定,并且尽量控制、缩短Ⅰ剂和Ⅱ剂混合作用时间后, 双方的实验结论一致性比较好。由此可见,在体外哺乳动物细胞 染色体畸变试验中为了保证实验结论的一致性,应该统一实验 的关键因素和控制点,这样才可以更好地保证不同实验室之间 对相同受试物进行安全性评价时结论的准确性。 参考文献: [1]刘清,郭宝岚,李立,等.染发剂的体外染色体畸变实验〔J〕.环境与健 康杂志,2006,23(3): 233-234. [2]秦钰慧.化妆品管理及安全性和功效性评价〔M〕.北京:化学工业出 版社,2006:9. [3]OECD Guidelines for testing of chemicals〔S〕. No.473, 1997. [4]吴红英,刘培勋,岳井银,等.E838对辐射诱导哺乳动物细胞恶性转 化的影响〔J〕.中华放射医学与防护杂志,2001,21(1):21-23. (收稿日期:2010-01-11) (本文编辑:杜宇欣) 表 1 中日双方在染色体畸变试验中不同实验条件比较 检测机构 中方 日方 细胞株 中国仓鼠卵巢细胞株(CHO) 中国仓鼠肺细胞株(CHL) 培养基 10%胎牛血清的 DMEM培养液 10%胎牛血清的 F12培养液 Ⅰ、Ⅱ剂混合作用时间 混合后立即染毒(具体时间不确定) 混合后立即染毒(具体时间不确定) 最高染毒浓度设定方法 有丝分裂指数 半数增殖抑制浓度 继续培养 2 h,代谢活化组同时加入 S9混合物。作用完毕后,以 完全培养液继续培养 24 h后收获细胞。于收获前 4 h用秋水仙 素处理细胞,使细胞停止在中期分裂相。低渗,制片并常规 Giemsa染液染色。镜下观察染色体结构畸变。 1.4 评判方法和数据处理 中日双方的评判结果均遵循在加入和(或)未加入活化系 统(+S9)情况下,受试物组染色体畸变率高于阴性对照组且差 异有统计学意义时。试验结果为阳性,并有可重复性,即可评判 为致突变性阳性。计算染色体畸变率,用 χ2检验分别比较受试 组、阳性对照组与阴性对照组间细胞染色体畸变率的差异,确 定差异是否具有统计学意义;不同实验室间测试结果一致性采 用 SPSS 13.0软件成组的 Fisher精确统计方法进行检验。 2 结果 中日双方除约定的一些实验条件保持一致以外,由于客观 因素的限制,仍有以下 4种实验条件存在不同(表 1)。 注:+为阳性结果,-为阴性结果。 表 2 中日双方实验室 8种染发剂样品致突变性测试 结果的一致性 + - + 2 6 - 0 0 日方 中方 表 3 3种染发剂样品经中日双方统一实验条件 前后致变变性测试结果 PS-N4 YL-10 BA 中方 日方 中方 日方 中方 日方 - + + + + + -S9 - - - + + + +S9 - - + - - - 结论 - - + + + + 调整后 调整前检测机构样品 注:+为阳性结果,-为阴性结果。 685· ·
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