南瓜多糖的提取纯化及其复方口服液的降血糖作用研究

［接受日期］ !""#$%"$!& ! 通讯作者： 吕炜锋，助理研究员； 研究方向： 生物化学及微生物制药； !"#："!&$’(!)%%%’； $%&’(#：*+,- ./01 2301 .4 南瓜多糖的提取纯化及其复方口服液的 降血糖作用研究 吕炜锋%!， 王兆富!， 陈 捷%， 蔡 皓( （%5 中国药科大学生命科学与技术学院，江苏 南京 !%"""6；!5 南京雨花中医院检验科，江苏 南京 !%""%!； (5 南京中医药大学，江苏 南京 !%""!6） ［摘 要］ 目的：提取和纯化南瓜、葛根及黄芪中的降糖有效成份，并考察由南瓜多糖、葛根黄酮及黄芪皂苷组成 的复方口服液的降糖作用。方法：采用水提、醇提及柱层析法，分别提取和纯化南瓜、葛根及黄芪中的降糖有效成 份，并将其配制成 (种不同配比的复方口服液；建立四氧嘧啶高血糖小鼠模型，比较 (种复方口服液的降糖作用。 结果：提取获得南瓜多糖、葛根黄酮和黄芪皂苷，由其配制的 (种复方口服液均能降低四氧嘧啶致高血糖小鼠的血 糖值，并初筛出最佳的复方口服液。结论：本文中南瓜多糖、葛根黄酮及黄芪皂苷的提取和纯化方法简便，得到的 南瓜多糖和葛根总黄酮纯度高，其复方口服液具有明显的降血糖作用。 ［关键词］ 南瓜多糖；葛根黄酮；黄芪皂苷；提取；纯化；复方口服液；降血糖作用 ［中图分类号］ 7!’#1#；7!’&1& ［文献标识码］ 8 ［文章编号］ %""% 9 &"6#（!""#）"% 9 "&%& 9 "# ! "#$%& ’( #)* +,#-./#0’( .(% 1$-020/.#0’( ’2 !"#$%&’ 1’3&4.//).-0%* .(% #)* 5&6’73&/*80/ +22*/# ’2 9#4 :’86’$(% ;-.3 <0=$0% :;< =2>$,24?%!， =8@A BCDE$,0!， FGH@ I>2%， F8J GDE( （%5 !"#$ %&"$’&$ (’) *$&+’",-$ %&+../， 0+"’( 1+(23(&$-4"&(/ 5’"6$27"48， 9(’:"’; !%"""6， 0+"’(； !5 0/"’"&(/ !(<.2(4.28，9(’:"’; =-+-( *2()"4".’(/ 0+"’$7$ >$)"&"’$ ?.7@"4(/，9(’:"’; !%""%!，0+"’(； (5 9(’:"’; 5’"6$27"48 .# *2()"4".’(/ 0+"’$7$ >$)"&"’$，9(’:"’; !%""!6，0+"’(） ［)*+,-’.,］ /*0".,(1"：KE 2LMND.M D43 /0N>,O 1-3@A"’ /E*OPD..CDN>32，1-$2(2"’$ ,*DQE42 D43 B742(;(/-7 PD/E4>4，D43 ME >4Q2PM>?DM2 MC2 CO/E?*O.2R>. 2,,2.MP E, MC2 .ER/E043 END* *>S0>3 .E4P>PM>4? 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E, 1-3@A"’ /E*OPD..CDN>32，1-$2(2"’$ ,*DQE42 D43 B742(;(/-7 PD/E4>4 >P 2,,2.M>Q2 >4 N230.>4? ?*O.2R>D 1 ［:"; <4-5+］ 1-3@A"’ /E*OPD..CDN>32，1-$2(2"’$ ,*DQE42，B742(;(/-7 PD/E4>4，HLMND.M>E4，X0N>,>.DM>E4， FER/E043 END* *>S0>3，GO/E?*O.2R>. 2,,2.M !""#年第 !’卷 第 %%期 第 =>= 页 !"#$"%&& ’( !)*"+*,%-.’,*/ 0,’%(,%& ·实验与研究· ?@@A，1#/ 2?B，3# 2>> =>= 万方数据 南瓜，属葫芦科草本植物。现代药理研究明， 从南瓜中提取的南瓜多糖，可显著降低糖尿病大鼠、 家兔的血糖值［!，"］。葛根为常用中药，具有改善心 脑血管循环、改善心脏功能、降血糖、抗氧化、抗癌等 作用，这与葛根中所含的葛根总黄酮有关［#，$］。本 文对南瓜、葛根及黄芪中的降糖有效成分进行提取 和纯化，并制成复方口服液，观察其用于四氧嘧啶致 高血糖小鼠模型的降血糖作用。 ! 材 料 !%! 动物 昆明小鼠，雌雄各半，体重 !& ’ "" (，中国药科 大学动物中心提供。 !%" 仪器 )*"分光光度计（上海分析仪器厂）；电动搅拌 器（郑州长征仪器厂）；恒温水浴锅（++,$型，常州国 华电器有限公司）；冷冻离心机（-./01）；2-,!高速组 织捣碎机（上海标本模型厂）；干片式血脂血糖仪（南 京丰达医疗器械有限公司）。 !%# 药材和试剂 野葛（ !"#$%$&% ’()%*%，市售，并经鉴定）；南瓜 （!"+,-&.，市售）；黄芪（/0*$%1%’"0，市售，并经鉴定）； 葛根素对照品（中国药品生物制品检定所）。四氧嘧 啶（-3(40公司）；其他试剂均为市售分析纯。 " 方法与结果 "%! 南瓜粗多糖的提取［*］ 取新鲜南瓜，去皮，切片，称重，经 5%"6 70+-8# 漂洗，取出冲洗干净，置匀浆机中打浆，添加 *倍重 量的蒸馏水，于 )* ’ &59水浴搅拌提取 $小时，重复 提取 #次，离心过滤，滤液用 : 4.; < =盐酸调 >+为 #，# 555 1 < 43? 离心 #5 分钟，取上清液，用 * 4.; < = 708+调至中性，加入 5%*6的药用粉末活性炭加热 脱色，脱色液置透析袋中用蒸馏水透析过夜，透析液 经减压浓缩后用无水乙醇沉淀 "次，沉淀经丙酮、乙 醚脱水，真空干燥即得南瓜多糖粗品粉末。 "%" 南瓜多糖降糖组分的分离、纯化 将南瓜多糖粗品饱和溶解至 5%! 4.; < =氯化钠 溶液中，$9放置 "$ 小时，离心，弃去沉淀，滤液中加 入 $56三氯乙酸使其终浓度达到 !56，$ 9冷藏 "$ 小时，离心，沉淀用 5%! 4.; < = 70@; 溶液溶解，经 -A>B01.CA @=,$D柱层析，用 5%! 4.; < =氯化钠溶液洗 脱、分离，采用硫酸E蒽酮法跟踪检测，收集含多糖 的组分，再用 5%! 4.; < = 708+中和，将洗脱液适当 浓缩，透析，用 -A>B0FAG H,"55柱层析分离、纯化，用 5%! 4.; < =氯化钠溶液洗脱（洗脱液流速：5%** 4= < 43?），收集洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥得白色粉末 状南瓜多糖精品，经测定其多糖含量为 &I%I)6。 "%# 南瓜多糖精品的纯度鉴定 "%#%! 柱层析法 将多糖精品溶解在 5%5* 4.; < = 磷酸缓冲液（JD-）中，质量浓度为 5%# ( < F=，经用 5%5* 4.; < = JD-平衡后的 -A>B0FAG K,"55 层析柱洗 脱，体积流量为 $%& 4= < B，每管收集洗脱液 " 4=，硫 酸E苯酚法部分收集检测结果呈较宽峰形的对称 峰，说明多糖组分为非均一多糖（见图 !）。 图 ! 南瓜多糖精品的柱层析洗脱曲线 "%#%" 纸层析法 取新华中速层析纸剪制成 " L4 M "5 L4规格，参照中华人民共和国 "555版药典，薄 层色谱分析上样量分别为 *、!5和 "5!(，上行展开。 展开剂分别为氯仿E甲醇 E*6醋酸（& N " N 5%*）和正 丁醇E丙酮E水（$ N * N !），展距 !: ’ !& L4，温度 !&9， 晾干后以硫酸E苯酚试液喷板，均显示不多于 #个紫 红色的斑点。 "%$ 葛根总黄酮及黄芪皂苷的提取［: ’ &］ 取葛根药材粉末 $%* (，加乙醇 #5 4=，"59浸 渍，每天振摇一次，& 天后，提取滤液供含量测定。 实验重复一次，计算总黄酮得率，取平均值。 取 #份黄芪粗粉 *5 (分别用 I*6、&56和 )56 的乙醇进行 " 次提取。第 ! 次加水量为黄芪的 !5 倍，提取 " ’ #小时；第 "次加水量为黄芪的 &倍，提 取 ! ’ "小时。合并提取液减压回收乙醇至无醇味， 将浓缩物在 :59下干燥得黄芪皂苷粗品。 "%* 葛根总黄酮的含量测定 "%*%" 标准曲线的制备 称取已恒重的葛根素对 照品，用乙醇配成 #!* 4( < =的对照品溶液。精确量 取对照品溶液 !*5、"55、"*5、#55、#*5!;，分别置 !5 4=量瓶中，各加乙醇至 ! 4=，摇匀，加蒸馏水至刻 ·实验与研究· #!$ "%%&，!"# $"’，%" $!! "55$年第 "&卷 第 !!期 第 #!$ 页 &’"(’)** +, &-.’/.0)12+0.# 30+),0)* 万方数据 度，摇匀，用乙醇作空白对照，在 !"# $%处测定吸光 度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，求得回归方 程为 ! & #’#(!)" * #’##")，# & #’+++,。 !’"’! 样品的测定 取葛根提取液 - %.，加乙醇定 容于 -## %.的量瓶中，从中取 #’/ %.于 -# %.容量 瓶内，加乙醇至 - %.，加蒸馏水稀释至刻度，摇匀， 以乙醇作空白溶液，在 !"# $%处测定吸光度，计算 总黄酮含量。 !’, 复方口服液的降糖实验 !’,’- 小鼠血糖测定方法 小鼠禁食 -! 小时后， 内呲取血，使用干片式血脂血糖仪测定动物血糖值。 !’,’! 四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型的建立 小鼠 禁食 -!小时后，静脉注射四氧嘧啶生理盐水溶液 )# %0 1 20，(! 小时后，检测小鼠的血糖值，血糖值低于 --’# %%34 1 .的小鼠为糖尿病模型未成功小鼠［-］，舍 弃，否则为成功。 !’,’5 复方口服液的配制 将“!’-”、“!’/”项下方 法提取的南瓜多糖、葛根总黄酮及黄芪皂苷混合，加 生理盐水，配制成 5种不同含量的复方口服液，其中 各成分的含量及实验给药剂量见表 -。 表 - 5种复方口服液的组成及其实验给药剂量 复方 口服液 序号 葛根总黄酮 含量 （0 1 .） 给药剂量 （%0 1 20） 黄芪皂苷 含量 （0 1 .） 给药剂量 （%0 1 20） 南瓜多糖 含量 （0 1 .） 给药剂量 （%0 1 20） - "’# -## "’# -## !’" "# ! !’" "# !’" "# -’# !# 5 !’" "# "’# "# !’" !# ! 6, 6/ 动物分组 将糖尿病小鼠随机分成 /组，每 组 -# 7 -!只。第 -组为对照组，灌注生理盐水 #’#! %. 1 0，每日两次，连续 -#天；第 ! 7 /组为给药组，分 别灌注 -、! 和 5 号复方口服液 #’#! %. 1 0，每日两 次，连续 -#天。第 --天测定各组小鼠血糖值。 ! 6, 6" 数据统计方法 所有数据以 $ 8 % 表示，组 间比较采用 & 检验。 !’,’, 实验结果 小鼠在注射四氧嘧啶后的第 ! 天，饮水、尿量开始明显增多。给药组小鼠 -- 天后 饮水、尿量趋于正常，精神好转，皮毛光泽好转，血糖 值均出现不同程度的降低，且与对照组比较均有显 著性差异（’ 9 #’#"）；5号口服液组给药前后血糖值 无显著差异（’ : #’#"），-号和 !号口服液组血糖值 与给药前比较有显著差异（’ 9 #’#"），-号口服液的 降糖效果最好；对照组小鼠体力衰竭，皮毛无光，饮 水、尿量仍明显增加，且血糖值没有显著变化（’ : #’#"）（见表 !）。实验表明，本文所述方法提取的南 瓜多糖、葛根总黄酮及黄芪皂苷组成的复方口服液 可降低四氧嘧啶致高血糖小鼠的血糖值，并初筛出 最佳配比的复方口服液。 表 ! 给药前和给药后 --天 /组小鼠的血糖值（ $ 8 %） 组别 鼠数 （(） 平均血糖值（%%34 1 .） 给药前 给药后 降糖率 （;） - -# -/’++ 8 -’5) -"’!! 8 -’-/ * -’"5 ! -# -"’-/ 8 -’/+ -#’,+ 8 /’)/! < !+’5+ 5 -- -"’5+ 8 -’!/ -5’!" 8 5’,)! < -5’+# / -! -/’5/ 8 -’"+ --’(/ 8 (’+" -)’-5 ! ’ 9 #’#"，与对照组比较；< ’ 9 #’#"，与给药前比较 ! 讨 论 本文所采用的提取方法收率高、纯度也较高。 南瓜多糖属酸性杂多糖，根据杂多糖的电离性质，其 先经 =>?@AB3C> D.E/F柱层析，用 #’- %34 1 .氯化钠溶 液洗脱、分离后，再经 =>?@AG>H IE!## 柱层折分离、 纯化。 中医将糖尿病中有三消（多饮多食多尿）症状者 称为消渴。治疗糖尿病，除滋阴清热外，健脾补气也 不可忽视。黄芪甘温，补中益气，升阳而止渴。葛根 解肌退热，生津透疹，升阳止泻，可用于外感发热头 疼、项强、口渴、消渴、麻疹不透等。中药的筛选一般 有两种方法，一为文献分析，二为选择一些简易快速 的动物模型对中药进行筛选。本文通过对一系列文 献的研究探讨，选取了南瓜多糖作为组方原料，配以 中药葛根素和黄芪共同施治，用于治疗消渴之症。 摄入蛋白质和氨基酸可刺激胰岛素分泌，南瓜多糖 可能是以糖蛋白的形式存在，并含有丰富的多种氨 基酸，可刺激胰岛素分泌从而产生降糖效果。 对于复方的设计，要兼顾中西，综合考虑。中医 往往从宏观出发，辨证论治；西医则从微观入手，针 对具体病理，选择针对性药物应用。本文将复方口 服液给四氧嘧啶诱发的高血糖小鼠灌胃，其中葛根 素剂量为 "## %0 1 20 时，降糖作用显著，而为 !"# %0 1 20时，接近最低有效量。这与文献［/］所报道的 基本一致，即小鼠灌胃给予葛根素 !"# 和 5## %0 1 20，降糖率分别为 -);和 5-;［/］。黄芪多糖具有双 向调节血糖的作用，可使葡萄糖负荷后小鼠血糖水 平显著下降，并能明显对抗肾上腺素引起的小鼠血 糖升高反应；对苯双乙胍致小鼠实验性低血糖有明 !##/年第 !)卷 第 --期 第 "#$ 页 !"#$"%&& ’( !)*"+*,%-.’,*/ 0,’%(,%& ·实验与研究· %&&!，1#/ 2%’，3# 2## "#$ 万方数据 显对抗作用，而对胰岛素性低血糖无明显影响［!，"#］。 实验表明，由南瓜多糖、葛根总黄酮及黄芪皂苷 组成的不同配比的 $种复方口服液，对四氧嘧啶诱 发的高血糖小鼠均有降血糖、改善体征的作用。通 过对 $种不同配比的复方口服液降糖作用的比较， 初步筛选得到一个配方合理、降糖作用显著的复方 南瓜多糖降糖口服液。 ［参考文献］ ［"］熊学敏，曹珏 % 南瓜多糖降糖有效部位的提取分离及降 糖作用的研究［&］% 中成药，’###，’’（(）：)*$+)*), ［’］彭红，黄小茉 % 南瓜多糖的提取工艺及其降糖作用的研 究［&］% 食品科学，’##’，’$（(）：’*#+’*$, ［$］宋红晋，黄健 % 葛根的药学研究及其临床应用概况［&］% 上海中医药杂志，"!!!，-：-.+-!, ［-］郭建平，孙其荣，周全 % 葛根药理作用研究进展［&］% 中 草药，"!!*，(（’(）："*$+"*), ［)］孔庆胜，蒋滢 % 南瓜多糖的提取纯化及其分析［&］% 济宁 医学院学报，"!!!，’’（-）：$.+$!, ［*］王昌利，薛红，罗宏锁 % 葛根总黄酮提取工艺研究［&］% 中成药，"!!)，".（*）：*+(, ［.］郭建平，孙其荣，周全，等 % 葛根总黄酮不同提取工艺的 探讨［&］% 中草药，"!!)，’*（"#）：)’’+)’-, ［(］倪艳，苏强 % 黄芪多糖水煎提取工艺的优化试验研究 ［&］% 中国中药杂志，"!!(，’$（)）：’(-+’(*, ［!］马洪喜，李冬梅 % 黄芪皂甙对糖尿病大鼠血清激素水平 的影响［&］% 微量元素与健康研究，’##$,’#（-）：)+*, ［"#］党海霞 % 黄芪治疗糖尿病的药理研究近况［&］% 中医药 学报，’##’，$#（$）：*!+.", ［接受日期］ ’##-+#*+"$ ! 通讯作者： 孙桂珍，副主任药师，从事新药研发工作； !"#：#*$$+(’$$()*； $%&’(#：/0123456057 6830% 98: 交流沙龙 ;<+=<>?法检测甲磺酸帕珠沙星注射剂中右旋体含量 孙桂珍! （山东长富洁晶药业有限公司，山东 日照 ’.*(##） ［摘 要］ 目的：建立 ;<+=<>?法检测甲磺酸帕珠沙星注射剂中右旋体含量。方法：采用岛津 ?"(柱（-,* :: @ ’)# ::，)!:），流动相为甲醇+手性溶液（$#A.#），流速为 ",# :> B :15，紫外检测波长为 $’# 5:。结果：甲磺酸帕珠沙星 右旋体的保留时间为 *,( :15，其浓度在 "’,)’ C $.,)-!/ B :>范围内，呈良好的线性关系（ ! D #,!!!)，" D )），平均回 收率为 !!,"*E，;FG为 #,$$E（" D )）。结论：本法简便快速，精密度良好，可作为甲磺酸帕珠沙星制剂的质量控制 方法。 ［关键词］ 反相高效液相色谱；甲磺酸帕珠沙星；右旋体；含量测定 ［中图分类号］ H*).%.’；;!.(%" ［文献标识码］ I ［文章编号］ "##" J )#!-（’##-）"" J #)"( J #$ !"#"$%&’(#&)’ )* !"+#$),-$" &’ .(/0*1)+(2&’ 3)’)%"#4(’"501*)’(#" 6’7"2#&)’ FKL M01+2345! （#$%"&’"( )$%"(*+ ,-./-"( 0$%!1%2.+3-2%4 )’ 5 63&，7-8$%’ ’.*(##，)$-"%） ［)*+,-’.,］ /*0".,(1"：N8 46OPOQ163 P ;<+=<>? :4O38R S8T O34 R4O4T:15PO185 8S O34 R4UOT8/VT4 15 WP20SQ8U+ P915 :858:4O3P5460QS85PO4 X5Y49O185 % 2",345+：F31:PR20 ?"( ?8Q0:5（-,* :: @ ’)# ::，)!:）P5R Z4H=+931TPQ 68Q0O185（$# A .#）P6 :8[1Q4 W3P64 \4T4 064R PO P SQ8\ TPO4 8S ",# :> B :15 P5R PO P R4O49O185 ·交流沙龙· 678 9::;，!"# $98，%" $77 ’##-年第 ’(卷 第 ""期 第 678 页 &’"(’)** +, &-.’/.0)12+0.# 30+),0)* 万方数据 南瓜多糖的提取纯化及其复方口服液的降血糖作用研究 作者： 吕炜锋， 王兆富， 陈捷， 蔡皓 作者单位： 吕炜锋,陈捷(中国药科大学生命科学与技术学院,江苏,南京,210009)， 王兆富(南京雨花中 医院检验科,江苏,南京,210012)， 蔡皓(南京中医药大学,江苏,南京,210029) 刊名： 药学进展 英文刊名： PROGRESS IN PHARMACEUTICAL SCIENCES 年，卷(期)： 2004,28(11) 被引用次数： 6次 参考文献(10条) 1.党海霞 黄芪治疗糖尿病的药理研究近况[期刊论文]-中医药学报 2002(03) 2.马洪喜;李冬梅 黄芪皂甙对糖尿病大鼠血清激素水平的影响[期刊论文]-微量元素与健康研究 2003(04) 3.倪艳;苏强 黄芪多糖水煎提取工艺的优化试验研究 1998(05) 4.郭建平;孙其荣;周全 葛根总黄酮不同提取工艺的探讨 1995(10) 5.王昌利;薛红;罗宏锁 葛根总黄酮提取工艺研究 1995(06) 6.孔庆胜;蒋滢 南瓜多糖的提取纯化及其分析 1999(04) 7.郭建平;孙其荣;周全 葛根药理作用研究进展 1996(28) 8.宋红晋;黄健 葛根的药学研究及其临床应用概况 1999(04) 9.彭红;黄小茉 南瓜多糖的提取工艺及其降糖作用的研究[期刊论文]-食品科学 2002(08) 10.熊学敏;曹珏 南瓜多糖降糖有效部位的提取分离及降糖作用的研究[期刊论文]-中成药 2000(08) 引证文献(6条) 1.万国福 南瓜多糖提取方法比较[期刊论文]-粮食与油脂 2009(7) 2.李潇霞.杨建雄 南瓜醇提物的体外抗氧化活性[期刊论文]-天然产物研究与开发 2008(2) 3.罗祖友.胡筱波.吴谋成 植物多糖的降血糖与降血脂作用[期刊论文]-食品科学 2007(10) 4.谭桂军 南瓜多糖对糖尿病降糖作用的研究概况[期刊论文]-天津药学 2006(1) 5.王利军.吕杰 南瓜中糖蛋白提取工艺的研究[期刊论文]-粮油食品科技 2006(1) 6.罗祖友 藤茶多糖与总黄酮的提取分离及生物活性研究[学位论文]博士 2005 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_yxjz200411008.aspx