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北京大学医学部分子生物学学习笔记

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北京大学医学部分子生物学学习笔记 北京大学医学部 分子生物学笔记 根据上课讲义和学习笔记整理 缤果网 (http://www.bingomed.com) 2008-01-01 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bingomed.com/) - 2 - 目录 第一部分 多聚酶链反应 ...........................................................................................
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北京大学医学部 分子生物学笔记 根据上课讲义和学习笔记整理 缤果网 (http://www.bingomed.com) 2008-01-01 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bingomed.com/) - 2 - 目录 第一部分 多聚酶链反应 ....................................................................................................................................... 3 PART A. PCR 总论 ................................................................................................................................................... 3 一、原理 ................................................................................................................................................................... 3 ☆二、PCR 反应的主要成份及作用 ....................................................................................................................... 3 三、DNA 重组技术 .................................................................................................................................................. 4 PART B. PCR 各论 ................................................................................................................................................... 7 一、检测基因的达 ............................................................................................................................................... 7 二、对差异表达基因的筛选 ................................................................................................................................... 8 三、PCR 在突变中的应用 ..................................................................................................................................... 10 四、基因拼接 ..........................................................................................................................................................11 五、免疫 PCR ..........................................................................................................................................................11 六、竞争性 RT-PCR(Competition RT-PCR) .......................................................................................................... 12 七、RNAi(RNA 干扰实验) .................................................................................................................................... 12 八、基因表达调控(适合未知基因组) ................................................................................................................... 12 九、如何转录因子与其顺式作用序列的作用?.......................................................................................... 13 第二部分 DNA、cDNA 克隆及哺乳动物细胞基因表达分析.......................................................................... 14 PART A. DNA 克隆 ................................................................................................................................................ 14 一、概论 ................................................................................................................................................................. 14 二、重组 DNA 技术(克隆) .................................................................................................................................... 14 PART B. 基因克隆(Gene Cloning) ........................................................................................................................ 17 一、重组 DNA 文库 ............................................................................................................................................... 17 第三部分 基因克隆和功能分析、基因表达调控.............................................................................................. 20 PART A. 基因克隆和功能分析 ............................................................................................................................. 20 一、从基因到蛋白 ................................................................................................................................................. 20 二、从蛋白到基因 ................................................................................................................................................. 22 PART B. 基因的功能分析 ..................................................................................................................................... 23 一、基因功能分析 ................................................................................................................................................. 23 二、RNA 干扰 ........................................................................................................................................................ 25 PART C. 基因表达的调控 ..................................................................................................................................... 27 一、基因转录的调控 ............................................................................................................................................. 27 附:DNA 甲基化 ............................................................................................................................................ 31 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bingomed.com/) - 3 - 第一部分 多聚酶链反应 PART A. PCR 总论 一、原理 (1)热变性(94℃,1min) (2)退火(G+C 含量<50%选 55℃,>50%选 60℃,1min) (3)延伸(72℃,产物长度<500nt 时,选 1min,>500nt 时选 3min) ☆二、PCR 反应的主要成份及作用 1. DNA Pol:主要是耐热的 DNA Pol 分两类,一类具有校正功能(3’->5’外切酶活性),如 vent, pfu, pwo;另一类不具有校正功能,如 Taq DNA Pol。 2. 引物 (1)长度 15~30bp 为宜,过短降低特异性,过长会增加成本; (2)碱基尽可能随机分布,避免出现嘌呤或嘧啶堆积现象,G+C 含量控制在 45~55%左右; (3)引物内部避免形成二级结构,两个(上游和下游)引物之间尤其是 3’末端不应该有互补链; (4)引物的碱基序列不应与非扩增区域有同源性; RT-PCR 时应注意,提取 RNA 都包含少量 DNA,由于 DNA 由包括内含子和外显子,而 mRNA 是外 显子拼接组成,所以如果选择引物在一个外显子内,同时也有可能将 DNA 扩增;所以设计引物时,应该 位于不同外显子之间。 (5)原则上引物 3’末端与模板序列应严格配对(应避开密码子第 3 位),其末位碱基很大程度上影响着扩增 效率;而引物 5’末端无严格限制,常作为限制性内切酶或其它标记位点(酶标位点 5’末端适当加些保护 碱基),也可加上 ATG 起始密码,或人为错配碱基造成突变。 退火温度取决于引物 Tm 值,4(G+C)+2(A+T)(大致估计),以低于 Tm 值 2~4℃,如果扩增不出,可每 次降低 2℃。 3. PCR 反应缓冲液 组成:50 mM KCl;10 mM Tris Cl (pH8.4);1.5 mM MgCl2。 Mg2+是 Taq Pol 活性所必须的金属离子。 4. 底物 dNTP 浓度 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bingomed.com/) - 4 - dNTP 浓度应该在 20~200 uM,浓度过高可加快反应速度,同时增强了错配率和实验成本;反之,低 浓度可导致反应速度降低,但可提高实验的精确性。 以 50ul 体积为例,10*buffer 5 ul,dNTP(每种 10mM)1 ul,primer 1,2(10uM)各 1ul,Taq DNA pol(2~4ul/L) 1 ul,ddH2O 补至 50 ul。 5. 如何增加 PCR 特异性 (1)家族 DNA,应选择非同源序列; (2)设 Tm=56℃,可从 Tm 开始依次增加退火温度,看能否增加特异性; (3)Touch down PCR:首先从高温度退火(设 Tm=60℃) 94℃(变性) 94℃ 94℃ 注:两步法,退炎 * 5 Cycle 70℃ * 5 Cycle 60℃ * 5 Cycle 温度高,特异 72(退火、延伸) 72℃ 72℃ 性高。 (4)佐剂(甘油 3% or DMSO,这些试剂使 Tm 值增加) (5) 引物设计[a) 加长引物长度,增强特异性;b)G+C 含量高,Tm 值高,两步法] 三、DNA 重组技术 1、概念 用酶学方法,将不同来源的 DNA 分子与载体 DNA 结合成为复制子,导入宿主细胞,筛选出含有目的基因 的转化子细胞,再进行扩增,从中提取获得大量同一种 DNA 分子。 2、DNA 克隆过程 “分切接转筛”,筛选出的基因再进行 PCR 扩增。 ☆3、常见工具酶 (1) 限制性核酸内切酶 识别 DNA 的特异序列,并在识别位点或其周围切割 DNA 双链结构的一类内切酶。 应用:将大片段的 DNA 切割成小片段,将环状 DNA 切割成线状,便于克隆;利用限制性内切酶图谱鉴定 DNA。 (2) 外切酶 ①核酸酶 S1 特征:高度特异性的单链内切酶,可降解单链 DNA 或 RNA,在尿素,SDS 和甲酰胺中稳定。 应用:a) 分析抗 S1 核酸酶降解的 RNA:DNA 杂合体以定位 RNA 转录物的 5’和 3’末端;b) 通过 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bingomed.com/) - 5 - 消化成熟 RNA 分子与 32P 标记的基因组 DNA 杂交形成的杂合体,确定内含子的位置;c) 消化在以反转 录酶合成 cDNA 时形成的发卡结构;d) 去掉 DNA 片段的单链突出末端,产生用于连接的平端。 ②脱氧核糖核酸酶 I(DNaseI) 特征:DNase I 是需二价阳离子的外切酶,降解双链 DNA 产生带 3’羟基的寡核苷酸。在 Mg2+存在 下,在双链 DNA 上产生缺口,在 Mn2+存在下,断裂双链 DNA。 应用:a) 用切口平移法进行放射性探针标记;b) 去除样品中的 DNA;c) 可用 DNase I 分析蛋白(DNA 酶足迹法);d) 在 Mn2+存在时随机裂解 DNA 双链,用于随机克隆。 (3) DNA 聚合酶 ①DNA 聚合酶 I 特征:活性包括 5’->3’ DNA 聚合酶活性、3’->5’外切酶活性、5’->3’外切酶活性。其大片段 Klenow 片段具有 5’->3’ DNA 聚合酶活性、3’->5’外切酶活性。 应用:标记 DNA 的 3’末端;修饰突出的 3’或 5’末端以产生平端;随机寡核苷酸引物介导的 DNA 标记;克隆 cDNA 时合成第二链;双脱氧法 DNA 测序(Sanger 法)。 ②Taq DNA 聚合酶 特征:来源于水生栖热菌 YT1 株;5’->3’ DNA 聚合酶活性,而高温;具有类似末端转移酶的活性; 在 Mn2+存在时具有反转录酶活性。 应用:目前 PCR 中应用最广泛的耐热 DNA 聚合酶。 ③末端脱氧核苷酸转移酶(TdT) 特征:在二价阳离子存在下,催化 DNA3-OH’末端加入脱氧核苷酸,用于 DNA 的克隆化和 DNA 探 针标记。 应用:给载体或 cDNA 加上互补的同聚尾;用于标记 DNA 片段的 3’末端。 (4) 连接酶 ①T4 DNA 连接酶 来源于 T4 噬菌体感染的大肠杆菌,此酶是唯一在正常条件下,有效连接平端 DNA 的连接酶。常用于 连接粘性或平性末端。 (5)逆转录酶 来源:禽类成髓细胞瘤病毒(AMV);莫洛尼鼠白血病病毒(MMLV)。 特征:具有 a) RNA 依赖的 DNA 聚合酶活性; b) DNA 依赖的 DNA 聚合酶活性(不具 3’->5’外切酶活性);具有 RNaseH 活性,即从 5’或 3’端连 续降解 RNA 与 DNA 杂链内的 RNA 链部分。 应用: a) 将真核基因的 mRNA 转录成 cDNA 文库; b) 对具有 5’突出端 DNA 片段的 3’端进行填补和标记; c) 代替 Klenow 酶用于 DNA 序列测定。 (6)T4 多聚核苷酸激酶 催化 ATP 的 r 位磷酸转移到 DNA 或 RNA 的 5’端羟基(高活性),可应用于给单双链核酸分子 5’末 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bingomed.com/) - 6 - 端进行标记。 4. 目的基因的获取方法 (1)PCR 方法;(2)筛选 cDNA 文库;(3)筛选基因组文库;(4)化学合成法。 5. 载体 常见载体包括:质粒、噬菌体、病毒。 质粒作为载体具有下述特征: (1)分子相对较小,3~10 kb 左右; (2)具有松弛型复制子; (3)在复制子以外适当的位置,存在几个单一内切酶位点,便于外源 DNA 片段的插入; (4)具有抗药性和/或插入失活的筛选标记。 6. 将 PCR 产物克隆至载体的方法 Taq DNA pol 具有末端转移酶活性,粘性末端克隆效率比平性末端高。 (1)T/A 载体 5’ T 3’ 3’ 5’T 5’ A 3’ 3’ A 5’ ①PCR 产物如何带 A? a) 高保真的酶(3’->5’外切酶活性) 使新合成的链不带 A,即没有不依赖模板的核苷酸转移酶活性。 将 PCR 产物 + 10*buffer + Taq + dATP,72℃,30min。 b) 从胶回收,若 PCR 放置时间,A 易被水解掉,与上述方法相同。 ②若 PCR 产物含有而又不需要 A a) pfu 酶(高保真酶)与 PCR 产物保温; b) T4DNA Pol 与 PCR 产物保温。 ③T/A 载体制备 a) 限制性内切酶(平端)切割,然后加 T DNA + 10*buffer + dTTP + Taq b) 利用工程的寡聚核苷酸(人为设计) 含有 2 个限制性内切酶位点,Xcm I 切割两端带“T”。 T/A 载体的应用:连接 T/A 载体,用于测序;未知 PCR 产物 DNA 序列。 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bingomed.com/) - 7 - (2)利用引物上限制性内切酶酶切位点 ①限制性内切酶片段放在引物的 5’末端; ②识别序列两端必须有碱基保护,才能被限制性内切酶切割。 5’ ------AGCCGGATG----------3’ Msp I 识别位点 如果引物设计成 5’---CCGGATG---3’,Msp I 无法切割,可首先连接到 T/A 载体,再进行切割。 PART B. PCR 各论 (1)检测表达情况 (2)检测表达谱(在各个组织细胞表达情况,为寻找功能奠定基础) 如管家基因,组织特异性表达,如在肝组织表达,说明与肝脏功能有关 (3)细胞内定位(如在线粒体内,可能与生物氧化有关,在细胞膜、质,可能 与信号有关,在核内可能与基因表达有关) (4)寻找与它相互作用的蛋白质(免疫共沉淀、双杂交法) 如该蛋白与 Ras 相互作用,它可能与细胞增殖有关。 高表达该基因 封闭该基因。 一、检测基因的表达 Northern blot (固相杂交) RT-PCR (√) (半定量,有时 RNA 表达差异体现不出) Real-time PCR 实时 PCR (定量,加了荧光染料,对原始 RNA 进行定量) 核酸酶保护实验 (液相杂交,敏感性>Northern blot) Virtual Nothern blot SAGE 方法 基因表达具有时空特异性,故购买 cDNA 文库必须指明组织、阶段。 RT-PCR 过程(略)。 1. 基因表达检测 (1) PCR 指数增长期、平台期 进行基因表达比较时将 PCR 控制在指数增长期。 (2)进行逆转录时,两个样品逆转录效率不同,所以 RT-PCR 不能准确定量,只能称半定量 PCR。 2. 扩增读码框架 --------ATG----------------UAA-------- 新 gene 新 Pr 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bingomed.com/) - 8 - (1)为防止引物自身二级结构的形成,可利用好密码子的简并性(在 5’末端人工突变) (2)引物设计不可太靠上游,因为 mRNA 常局部形成发夹结构。 (3)cDNA 合成时可用特异引物,而不用 poly T; 5’ AAAA 3’ mRNA (下游)特异引物 (上游)引物 (4)随机引物(一般不主张) 反转录酶、Taq 酶缓冲液不一样,有些公司寻找出能适合该两种酶的缓冲液 —— 一步法。 二、对差异表达基因的筛选 1. 基因芯片 (假阳性太多)。怀疑基因改变,应用 Nothern blot 或其它技术验证。 2. DD 法(差异显示,different-display):扩增出大小不同的 DNA 片段 AAAA TTTT (合成的 cDNA 第一链下游多合成一段下游引物结合位点) 上游随机引物(要求退火温度偏低,因为随机引物较小,与模板结合能力较差) cDNA 文库 5’ TTTT 3’ (测序胶,能分辩一个 bp 有差异) Normal Tumor 可根据条带的宽窄、有无来 检测基因表达情况。但有可能条 带宽度相同(核苷酸数目相同)但 碱基序列不一致。 看到有表达差异的可从胶中 回收、扩增、克隆、测序。 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bingomed.com/) - 9 - 3. 抑制性 PCR 法(suppression PCR) 带有相同接头和不同接头的 DNA 都能扩增。但带有相同接头不能指数扩增,而有不同接头可以指数 扩增。 接头(Adapter or Linker) 5’ 3’ 接头引物 带有相同接头的 DNA 扩增后,由于 5’末端和 3’末端的接头形成配对,阻碍下一轮的扩增引物结合。 大部分形成茎环结构;只有小部分进入下一轮扩增。 4. 5’-末端快速扩增(5’-RACE)/ 3’-末端快速扩增(3’-RACE) (1)RACE(cDNA 末端快速扩增,Rapid Ampliphication of cDNA Ends)是一种获得转录本 5'或 3'未知序列的方 法。不象普通 RT-PCR 那样使用两个序列特异性的引物,RACE 使用一个序列特异性的引物和或者 mRNA 的 poly(A)尾(3' RACE)或者加到 cDNA 末端的多聚同聚体(5' RACE)(图 11)。 第一链引物(人工合成引物,modified oligo dT),同 mRNA 退火 将 mRNA 转录成 cDNA 使用 RNase 混合物降解 RNA;纯化 cDNA 使用 dCTP 和 TdT 对纯化的 cDNA 加尾 5’ GG-GG (人工合成上游引物) 图 5' RACE 步骤概要 (注:在某些金属离子存在时,如没有帽子结构,末端转移酶活性降低;M-MuLV 具有不依赖于模板 的末端转移酶活性。如果合成的核苷酸序列形成局部配对,提前终止,由于没有帽子结构,无法发挥末端 转移酶活性;通过提高温度,去除局部互补) 5' RACE 比 RT-PCR 更具有挑战性,特异性也较低,因为只有一个引物是基因特异性的。5' RACE 的 产物可能是单一产物、多个产物,甚至是不能分辨的连续条带。结果的质量取决于用来合成第一链和扩增 的 GSP 的特异性、扩增所使用锚定引物的特异性、目的 mRNA 的复杂度和丰度及产物的长度。 (2)巢式 PCR(Nested PCR) 使用巢式引物扩增(最多可以三轮巢式扩增),并在连续几轮扩增中使用长度选择性的扩增产物作为 模板可以增加有限量靶序列(如稀有 mRNA)的灵敏度,并提高了 5' RACE 的特异性。增加逆转录保温温度 和 PCR 退火温度,并降低扩增反应中的镁离子浓度可以促进特异性。 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bingomed.com/) - 10 - 第一轮引物 第二轮引物 (3)同一基因可有不同的剪切产物 外显子 1 2 3 转录产物 mRNA 可为:E1E2、E1E3、E2E3、E1E2E3。 与 Gene2 序列互补,作为 Gene2 扩增的上游引物。 (注:Chimera[kai’mi9r9] 希腊神话中狮头、羊尾、蛇身怪物。) 三、PCR 在突变中的应用 引物 3’末端严格互补,5’末端形成突变。 1. 点突变、插入突变、缺失突变(上左) 2. Gene1 突变并取代 Gene2 部分序列(上右) 3. 重叠表达导致突变(下左) 变性 退火 延伸 没有突变的,从细菌 突变的,体外合成的 提取的,往往甲基化 不带甲基化 DPn I 甲基化敏感限制性内切酶 可切割未突变母链,突变链不能切割,转录细菌 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bingomed.com/) - 11 - 4. 环状 DNA 突变(右上) PCR 突变时,对 Tap 酶的要求: (1)高保真(pfu); (2)突变位点两侧核苷酸序列往往是 18~20nt; (3)突变的 nt↑数目会影响突变效率↓。 PCR 突变应用: (1)验证转录因子与其结合位点是否为特异的; (2)分析 Pr 功能,常把编码序列突变,检测其功能区域; (3)常应用突变构建实验中的工具载体。 Rb(抑癌基因),假设 98 位为 Ser,其-OH 发生-P 化时 Rb 失活,cDNA 造成突变,使其 98 位为非-OH AA, 不能-P 化而活性持续存在,将其转染入细胞可抑制细胞增殖;这种重组子称为 dominant negatively。 Q:如何从多个方面证明某 Gene 表达↑,对肿瘤具有保进作用? A:(1)封闭 gene 表达,肿瘤生长↓:a)反义核酸;b)Dominant negatively;(2)(在不表达或低表达的细胞中) 过量表达,细胞增殖↑。 四、基因拼接 1. 基因拼接(下左图) (1)不可发生读码框架移位; (2)在两个 Gene 间设计铰链区,防止其高级结构相互影响。 在下游引物 3’末端加入编码铰链区的 cDNA。 五、免疫 PCR 沉淀 DNA,与染色体 DNA 紧密结合的是组 Pr。 Cancer 可能是由于癌基因量↑,而不是表达量↑;为了避免 RNA 干扰,检测 DNA 时可用免疫 PCR 法。 [注意:(1)高保真,特异性;(2)在 5’末端做文章。] 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bingomed.com/) - 12 - 六、竞争性 RT-PCR(Competition RT-PCR) mRNA 扩增片段引物序列 DNA 反转录 AAA 设计一段与扩增片段无关的 DNA,长度应与扩增片 TTT 片段不同,但不能差太多 500bp 300bp PCR 稀释 扩增片段 DNA 1 1:50 1:100 1:200 加入共同的引物,PCR 竞争片段 (mini PCR) 扩增片段 七、RNAi(RNA 干扰实验) RNSC mRNA 要选择好耙位点,避免 mRNA 序列形成二级结构。 T1 U6 promotor PCR T1 (筛选 RNAi 有效片段) PCR 转染到宿主细胞 八、基因表达调控(适合未知基因组) 克隆调节序列 5’调节序列 E1 E2 E3 E4 mRNA 已知 cDNA 序列 Genome 1 2 3 产生平端的限制性内切酶(一般 4~5 种酶) 构建文库 分别加接头 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bingomed.com/) - 13 - 九、如何分析转录因子与其顺式作用序列的作用? 染色质免疫共沉淀(Chromosome Immune Pull-down, ChIP) 1. 甲醛:蛋白质和 DNA 交联; 2. 物理方法打断 DNA(超声法); 3. 加入抗转录因子的抗体; 4. 亲和沉析,沉淀转录因子和顺式作用元件; 5. 去掉转录因子 注意:(1)Real-Time PCR;(2)做好阳性对照(结合位点,上游、下游为阳性对照);(3)阴性对照(提取 DNA, 用引物扩增) 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bingomed.com/) - 14 - 第二部分 DNA、cDNA 克隆及哺乳动物细胞基因表达分析 PART A. DNA 克隆 一、概论 1. 基因、染色体及基因组(略) 2. 质粒(plasmid):是存在于细菌染色体外的小型环状双链 DNA 分子,1 kb~200 kb,本身含有复制功能的 遗传结构,能独立进行复制。 优点:(1)利用宿主的酶可以快速复制;(2)较易从细菌或酵母菌中分离;(3)赋予宿主菌某些遗传性状(如 抗氨苄青霉素 ampr、抗四环素 terr)。 MCR-multiple cloning region(多克隆位点)。 pCI-neo:Mammalian Expression Vector。 pBR322、pUC19 等质粒载体。 常用作克隆载体的还有噬菌体:lambda 噬菌体和 M13 噬菌体。 带有单链噬菌体复制起始点的质粒(M13 f1),又称噬菌粒(同时带有质粒和单链噬菌体的特点)。 利用同一复制系统的两个质粒存在竞争。 (1)质粒载体的提取和纯化: a) 培养细菌; b) 收集和裂解细菌; 4℃,10min:>15kb,较柔和的转速,先加入糖、酶和 EDTA,然后加入去污剂;<15kb,用较剧烈的转速, 直接加入 SDS 之类去污剂或加热。 c) 纯化质粒 DNA:氯化铯(CsCl)-溴化乙锭梯度密度离心。 小质粒载体可用商业工具,或碱裂解法。 二、重组 DNA 技术(克隆) (一)克隆(Cloning) 为什么操纵 DNA? (1)改变细胞或组织的行为; (2)剥夺细胞或组织特定的基因(knock-out); (3)获得某种蛋白质; (4)获得特定的 DNA 序列; (5)构建组织基因组的片段文库。 1. 重组 DNA 形式 (1)从供体分离的 DNA 酶裂解后,与另一 DNA 分子(克隆载体)连接; (2)该克隆载体-插入 DNA 结构转移至宿主细胞,并在宿主细胞发挥功能;(转移至宿主菌称转化) (3)筛选表达有外源基因的宿主细胞; (4)分离克隆基因表达的蛋白产物。 下面是一些限制性内切酶: 粘末端:EcoRI (G|AATTC)、BamHI (G|GATCC)、PstI (CTGCA|G); 平末端:HpaI (GTT|AAC)、NotI (|GCGGCCGC)。 2. 分子克隆重要性 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bingomed.com/) - 15 - (1)克隆生成大量的纯 DNA,如基因,可以进一步用来印迹、测序、突变、转化细胞; (2)基因组文库包含组织中所有 DNA 序列的拷贝;常可用来分离特定的基因、研究基因组构成; (3)可从染色体库中分离某条染色体,如果某个基因已进行染色体定位,可以较方便地从该染色体中分离该 基因。 (二)重组 DNA 的载体 克隆:从组织中获得并剪切的 DNA 片段与克隆载体连接成重组 DNA 分子,然后转移至宿主细胞, 并利用宿主细胞复制系统进行复制。 载体根据目的不同可分为以下几类: 1. 克隆载体(Cloning Vector) (1) 质粒克隆载体(下左) 细菌质粒是染色体外的环状双链 DNA 分子,可进行独立复制。以大肠杆菌质粒 E. Coli 为例,质粒克 隆载体必须具备以下三个特征:a) 一个复制起始序列 ori;b) 选择性标记位点(如抗氨苄青、抗四环位点); c) 限制性内切酶酶切位点。 (2) λ 噬菌体克隆载体 最常使用的噬菌体克隆载体即 λ 噬菌体克隆载体,该载体染色体“左”臂和“右”臂包括溶菌所必 须的基因,两个臂之间的部分可以“任意使用”,常用来作为克隆位点。 (3) 柯斯质粒(cosmid)克隆载体 cosmid (cos site-carrying plasmid),原指带有粘性末端位点的质粒。所谓柯斯质粒其实是一类由人工构 建的含有λ DNA 的 cos 序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体 。特点: a) 具有λ 噬菌体的特性。柯斯质粒载体在克隆合适长度外源 DNA,并在体外被包装成噬菌体颗粒后,可 高效转染λ 噬菌体敏感大肠杆菌寄主细胞,并能按照λ 噬菌体 DNA 同样的方式环化。 b) 具有质粒载体的特性。柯斯质粒载体具有质粒复制子,因此能像质粒 DNA 一样在寄主细胞内进行复制, 并且能在氯霉素作用下,获得进一步扩增。此外,柯斯质粒载体通常也都具有抗菌素抗性基因,可供作重 组体分子表型选择标记,其中有一些还带上基因插入失活的克隆位点。 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bingomed.com/) - 16 - c) 具有高容量的克隆能力。柯斯质粒载体的分子仅具有一个复制起点,一两个选择记号和 cos 位点等三个 组成部分,其分子量较小,一般只有 5~7kb 左右。因此,可以插入到柯斯质粒载体上并能被包装成λ 噬菌 体颗粒的最大外源 DNA 片段,即柯斯质粒载体的克隆极限可达 45kb 左右。 (4) 穿梭载体(shuttle vectors) 既可转化培养的哺乳动物细胞,又可以转化动物细胞、植物细胞、酵母细胞及其它细胞的这些载体, 通常是穿梭载体,即可以转化两种或更多不同宿主细胞的载体。 Yip(Yeast Integrating Plasmids):包含重组序列,可被整合至酵母染色体,较稳定; YRp(Yeast Replication Plasmid)。 (5)酵母人工染色体(Yeast Artificial Chromosomes, YACs) YACs 是克隆载体,允许重组人工染色体并克隆至酵母宿主细胞。YACs 是线性载体,具有以下特征: a) 染色体每一端具有酵母染色体端粒;b) 酵母中心粒序列;c) 每一臂上具有选择性标记位点(如 TRP1、 URA3);d) 自主复制序列起始点(允许载体在酵母宿主细胞中复制);e) YAC 独特的 RE 位点,允许插入外 源 DNA 片段(up to about 500kb)。 (6)细菌人工染色体(Bacterial Artificial Chromosome, BACs) BACs 可以克隆较大的 DNA 片段(up to about 200kb),BACs 包括天然质粒的复制起始点(F factor),一 个多克隆位点(MCS)、一个选择性标记位点及其它位点。 2. 表达载体(Expression Vectors) 基因克隆的主要目的是对克隆的基因进行表达,而克隆载体中插入的基因不能确保被成功的表达。许 多特殊的表达载体被设计用来表达克隆的基因。这些通过操纵一系列的控制转录、翻译、蛋白质修饰和分 泌的基因元件来实现。 a)相关的转录启动子及终止序列;b) 结合核糖体的能力;c) 克隆基因的拷贝数,及该克隆基因是在质 粒中,还是整合到宿主基因组中;d) 所合成的蛋白质的最终细胞定位;e) 宿主组织中翻译的效率;f) 克 隆基因所表达的蛋白质在宿主细胞中的稳定性。 (1)基因表达载体最基本的要求:克隆基因上游必须具有较强的并可调节的启动子。如来源于 E. Coli. 的 lac 和 lacUV5、来源于 lambda 噬菌体的 trp 和 pL等。 (2)一些融合蛋白系统常用来促进从 E. Coli 中纯化外源蛋白。如 His tail、MBP、GST 等。 基因融合就是将两个或多个 ORF 按一定顺序联接在一起,融合阅读框架的表达产物是一个杂合蛋白。 特点:a) 靶蛋白附着于已知酶功能和/或抗原组成的结构域,可以简化靶蛋白的标记与分离;b) 靶蛋白与 信号肽连接,可将融合蛋白分泌到特定的细胞区;c) 运载蛋白能保护靶蛋白免受原 Host 的蛋白酶解作用; d) 运载蛋白可改善靶细胞的溶解性,防止形成不溶性包涵体。 大肠杆菌中合成的融合蛋白通常多是极好的免疫原,可以产生针对靶序列的抗血清。 但很多时候, 靶序列附加标签会有不利后果,可能丧失生物活性。 (3) 翻译表达载体:a) 一个选择性标记(如 ampr);b) 一个启动子(tac);c) 核糖体结合位点(lac Z);d) 一个 ATG 翻译起始位点(核糖体结合位点下游约 8 个核苷酸);e) 转录终止序列(来源于 lambda 噬菌体的 T1 和 T2) 北京大学医学部 分子生物学笔记 (缤果网 http://www.bingomed.com/) - 17 - 3. 定位载体(Targeting Vectors) (1)逆转录病毒载体法:较有效的方法,但只能转移小片段 DNA(~8kb); (2) DNA 显微注射法: 优点:整合效率高,不需要载体,可转移达 100kb 左右的 DNA 片段;缺点:操作难,难以控制整合 位点。 4. 基因载体治疗 (1)体外基因治疗 a) 收集患者的细胞;b) 通过转移基因到分离的细胞中,纠正基因缺陷;c) 选择和培育基因纠正的细 胞;d) 将这些细胞回输到患者体内。 (2)体内基因治疗 直接将修补基因转移到患者体内。 5. 病毒载体系统 逆转录病毒载体:主要是缺陷型逆转录病毒载体。其中,最主要使用的
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