57丹参中丹参酮_A的提取分离研究

丹参中丹参酮ⅡA的提取分离研究 王秀丽1 * ，刘永刚1，孙茂1，李光赜2 (1．北京中医药大学 中药学院，北京 100102;2．沈阳双鼎制药有限公司，辽宁 沈阳 110179) 摘要:目的 研究丹参中丹参酮ⅡA的提取纯化。方法 以 HPLC 法为检测手段，对丹参酮ⅡA 的提 取工艺，D101 型大孔树脂分离纯化丹参酮ⅡA 的树脂柱径高比、药液质量浓度、上柱吸附体积流量、洗 脱体积流量、生药吸附量、解吸溶媒及其最佳用量等因素进行考察。结果 丹参中丹参酮ⅡA 的最佳提 取分离工艺为:避光条件下，丹参药材用 6 倍量(g·mL －1)的 95%(体积分数)乙醇搅拌提取 4 h，回收 乙醇后用无水乙醇∶石油醚(体积比 15∶ 85)萃取 3 次，旋转蒸发除去萃取溶剂，所得浸膏用与药材量比 值为 1∶ 1(g·mL －1)的 60%(体积分数)乙醇溶解上柱，依次用 27 BV 68%(体积分数)乙醇洗去杂质，8 BV 80%(体积分数)乙醇洗脱，丹参酮ⅡA富集在 80%(体积分数)乙醇洗脱部分。结论 建立了丹参酮 ⅡA的最佳提取纯化工艺，所得浸膏中丹参酮ⅡA质量分数为 53． 65%。 关键词:丹参酮ⅡA;大孔树脂;纯化;提取 中图分类号:R284． 2 文献标识码:A doi:10． 3969 / j． issn． 1006-8783． 2011． 01． 009 文章编号:1006-8783(2011)01-0034-05 Study on the extraction and purification of tanshinon ⅡA from Salvia miltiorrhiza Bge． WANG Xiu-li1* ，LIU Yong-gang1，SUN Mao1，LI Guang-ze2 (1． School of Traditional Chinese Medica，Beijing School of Traditional Chinese Medica，Beijing 100102， China;2． Shenyang Shuangding Pharmaceutical Company Limited，Shenyang，Liaoning 110179) Abstract:Objective To establish the optimum process for purifying tanshinon ⅡA from Salvia miltiorrhiza Bge． ． Methods HPLC was employed to determine tanshinon IIA，and the diameter-length ratio of the column with the macroporous resin D101，the concentrations of the column-loading solutions，adsorbing volume，eluting volume，adsorptive capacity of crude drugs， desorbing solvents and the optimal amounts were investigated to obtain the optimum process of purification on macroporous resin． Results The optimum process of extraction and purification were as follows:in darkroom，Salvia miltiorrhiza Bge． was extracted through 95% ethanol for 4 h，and the product was condensed and extracted with ethanol and ether(15 ∶ 85)for 3times， then condensed again and purified through macroporous resin，adsorbing with 1g herb in 1 mL 60% ethanol，then eluting with 68% ethanol of 27 BV and 80% ethanol of 8 BV respectively． Tanshinon ⅡA was enriched in the elution of 80% ethanol． Conclusion This method could be used to purify tanshinon ⅡA from Salvia miltiorrhiza Bge． The content of tanshinone ⅡA was 53． 65% ． Key words:Macroporous Resin;tanshinons ⅡA;purification;extraction 收稿日期:2010-09-06 作者简介:王秀丽(1978 －) ，女，讲师，博士，主要从事中药复方及新药开发研究，电话:010-84738658，Email:lnwangxiuli@ 163． com;* 为通讯作者。 网络出版时间:2011-01-21 16:17 网络出版地址:http:/ /www． cnki． net /kcms /detail /44． 1413． R． 20110121． 1617． 000． html 广东药学院学报 Journal of Guangdong Pharmaceutical College Feb． 2011，27(1) 丹参是唇形科鼠尾草植物丹参 (Salvia miltiorrhiza Bge．)的干燥根和根茎，是临床最常用的 活血化瘀中药。丹参的脂溶性成分丹参酮具有抑 菌、抗炎、抗凝血等功效，其中丹参酮ⅡA 是脂溶性 成分的代表，在《中国药典》中，丹参酮ⅡA 的含量 是丹参药材的质量控制指标，其对于治疗冠心病、心 绞痛、心律过速均有显著疗效［1 － 4］。因为丹参酮Ⅱ A的功效已经得到认可并广泛应用，合理的提取工 艺显得尤为重要。丹参酮ⅡA 对光、热、氧不稳定， 这增加了提取纯化的难度。传统的醇提法，在其浓 缩、干燥过程中，由于发生化学变化，丹参酮ⅡA 的 损失可达 40%以上［5］。除传统醇提法外，还有超临 界 CO2 萃取 ［6］、微波提取［7］、切割硅胶柱色谱［8］等 方法用于提取丹参酮ⅡA的报道。以上方法都有其 自身优点，但大孔吸附树脂因为具有成本低、吸附性 强、吸附容量大、容易解吸、易于操作、可反复使用及 实验条件易实现工业化放大等优点［9］，更具有其优 势。目前关于大孔树脂法吸附富集丹参酮ⅡA的报 道寥寥［10 － 11］，相关提取工艺参数及纯度还有待进一 步完善。而 D101 型大孔吸附树脂是苯乙烯型非极 性共聚体，适用范围较广，对于不带极性的有机化合 物，吸附能力普遍强。因此本文探讨了以 D101 型 大孔吸附树脂纯化丹参酮ⅡA 的方法，为其纯化及 应用提供实验依据。 1 仪器与试药 Varian series ProStar 高效液相色谱仪(美国瓦 里安) ;R-201 旋转蒸发仪(上海申生科技有限公 司) ;D40-2F电动搅拌机(杭州仪表电机厂) ;LD4-2 低速离心机(北京医用离心机厂) ;AG-285 分析天 平(瑞士) ;BS-3200 超声波清洗器(上海新芝生物技 术研究所，频率 60 kHz，功率 500 W)。 丹参药材，由四川中江丹参基地提供，经北京中 医药大学刘永刚讲师鉴定为丹参 Salvia miltiorrhiza Bge． 的根;丹参酮Ⅱ A 对照品(批号:110766 － 200416，中国药品生物制品检定所)。 D101 型大孔吸附树脂(天津市海光化工有限公 司) ;乙腈为色谱纯，水为重蒸水，其余试剂均为分 析纯。 2 方法与结果 2． 1 丹参酮ⅡA含量的测定 2． 1． 1 色谱条件 色谱柱:shim-pack vp-ODS C18柱 (150 mm ×4． 6 mm，5 μm) ;流动相为水-乙腈(体积比 80∶ 20) ;流速:1． 0 mL·min －1;柱温:30 ℃;检测波长: 272 nm;进样量:20 μL。色谱图如图 1所示。 图 1 丹参酮ⅡA 对照品溶液(A)和供试品溶液(B)的 HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of control solution(A)and sample solution(B) 2． 1． 2 对照品贮备液的制备 精密称取经 P2O5 减 压干燥 24 h的丹参酮ⅡA 对照品 12． 40 mg，置 10 mL棕色容量瓶中，加流动相溶解并定容至刻度，摇 匀，即得丹参酮ⅡA 质量浓度为 1． 24 mg·mL －1的 对照品贮备液。 2． 1． 3 供试品溶液的制备 对于提取和纯化过程 中的各种丹参乙醇溶液，视其对应的质量浓度范围 不同，或直接取原液(原液质量浓度 ＜ 6． 20 mg· mL －1时) ，或将原液稀释至 0． 13 ～ 6． 20 mg·mL －1 范围内(原液质量浓度 ＞ 6． 20 mg·mL －1时) ，摇匀， 经 0． 45 μm微孔滤膜滤过，即得。 2． 1． 4 标准曲线的制备 精密量取对照品贮备液 1 mL，置 5 mL 棕色容量瓶中，加流动相溶解定容， 摇匀，即得丹参酮ⅡA质量浓度为 0． 248 mg·mL －1 的对照品溶液。精密吸取对照品溶液 5、15、25、35、 50 μL以及对照品贮备液20、35、50 μL注入高效液相 色谱仪中，依法测定。以峰面积(Y)为纵坐标，进样 量(X)为横坐标作标准曲线，得回归方程 Y = 5． 0003 ×104 X +1． 8795 ×104，r = 0． 999 8(n = 5) ，线性范围 为 1． 24 ～62． 00 μg。 2． 1． 5 样品测定 精密吸取供试品溶液 20 μL，注 入高效液相色谱仪，依法测定。 2． 2 丹参酮ⅡA的提取 在避光条件下，以 95%(体积分数)乙醇为提取 溶剂，以 60 r·min －1速度搅拌。以丹参酮ⅡA 为测 定指标，按 L9(3 4)正交试验表，对提取次数、提 取时间、溶剂用量进行考察。因素水平设计见表 1， 结果见表 2、3。 由表 2 可知，3 个因素的极差大小顺序为 B ＞ A ＞ C，提取时间对提取工艺的影响最大，其次为提取 次数，溶剂用量影响最小。由表 3 可知，提取时间对 53第 1 期 王秀丽，等．丹参中丹参酮ⅡA的提取分离研究 丹参酮ⅡA的提取具有统计学意义，因素提取次数、 溶剂用量影响无统计学意义。从节约成本角度出 发，确定最佳提取为 A 1 B 2 C 1，即 6 倍量 95% (体积分数)乙醇提取 4 h。按上述优化条件进行 3 次重复性验证试验。结果，丹参酮ⅡA 提取率分别 为 63. 79%、62． 98%、63． 47%，平均提取率为 63. 41%，丹参酮ⅡA 的质量分数为 16． 73%，验证 结果表明工艺基本稳定可行。 表 1 提取正交试验因素水平表 Table 1 Factors and levels in extraction experiment 水平 因素 A 提取次数 /次 B 提取时间 /h C 溶剂用量 /倍 1 1 2 6 2 2 4 8 3 3 6 10 表 2 提取正交试验结果 Table 2 Results of orthogonal test of extraction(n = 3) 试验号 A B C D(空白) 丹参酮ⅡA 提取率 / % 1 1 1 1 1 45． 14 2 1 2 2 2 67． 83 3 1 3 3 3 67． 32 4 2 1 2 3 46． 75 5 2 2 3 1 70． 48 6 2 3 1 2 68． 03 7 3 1 3 2 59． 35 8 3 2 1 3 71． 81 9 3 3 2 1 66． 91 K1 180． 29 151． 24 184． 98 182． 53 K2 185． 26 210． 12 181． 49 195． 21 K3 198． 07 202． 25 197． 15 185． 88 R 17． 78 58． 88 15． 66 12． 68 表 3 提取工艺方差分析表 Table 3 Variance analysis(ANOVA)table of extraction 因素 偏差平方和 自由度 F P A 56． 103 2 1． 949 B 681． 297 2 23． 669 ＜ 0． 05 C 45． 058 2 1． 565 D 28． 78 2 2． 3 大孔吸附树脂纯化丹参酮ⅡA 的工艺考 察［12 － 13］ 2． 3． 1 大孔吸附树脂的预处理 将 D101 型大孔 吸附树脂用无水乙醇浸泡 24 h 后湿法装柱，待树脂 装好后，用乙醇洗脱树脂柱至流出液与蒸馏水(体 积比 1∶ 1)混合不产生白色浑浊，再用蒸馏水冲洗至 无乙醇味;然后用 2 倍体积 5%(体积分数)HCl 以 2． 5 mL·min －1流速通过树脂层，并浸泡 2 ～ 4 h，用 蒸馏水以同样的流速洗至流出液 pH 值呈中性;最 后用 2 倍体积 2%(体积分数)NaOH溶液以 2． 5 mL ·min －1流速通过树脂柱，并浸泡 2 ～ 4 h 后，用蒸馏 水以同样流速洗至流出液 pH值呈中性。 2． 3． 2 上柱样品液的制备 取“2． 2”项下提取液 回收乙醇至无醇味后用无水乙醇-石油醚(体积比 15∶ 85)萃取 3 次，丹参酮ⅡA 的质量分数可提高至 37． 54%。浸膏用与药材量比值为 1 ∶ 1(g·mL －1) 的 60%(体积分数)乙醇溶解，作为上柱样品液。 2． 3． 3 树脂柱径高比、药液质量浓度及上柱吸附体 积流量的优选 按 L9(3 4)正交试验设计表的设计 进行柱径比、药液质量浓度及吸附体积流量的考察， 因素水平设计见表 4，结果见表 5、6。 表 4 吸附正交试验因素水平表 Table 4 Factors and levels in adsorption experiment 水平 因素 A ρ药液(按生药计)/ (g·mL －1) B 树脂柱 径高比 C 上柱吸附体积流量 / (BV·h －1) 1 1∶ 2 1∶ 3 0． 20 2 1∶ 1 1∶ 6 0． 16 3 2∶ 1 1∶ 9 0． 12 由表 5 可知，3 个因素的极差大小顺序为 A ＞ C ＞ B。由表 6 可知，因素 A、B、C 均无统计学意义。 确定最优方案为 A2B2C3，即按生药计算的药液质量 浓度为 1∶ 1(g·mL －1) ，上柱吸附体积流量为 0． 12 BV·h －1，树脂柱径高比为 6∶ 1。按上述优化条件进 行 3 次重复性验证试验。结果显示，以丹参酮ⅡA 计，吸附率分别为 99． 02%、99． 36%、98． 87%，验证 结果表明工艺稳定可行。 2． 3． 4 生药吸附量考察 取上柱样品液 100 mL， 加入含 75 mL D101 型大孔吸附树脂的色谱柱中，分 段收集吸附流出液，每段收集 2． 5 mL。分别测定每 63 广东药学院学报 第 27 卷 个流份中丹参酮ⅡA 的质量浓度。流份 11 中丹参 酮ⅡA的质量浓度为流份 10 的 11． 43 倍，表现出明 显的泄漏现象。按每段流份体积为 2． 5 mL计算，总 上样体积为 25 mL，相当于 25 g 生药。提示 0． 75 mL D101 型大孔吸附树脂的最佳吸附量为 0． 25 g 生药。 表 5 吸附正交试验结果 Table 5 Results of orthogonal design of adsorption(n = 3) 试验号 A B C D(空白) 吸附率 /% 1 1 1 1 1 73． 3 ± 2． 8 2 1 2 2 2 81． 9 ± 3． 4 3 1 3 3 3 83． 8 ± 2． 2 4 2 1 2 3 98． 7 ± 1． 5 5 2 2 3 1 99． 3 ± 1． 2 6 2 3 1 2 89． 1 ± 2． 3 7 3 1 3 2 94． 2 ± 0． 9 8 3 2 1 3 94． 6 ± 1． 3 9 3 3 2 1 93． 1 ± 0． 9 K1 239． 0 266． 2 257． 0 265． 7 K2 287． 1 275． 8 273． 7 265． 2 K3 281． 9 266． 0 277． 3 277． 1 R 48． 1 9． 8 20． 3 11． 9 注:吸附率 = (吸附前药液中丹参酮ⅡA的质量 －吸附后药液中 丹参酮ⅡA的质量)/吸附前药液中丹参酮ⅡA的质量 × 100% 表 6 吸附工艺方差分析表 Table 6 Variance analysis(ANOVA)table of adsorption 因素 偏差平方和 自由度 F A 464． 562 2 15． 382 B 20． 916 2 0． 693 C 78． 216 2 2． 590 误差 30． 20 2 2． 3． 5 解吸溶媒考察 按上述优化条件，取上柱样 品液 100 mL进行试验。吸附完毕后，依次用 60%、 68%、75%、80%、85%、90%(以上均为体积分数) 乙醇洗脱，洗脱体积流量为 0． 18 BV·h －1，至洗脱 液中无法检测到丹参酮ⅡA为止。分别测定各部分 的丹参酮ⅡA 含量，计算出累积解吸率分别为 1. 45%、3． 87%、8． 03%、64． 12%、87． 64% 和 95. 86%。结果提示，80%(体积分数)乙醇可以将 绝大部分丹参酮ⅡA 从 D101 大孔吸附树脂上解吸 下来。 2． 3． 6 洗脱体积流量考察 取上柱样品液 100 mL 共 3 份，吸附完毕后，用体积流量分别为 0． 12、 0. 18、0． 24 BV·h －1的 80%(体积分数)乙醇洗脱， 至洗脱液中无法检测到丹参酮ⅡA 为止。结果，洗 脱体积流量 0． 12、0． 18、0． 24 BV·h －1对应的溶媒 用量分别为 6． 8、8． 1、10． 8 BV。从节约成本和时间 的角度考虑，将洗脱体积流量确定为 0． 18 BV· h －1。 2． 3． 7 解吸溶媒用量考察 取上柱样品液 100 mL， 吸附完毕后，用 80%(体积分数)乙醇洗脱，分段收集 洗脱液，每段60 mL，共收集50份，测定每段流分中丹 参酮ⅡA含量。结果，流份 40 的丹参酮ⅡA 质量浓度 为流份 41的 32． 75倍，表明在第 40 段流份时基本解 吸完全。即溶媒用量为 2 400 mL，相当于 8 倍树脂 容积。 2． 4 验证试验 按优选的最佳纯化工艺，即取丹参药材 100 g， 按“2． 2”项下方法提取后所得浸膏，用与药材量比 值为 1∶ 1(g·mL －1)的 60%(体积分数)乙醇溶解。 采用树脂柱径高比为 1 ∶ 6，300 mL 的 D101 大孔吸 附树脂，以按生药量计算 1 ∶ 1(g·mL －1)的药液质 量浓度，0． 12 BV·h －1的速度动态吸附。静置 2 h 后，以 0． 18 BV·h －1的洗脱体积流量，依次用 27 BV 68%(体积分数)乙醇、8 BV 80%(体积分数)乙醇 洗脱，回收 80%乙醇至无醇味。平行制备 3 份，所 得浸膏分别用流动相定容至 100 mL，取 0． 5 mL 定 容至 10 mL，按“2． 1． 1”项下条件进行测定。结果表 明，优选得到的工艺条件能较好地提取纯化丹参酮Ⅱ A，浸膏中丹参酮ⅡA 的质量分数分别为 53. 10%、 54. 39%、53． 46%，平均质量分数为 53. 65%，重现性 较好。 3 讨论 因为丹参酮ⅡA对光、热均不稳定，所以全部操 作过程均采取了避光、低温的措施(在 20 ℃的空调 暗室内进行)。提取正交试验中，提取次数和溶剂 用量对提取率的影响无统计学意义，考虑到生产成 本以及回收乙醇时间延长丹参酮ⅡA 易损失的问 题，最终确定了采用 6 倍量的提取溶剂提取 1 次。 提取时间为 6 h 时丹参酮ⅡA 提取率比提取 4 h 时 略有降低，推测是因为丹参酮ⅡA对光、热、湿、氧等 多种因素均不稳定，随着搅拌时间的延长而增加了 降解［5，14］，造成丹参酮ⅡA的损失。 73第 1 期 王秀丽，等．丹参中丹参酮ⅡA的提取分离研究 本研究采用大孔吸附树脂法对丹参酮ⅡA的纯 化工艺进行考察，结果表明，D101 型大孔树脂能够 有效地对丹参酮进行富集，使指标成分丹参酮ⅡA 的质量分数达到 53． 65%，明显高于大孔树脂纯化 丹参酮ⅡA 的同类文献［11］中所述的 42%。本工艺 简便、稳定、可行性高，为含丹参酮ⅡA 制剂的研究 奠定了基础。 参考文献: ［1］TAKAHASHI K，OUYANG X，KOMATSU K，et al． Sodium tanshinoneⅡ A sulfonate derived from danshen (salvia miltiorrhiza)attenuates hypertrophy induced by angiotensin Ⅱ in cultured neonatal rat cardiac cells［J］． Biochem 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(责任编辑:刘晓涵  ) 美国 FDA批准 Gardasil疫苗用于预防直肠癌 美国 FDA于 2010 年 12 月 22 日批准 Gardasil疫苗用于 9 ～ 26 岁人群预防直肠癌和与 6、11、16、18 型人 类乳头瘤病毒(HPV)有关的癌前病变。在此之前，Gardasil已经获准用于相同年龄组女性人群预防宫颈癌、 外阴癌及阴道癌等。除此之外，Gardasil还已经被批准用于预防因 6、11 型 HPV引起的男、女性生殖器疣。 FDA有关主管官员指出，目前直肠癌的治疗正面临挑战，通过使用 Gardasil 疫苗预防直肠癌非常重要， 因为它可以有效减少直肠癌发病病例数量及随之而来的外科手术、放射治疗和化疗方面的需求。 尽管直肠癌在普通人群中并不常见，但发病率正在上升。据美国癌症协会估计，美国每年有大约 5300 人被诊断出直肠癌，其中女性多于男性，且 90%的直肠癌与 HPV 有关。先前在男同性恋人群中(该人群直 肠癌发病率是最高的)进行了随机试验以验证 Gardasil 疫苗预防直肠癌和 HPV － 16 /18 感染引起的癌前病 变(即 1、2、3 度直肠上皮内瘤变 AIN)的功效。到研究结束时，Gardasil疫苗预防与 HPV －16 /18 有关的直肠 上皮内瘤变(AIN)的有效率为 78%。由于直肠癌是男性和女性都会罹患的疾病，这一数据可认为对女性同 样适用。 如果注射疫苗时已经发生因 HPV感染引起的直肠癌前瘤变，Gardasil 疫苗不会阻止病情继续发展。也 就是说，Gardasil疫苗只对接种前未感染 HPV的人有效。但如果医生认为某些个体有必要进行直肠癌防癌 检查，那么这些人即使已经接种了 Gardasil疫苗，其直肠癌防癌检查也不应因此而停止或放弃。 Gardasil由默克公司研制生产，自 2006 年批准至 2010 年 5 月 31 日，在全球范围内已经售出 6 500 万剂。 其常见的副作用包括头晕、注射部位疼痛、头痛、恶心和发烧等。 (来源:美国 FDA新闻稿 2010-12-22 夏训明编译) 83 广东药学院学报 第 27 卷