骨髓间充质干细胞的分离分化及研究进展

骨髓间充质干细胞的分离分化及研究进展 摘要：骨髓间充质干细胞是存在于骨髓基质中的非造血系细胞，它们能够分化成中胚层和非中胚层细胞。骨髓间充质干细胞主要有4种体外分离方法：贴壁筛选法，密度梯度离心法，流式细胞仪分离法和免疫磁珠分离法。由于骨髓间质干细胞具有多方面的优势,越来越受到人们的关注，研究也越来越深入。本文从来源、形态、体外分离培养及应用前景几个方面做一综述，为相关研究提供参考。 关键词：骨髓间充质干细胞；分离培养；分化 骨髓由造血组织和基质构成，近年的研究表明，在骨髓基质中存有间质干细胞(me5enchyma15temcel15，MSCS)，骨髓原始间充质干细胞是骨髓基质干细胞，对骨髓中的造血干细胞（HSC）不仅有机械支持作用，还能分泌多种生长因子（如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等）来支持造血，体内外实验已证明它具有多向分化潜能，在一定的诱导条件下MSCS具有向成骨细胞、成软骨细胞、成肌细胞、肌键细胞、脂肪细胞等中胚层细胞分化的能力。因此它已成为医学界近来研究的热点，但骨髓中MSCS含量很少,每1万～10万个单核细胞中大约有1个MSCS,难以满足实际应用的需要，因此体外分离纯化MSCS,研究其培养特性，获得大量稳定的MSCS具有重要的理论意义和现实意义。 1. 骨髓间质干细胞的来源 在生物个体的发育过程中先后出现胚胎干细胞和成体干细胞,具有多向分化潜能的间质干细胞作为一种成体干细胞来源于中胚层间充质,主要存在于全身结缔组织和器官间质中,以骨髓组织中含量最为丰富,在人的骨髓中约占单个核细胞数的1/1×105[1]。间充质干细胞是一类贴壁基质细胞，可以向间质组织分化，包括骨组织，软骨组织，脂肪组织。目前研究较多的间质干细胞主要来源于脐带血、外周血及脂肪组织。MSCS的获得主要来自于骨髓的抽吸，人类MSCS一般从髂前上棘吸取，也可从胫骨、股骨、胸骨、腰椎等骨中获取，大动物MSCS的获取部位与人类相同，兔需抽取中段胫骨或股骨的骨髓。 2. 骨髓间质干细胞的细胞形态 体外培养的MSCS体积小，成梭形或多角形，核浆比大，多为平行排列生长或漩涡状生长，部分贴壁细胞可以快速形成集落，一些呈典型的纺锤形样的MSCS增殖迅速，形态均一。细胞传代后，传代细胞较原代细胞的贴壁速度快，细胞传到第3代时细胞形态比较一致。在光镜和相差显微镜下， MSCS为长梭形，类似成纤维细胞外观。透射电镜下MSCS可表现为两种不同的形态结构类型:一种是处于相对静息状态的细胞，核较大，核质比大，胞质内细胞器少;另一种是处于相对活跃期细胞，细胞体积大于前者，核不规则，含2～3个核仁，核质比小，胞质中有丰富的细胞器。 3. 骨髓间质干细胞的体外分离方法 体外从骨髓分离获得的方法主要有贴壁法,密度梯度离心法,流式细胞术和免疫磁珠分离法[2]，但更理想的分离纯化方法还有待于进一步的摸索。贴壁筛选法是利用细胞贴壁时间及贴壁牢固性的不同逐步将非贴壁细胞和其它杂质细胞去除的一种简单易行的培养MSCS的方法。贴壁分离培养法分离的MSCS能在体外培养条件下生长良好、可连续传代，体外培养扩增能力较强，其缺点是细胞纯度较低［3］。此方法简便，冲出骨髓直接培养，然后利用骨髓MSCS贴壁生长特性，更换培养液逐步去处漂浮生长的造血系细胞即可获得较纯化的MSCS；而且骨髓中的造血干细胞能分泌生长因子和促贴壁物质，可促进MSCS贴壁生长，因此全骨髓贴壁法更为可取。密度梯度离心法梯度离心法的核心主要是基于密度梯度离心技术。梯度离心法是根据骨髓中细胞成分的比重不同，使用淋巴细胞分离液提取单个核细胞，再进行贴壁培养，从而达到分离、纯化MSCS的目的。Pittenger等的研究发现通过密度梯度离心分离培养的间充质干细胞在第一代时纯度可以达到95%[4]。常用的分离方法免疫磁珠法，是利用免疫学的技术分离MSCS，分离细胞的纯度高。Phinney［5］用一种免疫耗损技术精确地将造血细胞系和内皮细胞系从基质细胞中分离出来，提供了一种能高效的分离纯化间充质干细胞的方法，但目前仍未筛选到真正特异性的细胞表面标记;而且，这两种分离方法的操作对细胞活性都有较大影响，造成MSCS损伤，出现增殖缓慢等问，这些技术问题很大程度上限制了这两种方法的应用。因此，如何能简便高效地获得均质性的间充质干细胞和细胞群仍需要继续探索。分离细疫磁珠分离和流式细胞仪筛选的方法，不仅对细胞活性影响较大，而且操作复杂，价格昂贵。然而，这些纯化间充质干细胞的方法比较复杂，一般仅限于在各自的实验室应用。因此，如何能简便高效地获得均质性的间充质干细胞细胞群仍需要继续探索。 4.骨髓间质干细胞的分化 现在的研究揭示骨髓间充质干细胞有分化成多种细胞的潜能[6],包括心肌细胞[7]、肝细胞[8]、脑中的神经细胞和非神经细胞、内皮细胞、成骨细胞和肺泡上皮细胞等。在心肌细胞方向分化方面，Fukuda[9]研究发现鼠骨髓间充质干细胞在5-氮杂包苷作用下,干细胞形成肌管状结构并有明显的细胞之间的交互作用,开始可自发搏动,最终可以同步搏动,从而说明了间充质干细胞可以诱导为心肌细胞。其他一些研究人员研究表明人胚胎干细胞体外可以分化为不仅具有心肌细胞结构而且还同时具有功能的肌细胞[10]。有学者用免疫磁珠法分选纯化得到小鼠间充质干细胞，双苯甲亚胺和溴脱氧核苷标记后注入新生小鼠侧脑室。骨髓间充质干细胞迁徙到纹状体、海马中，并在该处分化为成熟的神经胶质细胞。在脑干的网状结构中出现表达神经丝的供体细胞，提示骨髓间充质干细胞可以分化为神经元。Verfaillie [11]在体外成功地诱导分化为血管内皮细胞，同时证明诱导分化而来的内皮细胞具有成熟内皮细胞的功能，在人工基底膜上可形成血管结构。实验说明在适宜条件下间充质干细胞能够向血管内皮细胞转换，可以在体外诱导扩增后作为血管内皮细胞移植供体用于血管疾病治疗。 5.骨髓间质干细胞的应用前景 骨髓间充质干细胞是一种成体干细胞，具有较强的可塑性，在体内外特定条件下可向成骨、软骨、神经、肌肉、皮肤和肝等多种类型的成熟细胞分化［12］，同时MSCS还具有独特的免疫调节作用。由于MSCS具有来源方便、扩增迅速、可塑性强、离成熟细胞近和多向分化潜能,而且还可以实现个体化治疗、无免疫排斥问题和伦理之争等,因此是最具有临床应用优势的种子细胞,在创伤修复、组织或器官重建、退行性疾病、遗传性疾病、抗肿瘤、抗衰老等方面具有广阔的应用前景[13]。近年来，研究发现间充质干细胞还具有特异性向肿瘤组织迁移的特性，因此有人将其作为基因治疗细胞载体携带Interferon-β[14]治疗基因、溶瘤病毒[15]靶向到达肿瘤局部，杀伤肿瘤细胞。最新的研究更是发现随着培养代数的增加,MSCS与纤维母细胞表面抗原的差异会减小,并且用于检测的一些抗体如CD105、CD166、CD90、CD44、CD29、CD73等也表达于肺或者皮肤的纤维母细胞[16] 。 5.结论 MSCS这个概念是由Friedenstein和他的同事在40多年前提出的[17]。随后的研究发现其具有向骨、软骨、脂肪、肌肉、肌腱及骨髓间质等多种间充质组织分化的潜能[18],近来又有研究发现MSCS与肿瘤的发生、发展有着重要的联系。因此,如何培养出高纯度、稳定的MSCS,是进行更深一步研究的基础。尽管较多的动物实验、临床前期实验和资料表明，MSCS在治疗上具有安全性和有效性，但仍然存在其环境作用和调控机制等方面的问题，诸如与治疗相关的细胞移植、移植物移入、归位和体内的分化等仍需进一步研究。干细胞治疗的广泛运用必须依赖于有效的、大规模的培养、储存，而支架对其运用也起着相当重要的作用。在过去干细胞研究中对MSCS生物学特性已有了相当的认识，这对其运用于临床治疗提供了坚实基础，随着对其特性的不断揭示，MSCS在临床治疗应用有着理想前景。 参考文献： [1] FRIEDENSTEIN A J, PETRAKOVA K V, KUROLESOVA A I,et a.l Heterotopic ofbonemarrow Analysis ofprecursor cells for osteogenic and hematopoietic tissues [J]. 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