动物源性食品中弓形虫Nested+PCR-RFLP分子检测技术的建立

中国兽医寄生虫病2007，15(6)：1．7chine弗JoqrⅡd0fVd盱i“唧Pam缸“o盯 ·研究论文· 动物源·眭食品中弓形虫NestedPCR —RFLP分子检测技术的建立 王权1，王巧垒2，潘淑娟3，陈志强4， 陈永军1， 常小斌4， 李健2 11．中国农业科学院上海兽医研究所，上海2∞232；2．上海出入境检验检疫局。 上海2帅135；3．上海市青浦区动物疾病控制中心，上海201700；4．湖南农业大学。长沙410128) 摘要：目的为了建立一种快速、特异、灵敏检测动物源性食品中弓形虫的技术。方法根据原虫rDNA的部分 序列，找出弓形虫和新孢子虫共同保守DNA片段，设计套式PcR两对引物．以uhraPIl陀瑚基目组DNA快速提取试 剂盒提取弓形虫和新孢子虫DNA为．初步建立了检测两种虫体的NestedPcR技术。将纯化的Ne蒯PcR产 物成功地克隆到pGEM·‰丛y载体中，经鉴定、测序并进行同源性分析。结果Nested—PcR的外、内引物时两种虫 体rDNA基因均能进行扩增，长度分刺在800—900bp、400～500bp之间。内引物扩增DNA序列与套布的同种虫 体DNA序列同源性较高，弓形虫和新袍子虫分刺达99．1％、97．2％，但它们两者之间差异较大，同泺性仅为86． 6％。用软件寻找能区别两者基因序列差异的酶切住点，挑选内切酶进行RFLP实验，结果表明新孢子虫N岛州 pcR扩增片段能被Vspl酶切。同时进行该分子检测技术的特异性和教感性试验，实验证明该NestedPcR能对弓 形虫和新袍子虫rDNA基因进行特异性的扩增．而时其它原虫基因未能扩增出任何片段；该Nes‘ed—PCR能检测出 100十弓形虫速殖子／g猪肉。结论本实验建立N啊IedPcR检测方法不仅可用于检测动物性食品中弓形虫，而且 能明确区分弓形虫和新孢子虫。 关键词：弓形虫；新孢子虫；垂式PcR；食品检刹 中图分类号：S852．723文献标识码：A 文章编号：1005_0868(20∞)06·000l-07 ESTABLISHMENT0FNESTEDPCR-RFLPFoRDETECT矾G ZDXDP酗SMrAGD?、7：DⅡINAND厦AL．DEI江VEDFooD wANGQu粕。， wANGQi∞-qu衄2，PANshuouan’，cHENzhi—qiar曾 CHENYon90IlIl‘，CHANGXiao．bin4，UJiaⅡ‘ (1．轴删咖i％抛珈口ry鼬删n触出Ⅱ把，c^As，舶删曲瓜200232，‰；2．‰，神耐 西忉，一砒如咿曲n∞d0删妇Bm甜，5k哪耐200135，c^打m；3．Q打w凡c咖 加’A瓜md髓湖站c0刖一衄d胁n砌n，轴佣g^面201700，吼打坼；4．肌。，b帆 电睹础u陀踟矗哪母，“硼酽k410128，c枷m) Abstract：obj硎veInordert06ndBf醅tspec迁icandsensitiveIIlokculemethodt0detectn啪zPkmdgo卅 以iIlt11eanimalf捌productB．Me恤ods111econ8eⅣ砒iveDNA姆mentof血e‰叩k啪GD，删明d血e ⅣPnjPom血耐栅waBfound0utaccoldi“gtopart鸵quence0fproto日00nrDNA，twopa涵0fpdⅡ嘲jforNes把d PcRweredesignedthentlleNestedPcRford帆tingtwopolypidewase袖ishedw汕山e‰叩knm踟以甜and tlleⅣ瞰EPDm血n梳帅ltemplateswhichwereext瑚Ictedf南mthemusi“gtheUl曲f、lre懦genorneDNAfastexh_ac廿ng kit．Thepu曲edNe札edPcRpfoduct马were暑ucce豳my山nedintothepGEM．T—e鹪yvector，恤nw帆eequenced aTld锄alyzedhomogene叫s．Thee“巧mecutsitest}l砒eoulddj出“guishtwogene0rderdiⅡbfencew鹪卵archedby 收稿日期：2005—03—07 基金项目：上簿科委标准专项(05dz05011)，国家质检总局科研项目(2006IK()07)。 作者简介：王权(1966一)．男，江苏人，硕士，副研究员，主要从事家畜寄生虫病诊断技术研究。 万方数据 中国兽医寄生虫病 2007年11月 80nware。incisionemvmew粕choBedtornakeRFIPt鸵t．Res．1l协Theextm柚dintr0prime瑁t0NestedPCR c叫ld枷pli矗catetwopolypiderDNAgene，andthelengthofeach啪plmcationhgmemwasbetween800一900 bp，400—500bp．Thehomolo科甜irItropnmerampli6ca垃蚰DNA∞quencew聃hi曲compa一“gwiththehomoge- ne时polyPidewhichhadbee“publicated，a|ldt．1at0ftlle‰0PkM岛删h锄d肌咀妒。mchnin“mwererespec． tivelyabove99．1％蛐d97．2％．Bu¨hedifIbrencebetweeⅡ‰Dp^鄙mdCD蒯缸andmmP0m∞nin啪w硒obvi． ous，thehomologyofthemwBs帅ly86．6％．TheNeg￡edPcR蛐plmcationfragment0f￡heⅣe珊Pomc0耐础m c叫ldbecutbyVsp1．11le砌唧kMcD础f舳dtIle肌n卵m如nin蜊rDNAge聃couldbespecinc锄p船cat_ edbytheNestedPCR，butotheopIotozooncoIlldIl’t．7rhismeIhodcoulddetectloo脚k砌GD砌f诅ch”oites per1伊狮0fpork．Co眦I啷．0nneNestedPCRthates诅bishedinthis8tudycoulddetect龇‰opZ渊Go槲i in蚰imal-derived删，me衄whilehc砌ddis6ngIlish％御k砌G0础faIldⅣeo∽m如nfn吼 Key舯rds：丁缸叩kmn函，删i；Ⅳ即jP唧C锄轨um；NestedPCR；RFLP；缸砌detecb帆 弓形虫病是由肉孢子虫科刚第弓形虫(‰o— pk，mgo蒯i)引起的人畜共患性疾病，可通过多种 途径感染人，其中通过动物源性食品中包囊感染人 是重要途径⋯。新孢子虫病是由肉孢子虫科另一 种原虫新孢子虫(№甲ommninum)引起的多种动 物共患性疾病，牛、绵羊、山羊、马、鹿等均可为中间 宿主，其终末宿主是犬，该病主要造成孕畜流产、死 胎及新生仔畜运动神经障碍，对牛的危害尤为严 重‘圳。 由于两种虫体在形态、大小极为相似，在光学显 微镜下，若不进行免疫组织化学染色，难以区分刚第 弓形虫和新孢子虫，并且弓形虫和新孢子虫在组织 形成的包囊小，常规的镜检不易发现组织包囊。目 前国内外运用血清学检测食品中寄生虫的研究报道 较少，而目前我国新孢子虫病研究刚刚起步，还未研 制出血清学诊断试剂。PCR技术由于快速、特异性 强、灵敏度高的特点，已经被广泛运用于动物疾病诊 断及食品中病原体的检测，如大肠杆菌、沙门氏菌的 检测等。对两种虫体进行基因序列分析，发现弓形 虫和新孢子虫的18sRNA基因序列同源性非常高， 而rrs区域碱基序列同源性仅为80％，可根据rrS 基因序列设计引物进行Nested—PcR，希望敏感地扩 增出两者的基因片段，再寻找区别两者基因差异的 酶切位点，进行限制性内切酶片段长度多态性RFLP (Res试ction蛔咖entkngthp01yTno呐ism)来区别虫 种。 由于弓形虫包囊内缓殖子数量不等(由几十到 几千)，用单位食品中弓形虫速殖子数作为衡量分 子检测方法的灵敏度比以单位食品中包囊数量更科 学。因此本试验中将弓形虫速殖子加入肌肉中为模 型。建立研究检测动物源性食品中弓形虫Nested PcR．RFLP的分子检测技术。 1材料与方法 1．1材料 1．1．1 虫株弓形虫虫株(RH株)、锥虫由中国农 科院上海兽医研究所液氮中保存提供；隐孢子虫、鸡 艾美尔球虫、牛球虫纯化后4。c保存；新孢子虫计 数灭活后一20。c保存。 1．1．2菌株和质粒大肠杆菌JMl09由本所实验 室保存；pGEM—T-easy克隆载体购自Pmmaga公司。 1．1．3实验动物昆明小鼠，18—22g，雌性，购白 上海复旦大学实验动物中心 1．1．4主要试刺uniq—lo柱式DNA琼脂糖回收 试剂盒、TaqplusDNA聚合酶、DNAMark购自上海 生工生物技术服务有限公司；dNTP、琼脂糖、琼脂粉 购自华美生物工程有限公司；T4DNA连接酶购自 Pmmaga公司；ul叽PIlre”基因组DNA快速提取试 剂盒购自上海赛百盛基因技术有限公司；蛋白酶K 购自MERcKKGaA(贮存液用ddH20配成20mg／ IIll)。 1．2 引物设计原虫rDNA序列包含5’一IGs—18s rDNA-rrsl_5．8rDNA-rrS2-28SrDNA—IGS_3’根据 www．ncbinlIll．njh．gov的GenBallk上下载的弓形虫 rrsl_5．8rDNA一Ⅱs2(序列号：x75453)基因，找出弓 形虫和新孢子虫相同保守DNA片段，参照引物设计 原则，设计套式PcR两对引物，以期能扩增出弓形虫 利新孢子虫DNA片段，但扩增的序列有各自特异性。 外弓l物前5’-AccTITGAATcccAAGcA-3’， 外弓I物后5’-TAAATcGGACAAAcGccc·3’； 内弓I物前57一TrrGcArI℃AAGAAGcGTc一 37，内引物后5’一从GGTBccA7nTCCGTrc．3’o 1．3弓形虫虫体的复苏、扩增和纯化从液氮中取 山弓形虫RH株速殖子，于37。c左右复苏，以弓形 万方数据 第15卷第6期 王权等：动物源性食品中弓形虫Ne咖d·PcRRnP分子检测技术的建立 虫107速殖子／mL含量无菌操作腹腔接种健康昆明 系小鼠(18—22g)100只，每鼠0．2mL(约2x10。 虫体)，2—3d后颈椎脱臼处死昆明鼠，用3—4mL 无菌生理盐水冲洗腹腔，收集冲洗液，3000r／min 离心10min，弃上清；沉淀用含0．25％胰酶生理盐 水于37oc消化处理45miIl，除去白细胞，3000r／ min离心10min；沉淀刚含O．84％氯化铵生理盐水 溶液洗涤3—5min除去红细胞，3000r／min离心10 min；沉淀用生理盐水洗涤2—3次，每次于3ooOr／ miIl离心lomin，收集沉淀即为速殖子，用PBs重悬 速殖子，储存备用。 1-4虫体的计数采用血球计数板对弓形虫进行 计数。计数公式：四大格内弓形虫平均数／4×104 即为每毫升含弓形虫数量。 1．5弓形虫标准阴性肉样的制备购买1．5月龄 小猪隔离饲养，每隔1个月采血1次用弓形虫PAPs 快速诊断试剂和弓形虫间接血凝诊断试剂检测，结 果均为阴性，屠宰后取肉压片镜检为阴性，该猪肉为 标准阴性样品。 1．6弓形虫、新孢于虫Nested-PcR检铡技术 1．6．1 日形虫、新袍子虫速殖子基因组DNA的提 取取记数好的含弓形虫、新孢子虫虫体稀释液，离 心取沉淀加入2mL蛋白酶K缓冲液和蛋白酶K，使 蛋白酶K终浓度200彬mL，50。c水浴3—4h，并 不时摇匀。用ultraPure“基因组DNA快速提取试 剂盒提取虫体DNA。具体步骤如下：取消化后的样 品o．5mL，加入1mLGN结合液，颠倒混匀，将混合 液小心转入离心纯化柱，静置至少3min。13000r／ IIlin离心30s，倒掉收集管中的废液，用o．5mL漂 洗液洗2—3次，13000r／min离心30s，将漂洗完毕 的离心纯化柱再离心1IIlin，彻底去除残留漂洗液， 将离心纯化柱套人一个干净的1．5mL离心管中，开 盖放置2～3111in使漂洗液挥发，加入50uLTE缓冲 液于硅胶膜上，静置2min后13000r／IIlin离心1 IIlin，离心管中收集的液体即是洗脱下来的基因组 DNA，储存备用。 1．6．2Nested．PcR扩增反应用FaqMix代替普通 PcR反应体系中反应bu腩r、dN佃、1铀酶，使加试 剂步骤减少。 依次向PcR反应管中加入灭菌双蒸水19止、2 xThqMix25斗L、50Ⅱ咖L／L外弓I物各l斗L、DNA模 板4灿混匀离心数秒，在PcR仪上反应，94。c预 变性5min，然后94。c50s、60。c40s、72oC45s 共进行30个循环，最后72℃延伸lOmiⅡ，初始PcR 完毕，取反应产物用双蒸水l：500稀释后作为第二 次PcR的DNA模板，在PcR反应管中加入DNA模 板2止灭菌双蒸水9．5止、2×TaqMix12．5止、50 n·m0L，L内引物各l止，按初始PcR反应条件进行 扩增，产物进行琼脂糖电泳观察。 1．7 PcR产物DNA片段的纯化、克隆、重组质粒 的鉴定 以DNA琼脂糖回收试剂盒回收扩增的 DNA片段，将回收的DNA片段按说明书与pGEM- T-easy克隆载体相连，并转化EcD拓JMl09感受态 细胞，然后取转化好的菌液按常规方法涂布于加有 Amp+IP，rG+x·gal的LB固体培养基上，倒置平皿， 37。c温箱中培养16—24h，进行兰白斑筛选。 煮沸法快速检测质粒，挑取几个白色菌落，分别 置于含Amp的4mLLB液体培养基中37oc摇床培 养过夜，取1．5mL置于离心管中4oC12Ooog离 心lmin，去上清，加入350斗L蒸馏水，100℃水浴5 min，同上离心取上清，用内引物为引物对重组质粒 进行PcR鉴定。 1．8测序及序列分析将经PcR鉴定的弓形虫、 新孢子虫基因重组质粒送上海申能博彩生物技术有 限公司测序。并将测出的基因序列与NcBI公布的 弓形虫和新孢子虫的基因序列进行核苷酸的同源性 分析。 1．9 弓形虫和新孢子虫的RFLP酶切鉴定反应 对所测得的序列进行比对分析后，应用DNAm”辅 助软件，分别找到弓形虫和新孢子虫合适的酶切位 点，拟选内切酶。以DNA琼脂糖回收试剂盒回收扩 增的DNA片段，分别对未纯化的Nested-PcR扩增 产物的DNA片段和纯化的DNA片段，进行酶切。 1．10Nested·PcR敏感性实验取记数好的含弓 形虫的小鼠腹水用生理盐水梯度稀释，将稀释液加 入1g弓形虫阴性肉样中，使每克肉样分别含101， 102，103，104，lo’个弓形虫，加入2mL蛋白酶K缓 冲液匀浆，取匀浆液加入白酶K，使蛋白酶K终浓度 200一mL，50。C水浴3～4h，并不时摇匀，取消化 后的混悬液O．5mL，用ultraPLIre俅基因组DNA快速 提取试剂盒提提取弓形虫DNA模板，然后进行Nes— ted．PcR反应。 1．1l№sted·PcR特异性实验以弓形虫和新孢 子虫为阳性对照，采用1．6．1方法分别提隐孢子虫、 鸡艾美尔球虫、牛球虫、锥虫DNA，按同上的条件进 行Nested-PcR反应。电泳分析PcR扩增产物。 2结果 2．1 弓形虫和新孢子虫PcR扩增结果结果见图 万方数据 中国兽医寄生虫病 2脚年11月 l用外引物对弓形虫和新孢子虫模板DNA进行扩 增，均能扩增出一条较亮的DNA条带．长度为80D 一900bp，扩增出新孢子虫DNA片段比弓形虫长， 与预计扩增片段长度相一致。内引物分别对弓形虫 和新孢子虫初始PCR产物的稀释液再进行PCR扩 增，均能扩增出一条DNA条带，长度在400一500bp 之间，新孢子虫DNA条带长度明显大于弓形虫。 匾t弓形虫和新孢子虫内、外弓I物扩增结累 ng．1R嘲№时丘嘣、s咖ⅡdPcR哪plm曲n蚰to DNAfr佃刚er山啪teriak 1．DL—2000DNAMark酣；2．弓形虫外引物扩增产物；3．新 孢子虫外引物扩增产物；4．弓形虫内引物扩增产物；5．新 孢子虫内引物扩增产物；6．空白对熙 1．DL．2000DNAMarker；2．‰砷km驴r出矗mPcR；3． MD^Pom删“，啪I6呲PcR；4．Z，|I，Ph，舯l和蒯融蚰d PcR；5．№；M；∞nfmm‰dPcR；6．ne斟ivecont同 2．2弓形虫和新孢子虫基因重组质粒的PCR鉴定 用内引物进行PcR鉴定，从图2、图3可见：对弓形 虫和新孢子重组质粒用内引物均能扩增出一条长度 在400—500bp之同的DNA片段，表明DNA片段均 已连接到pGEM-T．e8sy载体中组成了新的质粒。 圄2弓形虫基因重组质粒的PcR电津国 M．Marker：1．弓形虫；2．空白对照 Fig．2R因小ofBgaro辨gelelecjrophores量slden吐矗曲6蚰0f 霸，I：孥l聊，；口g肼幽fr洲Ar鲫mbi尬ntpJ酬dby PCR M．Mark盯；1．乃】。Zph脚g帆蹦；2．n。g“veomltml 图3新孢子虫基因重组质粒的PcR电泳田 M．Marl【er：1、2．新孢干虫；3．空白对照 ng．3R酬t0fa驴r岫e粤dekdmpbo啷js坩明“矗曲ti佃0f He惦呻憎calli硼mrDNAre∞mbI蚰眦pl|蚌mjdby PCR M，Mark盯；l、2．服。胖啊埘dn啪；3．“e晷Btive咖州 2．3铡序结果将经过PcR鉴定的刚往克隆产物 送北京奥科生物技术有限公司上海分公司测序，弓 形虫、新孢子虫Nested．PcR扩增DNA片段测序结 果见图4的seql’、seq7’，两者长度分别为433bP、 463bp。 2．4弓形虫和新孢子虫所测基因片段的序列与公 布的相关序列比对seql+为本试验所测的弓形虫 内引物扩增序列，∞q2为r90以i咖incn． AJ628254．1，seq3为zgo础is恤illP．x75453．1， seq4为Z90础istrainRH．x75429．1，seq5为m'椰一 P0m∞nin“m，”q7’为本试验所测的新孢子虫内引物 扩增序列。经比对分析(具体见图4、图5)：seql、 seq2、∞q3、seq4序列同源性较高，达99．1％以上，均 为弓形虫序列，*q5、seq7’同源性较高达97．2％，均 为新孢子虫序列，而弓形虫与新孢子虫同源性为 83．3％～88．8％。 2．5RnJ酶切鉴定反应结果酶切位点分析：经 比对分析，新孢子虫序列在162一168为A．rrAAT， 为V8pl酶切位点，弓形虫相对应位置为ATrCGT， 非该酶酶切位点。 2．5，l 弓形虫和新孢子虫基因片段酶切结果在 PcR离心管中分别加入未纯化和纯化的的Nested— PcR扩增的DNA片段8．0“L，再依次在各管中加 入10xbu‰r2．O¨L、酶Vspl1．O止、灭菌双蒸水 9．0曲，37。C水浴90IIlin，电泳后观察结果，从图6 可见，没有加酶的弓形虫PcR扩增产物只出现一条 带(泳道1)，加Vspl酶的弓形虫PCR扩增产物电 泳后只出现一条带(泳道2)；新孢子虫PcR产物直 接酶切(泳道3、4)出现两条带，新孢子虫PcR产物 万方数据 第15卷第6期 王权等：动物源性食品中弓形虫Ne删·PCRRFLP分子检测技术的建立 三三三』』j!』'三三』_里』-!土二』_星_!{』』1曼j_堡』』』二一；_二=-=二二二-=_=二‘_二_=一=‘_=二_：-=-二‘_=1三一蔓』j_!j』．!—鲁‘邺1耳 FfT-FT：'r=了{_i-若11’—11111气—11—1—-=_=-：_：_=_：_=_='-：-=_=_：-=_=t-!t'_：·—_=1_芒1111’。付血t岫d5刚】 E；；；；：；：；；：：：；：：：：；：：：：；：：；；：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：：；：：：：：；；：盏嚣：：蠢：：仁：；；：：；：；南：：：；：：专南；；：南：；南；；量fnTr订可L『矿可r订下亍F订稠；声南：：：鄙：嚣蕞尝：嚣：： 垃工_!』_￡』_工上工Ik王上_￡—^—一TT【工_!—d^L!—d^k．￡二日⋯㈨⋯Ⅲ⋯-Tc⋯c‘UTc【LI—“^I!上州⋯，cE·’ 三土土三￡三一LtL￡旦一L￡_己王LL￡．三一tL￡_旦_L三三_E_LL生L￡_呈_t生L己LL鞋!_三色生王!_!_毫-=_量￡1生tLL三旦_生=．$“，’‘1卑 二三-三二工三二三三三一!上二三一￡二』』』{_!_￡』上』』上_璺土j立』上-!_￡』-三一!_!{三立三二三三土!二三一111_!_￡』』_￡』三阜“，“ic! zO，” 0)d0 2]10 z0￡0 z050 ：．∞ F●—7c'rr='●，j●·●=1—r2’='。=哔’●}，'。}{■●}；{r7='。，，●●}=’'’，''●!='。7=t_f{{●r‘r7'—r。r7。，一⋯⋯⋯·⋯㈦Tc⋯⋯‘▲^^TcT‘川^^c▲tT⋯‘^)^e^er6⋯j^：T⋯ⅢTT-_捌)nq 21．o 2120 0170 2‘砷 01jo 2一严耳下节丁下=rFi一}rrrfFrfrF产fFi_i_Fr_rFr宁_FFFri『rfrrfrrrrrrrr=-fFFffFfF宇：●?洲tl⋯·(-' 盼；：：：：：：：：：：：；：：：：：：：：：：：：：：；；；：：：：；：：：：；：：：：：：：；：；：：：；：：：：黔船：：臻 口；；：；二；南：：：；由：：：：：；：；：岢：南：怖；；：：：南；：伟：声：：：：；：；南：：南：；；；王三嚣：：：：；：；：：k三!_生!—=型t垃土三￡￡苎_￡_LL生!_￡—!旦⋯U口【￡I吡卫_!旦土划。I!剑一睦』‘旦皇_生L2—§三|8i!型cI王￡_!—!型'r州山恤～·’ 三工三三土二旦_!-三一呈生旦上土生三!_!_旦拿二￡!_旦￡生生王!_譬L￡￡三一呈一!-L生L；二-三王兰三生生三生}三一生王!_王L￡量!—；血j“把! 孔70 21蚰 2170 z：!o 2：jo 2i∞『丁F}r●rf，frfrrf●r亍_r}亍_产rrrrrf=rfrf彳_rr亍-frr，·，rr亍_rr亍_r宁frff亍_=rrr斤圳刚t《¨ 瞻：；：；；；；；：；：；：；；：：：；；：：：；：；：：：；：：：：：：：．．；；：；：：；：；：：；；；：：：：；篙盏警： l⋯三‘?三Ⅲ⋯三·一蛆c⋯⋯⋯7丘⋯^c’^^^一-T▲⋯T6t1土77三⋯^r呲⋯州41tTelt^一17卜二TcT[IT^一IrclBcTr1⋯^T7l‘Icrllllcl^^‘惮^|：T▲T^▲T6T1loTT『cpl^▲r眦恤㈣c●5 I￡．!一f童三】t拄_三一!_￡—!—dt土三Irc【￡三一工_!_!_￡j』j玉—列^l￡_￡!J^l￡!』土刖^1正!』_!_墨_苎_!_至—!—到7王工IcII_王土上王¨‘土亡恤≮·： 川；川川⋯Ⅲ川川⋯Tc▲tcL0▲tTt：Tc^J：⋯^^t#』c▲cfrT‘ccc■”’nq ∞，O 2，00 z，JO z，iO 20：O ：3∞ Frr开百了7F芋_rrr开^1T丁fF订五T下FfF}rFrFfr囊百言r鼻^17rf两1TFF产【——二m。mcdI⋯⋯^●T川⋯⋯⋯r⋯Tr^r⋯⋯⋯⋯’cr^●^t4er●f⋯'1而㈣t1Pd 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产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后观察，结果见图9， NestedPcR能扩增山弓形虫和新孢子虫特定长度 DNA片段。而阴性对照隐孢子虫、柔嫩艾美耳球 虫、猪肉孢子虫、牛球虫、伊氏锥虫，均无扩增条带。 圈6弓形虫和新孢子虫RFLP酶切鉴定反应电泳结果 Fig．6Res螂c6∞map0fRFlLP啪mVspl M：DL广2000M耵妇1：弓形虫PcR产物(不加酶)2：弓形虫 PcR产物(加V8pl酶)3、4：新孢子虫PcR产物(加vspl 酶)5：新孢子虫PcR产物(不加酶) M：DL一2000M础erl：m鲫ivecon砌afz却bm卵捌f 2：，h叩kmgDn矗PcRWjthV叩13、4：№p蝴∞nin啪 PcRwi血V叩15：noganvec哪tml0fNe∞p啪caIIinum 围7新孢子虫RFLP酶切鉴定反应电泳结果 ng．7R嚣t—cdonmapofreo哪bInnIItpIa耵n柚 PGEM．T／18SrRNA’ri恤Vspl M：DL．2000Markerl：％口I咖r4∞耐眦mPcR产物(不加酶不 回收) 2、3、4：m郴pom∞n轨埘lPcR回收产物加Vspl酶切 5、6、7：％口sp硝o∞H打ⅫⅡPcR产物不回收加Vspl酶切 M：DL枷MarI【盯l：ne删"con呻l2、3、4：胁呷omc觚扛 哪PcRwitllV8p15、6、7：M自9妒帆∞砌啪PcRwtihVBpl 3讨论 3．1在对食品中致病性微生物检测中，唯病原学诊 断结果的可信度最高，弓形虫检测当不例外。但是 用传统病原学检测方法检测动物源性食品中弓形虫 存在很大困难，原因在于动物食品样本中往往虫数 围8弓形虫基因扩增敏感性结果 F．g．8R姻uH0fs∞仰d·PcR枷pI墒∞d锄to脚如sM 和础iofdeff啾ntdiIutedde砌ty M．DL_2000Marker；1．10，；2．104；3．103；4．102；5．10 图9弓形虫和新孢子虫基因内引物扩增特异性结果 Fi晷9R鹤llnofN船ted-PCR帅pn五ca虹蚰t0 DNAf唧辨vermmate—aIs M：DL．2000DNAMark盯1．弓形虫2．新孢子虫3．穗孢 子虫4．柔嫩支蔓耳球虫5．牛球虫6．伊氏锥虫7． j9i性对照 M：DL栅DNAMarl【er1．脚km4驴础i2．№oEP0m ∞m心m3．C删ogP∞诚啪4，E枷e池5．Eh矗6， 蜥n哪omⅡerⅥ删7。ne斟ivecontmI 和包囊数不多，常规涂片镜检多为阴性；动物接种方 法不仅费时而且有些弓形虫弱毒株在感染实验动物 小白鼠后并不能在腹水中检测出大量虫体或引起死 亡；体外接种于培养细胞，增虫后再观察，不失为一 种好的替代方法，但可操作性差。此外，弓形虫和新 孢子虫在形态、大小极为相似，并且在牛肉等动物源 性食品可同时存在，这就需要高灵敏度、同时又能区 分两种虫体的新检测技术。 3．2为此，本次试验探索建立了动物源性食品中弓 形虫Nested．PcR检测方法。在GenBank上下载了 弓形虫和新孢子虫的序列．通过BLAsT比较后，发 现弓形虫18sRNA和新孢子虫的同源性非常高，而 rrS区域碱基序列同源性仅为80％，在rrsl利Ⅱs2 区段找出弓形虫和新孢子虫共同具有的保守序列， 万方数据 第15卷第6期 王权等：动物源性食品中弓形虫N鄂ted—PcRRnp分子检测技术的建立 根据引物设计原则，设计出能同时扩增出弓形虫和 新孢子虫DNA片段的引物，再根据内引物之间序列 差异，运用软件找能区别两者基因序列差异酶切位 点，挑选酶进行RFlJ实验，以期建立快速、灵敏、能 区分虫种的Ne咖dPcR．RnP检测方法。对本试验 用的弓形虫和新孢子虫株进行Nested—PcR．扩增 DNA片段经测序及序列分析，结果表明检测的DNA 序列与公布的虫种DNA序列同源性较高，弓形虫和 新孢子虫分别达99．1％、97．2％。而两种虫体DNA 序列差异较大，同源性仅为86．6％，说明通用引物 能有效地扩增出两种虫体的目的DNA片段。PcR 检测弓形虫敏感度与检测样品性质有较大关系， Gucy等”1对弓形虫rDNA的敏感性进行测定，发现 直接扩增一个弓形虫速殖子的裂解液很容易观察到 特异扩增条带，进一步模拟临床样品，将不同稀释度 的速殖子分别与不同量的人成纤维细胞混合后扩 增，结果发现10个速殖子在含量高达105人成纤维 细胞．或1个速殖子在含量达104人成纤维细胞背 景DNA的影响下能检测到特异的弓形虫DNA。本 试验结果可检测到每克肉样l×102个弓形虫水平， 表明此Ne8ted-PcR方法敏感度高比普通PcR高， 但仍可探索从样品采集、模板提取、PcR扩增模板 添加量等因素来提高Nes￡ed-PcR方法检测食品中 弓形虫的灵敏度。特异性试验结果表明该检测方法 能特异地扩增出弓形虫和新孢子虫DNA片段，对其 它原虫则不能。同时仅新孢子虫Ne暑ted-PcR扩增 产物能被Vspl酶切，而弓形虫扩增产物则不能被 Vspl酶切，扩增产物经酶切后电泳观察与仅根据扩 增反应DNA片段长度(新孢子虫比弓形虫长30 bp)比较，更能明确区分弓形虫和新孢子虫。 本试验所建立NestedPCR．RFLP已成功检测弓 形虫弱毒株感染小白鼠的脑、肌肉及宰前血清学刚 性的猪肉中的弓形虫，结果阳性符合率较高，表明 该检测技术具有实际运用价值，具体结果文章另发 表。 参考文献： [1]于思庶，徐秉锟，林继煌，等．弓形虫病学【M1．福州： 福建科学技术出版社，1992：146一156． [2]DeMar髓T，Liddel【s，DubeyJP，“口f．Oralin如c【ion0f calveswith_ⅣP。叩omc研m“州oocy自bhomdo挚： humoralarId册lhlIar1mmuneresponses[J】IntJParasito【， 1999．29(10)：1647一J657 [3]DubeyJ P，Leal}lerscw，Linds町Ds．_ⅣEo叩D旭 侧抑“mJik。p∞Iozoona自90cla把dwtihfataImyeIi如in newbomcaIvesU】．JPamsn01．1989，75(1)：146—148． [4]Dub8yJ P，Lind蛳yDs，AdamsDs，“4tsemlo咖 re5ponseB0fcatrleandotheranimalsinfectedwnh Ne05poHcanjnum口】．AmJVetRes．1996，57(3)：329—336． [5]DubeyJP1Lind5ayDs．A坤viewofⅣBDsPo旭唧加“m andmos”㈨i8口】．Vet陆曲i佃l，1996，67(1)：51—59． [6]Gu8yJM，DubohD，Moren。yMJ，Pf‘正De【ection0f山e p8thogenioparasiLe乃。叩k删口g口H耐fby3妒cmo aⅢpIi血ation0fribosomal坼quence9usmgcomumplex poly眦asechainreactionⅡ]．JclinMierobjoI。1993． 3“2)：203—207． 万方数据 动物源性食品中弓形虫Nested PCR-RFLP分子检测技术的建立 作者： 王权， 王巧全， 潘淑娟， 陈志强， 陈永军， 常小斌， 李健， WANG Quan， WANG Qiao-quan， PAN Shu-juan， CHEN Zhi-qiang， CHEN Yong-jun， CHANG Xiao-bin， LI Jian 作者单位： 王权,陈永军,WANG Quan,CHEN Yong-jun(中国农业科学院上海兽医研究所,上海,200232)， 王巧全,李健,WANG Qiao-quan,LI Jian(上海出入境检验检疫局,上海,200135)， 潘淑娟 ,PAN Shu-juan(上海市青浦区动物疾病控制中心,上海,201700)， 陈志强,常小斌,CHEN Zhi-qiang,CHANG Xiao-bin(湖南农业大学,长沙,410128) 刊名： 中国兽医寄生虫病 英文刊名： CHINESE JOURNAL OF VETERINARY PARASITOLOGY 年，卷(期)： 2007,15(6) 被引用次数： 2次 参考文献(6条) 1.Guay J M;Dubois D;Morency M J Detection of the pathogenic parasite Toxoplasma gondii by specific amplification of ribosomal sequences using comultiplex polymerase chain reaction 1993(02) 2.Dubey J P;Lindsay D S A review of Neospora caninum and neosporosis 1996(01) 3.Dubey J P;Lindsay D S;Adams D S Serologic responses of cattle and other animals infected with Neospora caninum[外文期刊] 1996(03) 4.Dubey J P;Leathers C W;Lindsay D S Neospora caninum-like protozoon associated wtih fatal myelitis in newborn calves 1989(01) 5.De Marez T;Liddell S;Dubey J P Oral infection of calves with Neospora caninum oocysts from dogs:humoral and cellular immune responses[外文期刊] 1999(10) 6.于恩庶;徐秉锟;林继煌 弓形虫病学 1992 引证文献(2条) 1.陈永军.王权.蒋蔚.刘迎春.荆振宇.闫叶娜 上海市猪弓形虫流行病学调查[期刊论文]-中国动物传染病学报 2010(5) 2.龚国华.周锦萍.孙泉云.刘佩红.王权 上海市宠物门诊犬弓形虫病流行病学调查[期刊论文]-中国动物传染病学报 2009(4) 本文链接：http://d.g.wanfangdata.com.cn/Periodical_zgsyjscb200706001.aspx