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利用磁性细胞分选技术阴性选择法分离外周血嗜酸性粒细胞

2012-05-18 4页 pdf 164KB 43阅读

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利用磁性细胞分选技术阴性选择法分离外周血嗜酸性粒细胞 利用磁性细胞分选技术阴性选择法分离外周血嗜酸性粒细胞 李一荣 吴健民 (同济医科大学附属协和医院检验科,武汉 430022) 邹 萍 (同济医科大学附属协和医院血液科,武汉 430022) 中国图书分类号 R392. 33 摘 要 目的:从健康献血者和哮喘等变态反应性疾病病人的外周血中分离出高纯度、高存活率的嗜酸性粒细胞。方 法:采用磁性细胞分选技术的阴性选择法分离外周血嗜酸性粒细胞,并检测分离后嗜酸性粒细胞的纯度、存活率, 计算其回收 率。结果: ¹ 健康献血者外周血嗜酸性粒细胞的回收率为69. 7% ? ...
利用磁性细胞分选技术阴性选择法分离外周血嗜酸性粒细胞
利用磁性细胞分选技术阴性选择法分离外周血嗜酸性粒细胞 李一荣 吴健民 (同济医科大学附属协和医院检验科,武汉 430022) 邹 萍 (同济医科大学附属协和医院血液科,武汉 430022) 中国图书分类号 R392. 33 摘 要 目的:从健康献血者和哮喘等变态反应性疾病病人的外周血中分离出高纯度、高存活率的嗜酸性粒细胞。方 法:采用磁性细胞分选技术的阴性选择法分离外周血嗜酸性粒细胞,并检测分离后嗜酸性粒细胞的纯度、存活率, 计算其回收 率。结果: ¹ 健康献血者外周血嗜酸性粒细胞的回收率为69. 7% ? 6. 8% , 存活率 95. 4% ? 1. 8% , 纯度为 90. 7% ? 4. 3% ; º 哮 喘等变态反应性疾病病人外周血嗜酸性粒细胞的回收率为 60. 4% ? 5. 4% ,存活率为 96. 1% ? 0. 7% , 纯度为 92. 6% ? 5. 1%。 结论:采用磁性细胞分选技术的阴性选择法, 能从外周血中分离出高纯度、高存活率的嗜酸性粒细胞, 因此该方法是一种高效 的分离外周血嗜酸性粒细胞的免疫学方法。 关键词 磁性微球 哮喘 嗜酸性粒细胞 Isolation of eosinophils from peripheral blood by the negative selection procedure of magnetic activated cell sorting LI Yi-Rong, WUJian-Min, ZOU Ping .Laboratory Department , UnionHospital , Tong Ji Medical University ,Wuhan, 430022 Abstract Objective: To isolate eosinophils of high purity and viability from peripheral blood of healthy donors and patients with allergic disease( such as asthma) . Methods: Eosinophils of peripheral blood were isolated by the negative selection procedure of magnetic activated cell sorting and their purity and the ratio of viability and recovery were assessed. Results: ( 1) The purity and the ratio of viability and recovery of eosinophils from healthy donors were 90. 7% ? 4. 3% , 95. 4% ? 1. 8% and 69. 7% ? 6. 8% respectively. ( 2) The purity and the ratio of via- bility and recovery of eosinophils form patients with allergic disease ( such as asthma) were 92. 6% ? 5. 1% , 96. 1% ? 0. 7% and 60. 4% ? 5. 4% respectively. Conclusion: By the negative selection procedure of magnetic activated cell sorting, eosinophils of high purity and viability were acquired from peripheral blood. So the procedure is a highly effective immunolog ical method which used to isolate eosinophils. Key words Magnetic microbead Asthma Eosinophil 长期以来, 嗜酸性粒细胞的分离多采用不连续 的密度梯度离心法,但是由于外周血中嗜酸性粒细 胞的含量较少, 约为白细胞的 0. 5% ~ 5% , 而且其 密度范围与中性粒细胞部分重叠,因此高度纯化外 周血中嗜酸性粒细胞有一定的难度。1979年, Vadas 采用高渗的Metrizamide进行密度梯度离心分离外周 血中嗜酸性粒细胞[ 1] , 随后 Gartner 将高渗的 Metr-i zamide换成等渗 Percoll液分离外周血嗜酸性粒细 胞[ 2] ,尽管能够达到一定的纯度和回收率, 但是Me- trizamide法要求外周血中的嗜酸性粒细胞数至少为 白细胞的 2%, 且易造成嗜酸性粒细胞的皱缩, 而 Percoll法更是要求嗜酸性粒细胞至少为外周血白细 胞的 4%, 因此采用以上 2种不连续的密度梯度离 心法很难从正常人群中分离出大量的高纯度嗜酸性 粒细胞。我们采用磁性细胞分选技术阴性选择法分 离外周血嗜酸性粒细胞, 获得较好的效果。 作者简介:李一荣,男, 29岁,硕士,主要从事临床免疫学的检验工作 1 材料与方法 111 试剂 磁性微球,武汉工业大学与本校免疫教 研室共同研制,球形,表面功能基团为羧基;鼠抗人 CD16单克隆抗体, 北京邦定生物医学公司生产, 与 人中性粒细胞表面 CD16 特异结合; Percoll贮存液, Pharmacia公司生产,密度 1. 13 ? 0. 001, 根据有关文 献配成密度为 1. 083的 Percoll应用液 [3, 4] ; 乙醇胺, 郑州市化学试剂三厂生产,用以封闭磁性微球余下 的活性基团; SPA(葡萄球菌 A蛋白) ,上海生物制品 研究所生产, 与单克隆抗体 Fc 段有强结合力; FCS (胎牛血清) ,中德三利生物制品厂生产;异硫氰基荧 光黄( FITC)标记的羊抗鼠 IgG抗体, 上海生物制品 研究所生产。 112 器材 自制 MACS ( Magnetic Activated Cell Sorter,磁性细胞分选仪) ,由武汉冶金研究所与本科 共同研制,主要由永久磁场(磁场强度为 0. 54特斯 拉)和分离柱组成,分离柱内含不锈钢丝绒,提供细 #423#李一荣等 利用磁性细胞分选技术阴性选择法分离外周血嗜酸性粒细胞 第 8期 胞停留的表面及强磁场, 便于细胞的分离;低温冷冻 离心机:美国贝克曼公司生产; CELL-DYN3500血细 胞计数仪:美国雅培公司生产;荧光显微镜: 日本奥 林巴斯公司生产。 113 标本 健康献血者 28 例, 外周血嗜酸性粒细 胞计数( 0. 05 @ 109~ 0. 40 @ 109 ) L- 1。哮喘等各种 变态反应性疾病病人 21例, 外周血嗜酸性粒细胞计 数( 0. 5 @ 109~ 1. 78 @ 109 ) L- 1。 114 方法 11411 磁性微球的标记 空白磁性微球悬液,加入 等体积的 SPA 溶液, 4 e 过夜孵育, 不断振摇, 用磁 场收集磁性微球,加 5倍体积乙醇胺溶液( 1 molPL、 pH= 8. 0) , 室温放置1 h, 不断振摇,用以封闭磁性微 球余下的活性基团。然后用 PBS洗涤, 加入鼠抗人 CD16单克隆抗体, 4 e 孵育 1 h, PBS洗涤,然后配成 一定浓度的鼠抗人 CD16单克隆抗体标记的免疫磁 性微球( Immunomagnet ic Microbeads, IMB) , 4 e 无菌保 存。 11412 外周血粒细胞的分离 静脉血 20 ml, 肝素 钠抗凝, 用 CELL-DYN3500血细胞计数仪进行细胞 分类计数, PBS对倍稀释, 置于 20 ml的 Percoll应用 液上, 1000 g 离心 30 min, 保留红细胞、粒细胞层。 加入 5倍体积冰冷的 155 mmolPL NH4Cl溶液, 0 e 冰 浴15 min,用冰冷的 PBS(含 2% FCS)洗涤粒细胞 2 次, 4 e 离心 7 min( 400 g) , 保留 10 Ll沉淀, 加入 90 Ll冰冷的PBS(含 2%FCS) , 冰浴保存。 11413 嗜酸性粒细胞的分离 将免疫磁性微球与 已分离的粒细胞悬液混合(免疫磁性微球数B细胞总 数= 20B1) , 4 e 孵育1 h。然后加入冰冷的 PBS 4 ml (含2% FCS) , 并将液体转移至自制 MACS 的分离 柱,用 50 ml的刻度试管收集过柱液, 再次加入冰冷 的PBS 32 ml(含 2%FCS) ,收集过柱液, 400 g 离心 7 min, 用CELL-DYN3500血细胞计数仪对嗜酸性粒细 胞进行计数,并进行瑞氏染色和台盼蓝染色, 计算分 离的嗜酸性粒细胞的纯度、存活率与回收率。 11414 残留CD16+ 的细胞的检测 将分离后的细 胞用PBS(含 2%FCS)悬浮,使细胞浓度2 @ 106 ml- 1 , 取100 Ll的细胞悬液于试管中,加入 20 Ll的鼠抗人 CD16单克隆抗体,混匀后 4 e 孵育 1 h, 然后用 PBS (含2% FCS)洗涤 3次, 4 e 离心 7 min( 400 g ) , 保留 约50 Ll液体,再加入 20 Ll的 FITC 标记的羊抗鼠 IgG抗体,混匀后孵育、洗涤、离心(条件同前) , 保留 少许液体于试管中,混匀, 吸一滴于玻片上, 加盖玻 片,用荧光显微镜计数产生特异性荧光的细胞,并用 普通光源计数细胞总数,计算两者的比率(即为残留 的CD16+ 的细胞比率)。 2 结果 211 由于CD16存在中性粒细胞表面, 而不存在于 嗜酸性粒细胞及嗜碱性粒细胞表面, 因此中性粒细 胞与鼠抗人 CD16单克隆抗体标记的 IMB结合 (见 图 1、2) , 而嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞则不与该 IMB结合,能自由通过自制的MACS的分离柱,由于 嗜碱性粒细胞在正常人及哮喘等变态反应性疾病人 外周血含量极少, 故分离后的细胞绝大部分为嗜酸 性粒细胞(见图 3)。 212 健康献血者(简称健康组)外周血嗜酸性粒细 胞的分离前后通过 CELL-DYN 3500计数嗜酸性粒细 胞,发现嗜酸性粒细胞的回收率为 69. 7% ? 6. 8%, 台盼蓝染色示细胞存活率为 95. 4% ? 1. 8%, 瑞氏 染色发现嗜酸性粒细胞的纯度为90. 7% ? 4. 3%,残 图 1 粒细胞与 IMB的结合(瑞氏染色@ 400) Fig. 1 The combination of granule cell( Wright stain@ 400) 图 2 粒细胞与 IMB的结合(瑞氏染色@ 1000) Fig. 2 The combination of granule cell( Wright stain@ 1000) #424# 中国免疫学杂志 2000年第 16卷 图 3 分离后的嗜酸性粒细胞(瑞氏染色@ 1 000) Fig. 3 The eosinophils after isolation ( Wright stain@ 1 000) 表 1 外周血嗜酸性粒细胞分离结果( x ? s) Tab. 1 The results of isolating eosinophil from peripheral blood( x ? s) Group n Recoverh Viability( %) Purity( % ) CD16+ cell( % ) Healty 28 69. 7 ? 6. 8 95. 4 ? 1. 8 90. 7? 4. 3 8. 8? 3. 9 Asthma 21 60. 4 ? 5. 4 96. 1 ? 0. 7 92. 6? 5. 1 6. 5? 4. 7 留CD 16+ 的细胞的比率为 8. 8% ? 3. 9%,详见表 1。 213 哮喘等变态反应性疾病病人外周血嗜酸性粒 细 胞 的 回 收 率 为 60. 4% ? 5. 4% , 存 活 率 为 96. 1% ? 0. 7% ,纯度为92. 6% ? 5. 1% ,残留 CD 16+ 的细胞的比率为 6. 5% ? 4. 7% ,详见表 1。 3 讨论 磁性细胞分选技术是本世纪 80年代发展起来 的一种高效的细胞分离方法, 在国外已广泛用于细 胞分离, 如 CD4、CD8、CD34等[ 5-7] , 但是由于磁性细 胞分选技术所需试剂价格较贵, 国内目前尚未普遍 开展, 其主要原理是通过特异性单克隆抗体对细胞 表面抗原的特异性识别, 将偶联在抗体上的磁性微 球标记在细胞上, 从而将细胞进行分离。磁性细胞 分选技术的阴性选择法是将非目的细胞带上特异性 单克隆抗体标记的磁性微球, 收集未标记细胞。 本研究采用磁性细胞分选技术的阴性选择法分 离外周血嗜酸性粒细胞,包括 4个步骤: 首先, 通过 SPA将鼠抗人 CD16的单克隆抗体与磁性微球偶联, 制备免疫磁性微球,这是因为 SPA 不仅能通过其氨 基与磁性微球的羧基缩合, 而且与特异性单克隆抗 体的 Fc 段有强结合力却不影响该抗体的活性; 其 次,用密度为 1. 083的 Percoll应用液去除单个核细 胞,保留富含红细胞、粒细胞层; 其次用 155 mmolPL 的 NH4Cl溶液裂解红细胞, 得到粒细胞悬液;最后将 鼠抗人 CD16的单克隆抗体标记的免疫磁性微球与 粒细胞孵育,通过自制的MACS的分离柱,采用阴性 选择法分离嗜酸性粒细胞。结果发现, ¹ 健康献血 者外周血嗜酸性粒细胞的回收率为69. 7% ? 6. 8%, 存活率为95. 4% ? 1. 8%, 纯度为90. 7% ? 4. 3%, 残 留 CD 16+ 的细胞的比率为8. 8% ? 3. 9% ; º哮喘等 变态反应性疾病病人外周血嗜酸性粒细胞的回收率 为60. 4% ? 5. 4% ,存活率为96. 1% ? 0. 7%, 纯度为 92. 6% ? 5. 1%, 残留 CD 16+ 的细胞的比率为 6. 5% ? 4. 7%。以上结果表明: ¹此方法能成功地分 离正常人以及高嗜酸性粒细胞血症病人嗜酸性粒细 胞,这是其它几种方法所不能比拟的。如使用 Per- coll液的不连续密度梯度离心法要求外周血中嗜酸 性粒细胞至少为白细胞的 4%, 而 Metrizamide 法则 要求嗜酸性粒细胞的比率大于 2%。º 具有较高的 灵敏度和特异性。尽管分离后含有少量的 CD 16+ 的中性粒细胞,但本研究结果基本接近于国外的报 道,Hanse 报道利用 Dynal 磁性微球分离的纯度> 95% [ 8, 9] ,回收率约为 60%, 而利用MACS磁性微球 分离的纯度则为 99. 5% ? 0. 1%, 回收率高达 80%。 »存活率高, 有利于嗜酸性粒细胞的培养与功能研 究。¼不影响嗜酸性粒细胞的功能, 尽管目前已有 文献报道,采用磁性细胞分选技术会影响细胞的功 能,但是影响仅限于阳性选择分离的细胞 [6, 10] ,而阴 性选择的细胞目前还未见此方面的报道, 而研究分 离嗜酸性粒细胞采用了阴性选择法, 故不会影响嗜 酸性粒细胞的功能。 通过以上分析可看出,磁性细胞分选技术阴性 选择法, 是一种高效率的外周血嗜酸性粒细胞的分 离方法, 为其后嗜酸性粒细胞的功能研究提供了有 利的基础,而且本实验利用国产磁性微球分离嗜酸 性粒细胞, 其效果接近于采用 Dynal 磁性微球和 MACS磁性微球, 为国内广泛开展磁性细胞分选技 术提供了一定的理论与实践基础。 4 参考文献 1 Vadas M A, David J R, Butterworth A et al . A new method for purifica- tion of human neutrophils and eosinophils. J Immunol, 1979; 122: 1228 2 Gartner I. Seperation of human eosinophils in density gradients of polyv-i nylpyrrolidone-coated silica gel( Percoll ) . Immunology, 1980; 40: 133 3 Szucs S,Varga C, Ember I et al . The seperat ion of the granulocytes from different rat strains. J Immunol Methods, 1994; 167: 245 (下转第 427页) #425#李一荣等 利用磁性细胞分选技术阴性选择法分离外周血嗜酸性粒细胞 第 8期 2 结果 RT-PCR 反应后在有wtp53转染的 DU145 细胞 中有一特异性的 PCR产物,长度为 1 124 bp,说明转 染DU145细胞后, wtp53仍稳定地存在于 wtp53重组 体中。免疫组化可见胞浆中有 wtp53基因产物, 而 对照组则没有。说明 p53可稳定地表达于DU145细 胞中。 3 讨论 p53基因定位于人类 17号染色体短臂 1 区内, 全长约 20 kb, 由 11 个外显子和 10 个内含子组 成[ 3]。p53基因转录产生约 2 kb mRNA, 编码一个 393个氨基酸的蛋白, 分子量为 53 kD[4] ,本研究用 RT-PCR技术将 p53基因起始密码子与终止密码子 之间 cDNA序列扩增出来, 重组到真核表达载体 pC- MV中,并在 DU145细胞中得到了稳定表达。 目前用于转染外源基因的真核表达载体主要包 括逆转录病毒载体, 腺病毒载体和脂质体载体。一 个有效的基因转移载体主要特征是: ¹ 靶细胞的特 异性,即载体只作用于某一特定细胞; º 转染的高效 性; » 基因表达的持续性; ¼载体的安全性; ½生产 过程和使用的简单性; ¾费用低廉。与其它两种载 体相比,脂质体载体具有第一条以外的全部优点, 且 这一缺陷可通过基因疫苗在体内的局部注射而得以 弥补。 p53基因为抑癌基因, 已有研究表明, 携带有野 生型 p53基因的腺病毒载体, 可抑制前列腺癌 Tsu- Pr1、PCm-3、C4-3、DU145等细胞系的生长, 并诱导其 调亡,而体内研究表明, p53可以有效地抑制在裸鼠 中 C4-2 前列腺癌的生长和 PSA 的产生 [5] 。本研究 所制备的野生型 p53基因脂质体转染的核酸疫苗, 较之已有的表达系统有一定的优势, 为前列腺癌的 基因治疗打下了基础。 4 参考文献 1 Michalovity, Halevy O, Oren M et al . p53 mutotion: gains or losses? J Cell Biochem, 1991; 45: 22 2 Janice DeMoor, Mark Vincent , Olga Collins.Antisense nucleic acids tar- geted to the thymidylate synthase( TS) mRNA translat ion start sit e st imu- late TS cebe transcription. Experimental Cell Research, 1998; 243: 11 3 Lamb P, Crawford L. Characterixation of the human p53 gene. Mol Cell Biol, 1986; 6: 1379 4 Levine A J, Momand J, Finlay C A et al . The p53 tumor suppressor gene. Nature, 1991; 351: 453 5 黄 俊,王立明 1 前列腺癌基因治疗的研究现状 1 国外医学#泌 尿系统分册, 1997; 17( 3) : 195 [收稿 1999-10-14 修回 2000-04-11] (编辑 张 慧) (上接第 425 页) 4 Scriba A,Luciano L, Steiniger B.High-yield purif ication of rat monocytes by combined density gradient and immunomagnetic separation. J Immunol Methods, 1996; 189: 203 5 Semple J W, Allen D, Chang W et al . Rapid separat ion of CD4+ and CD19+ lymphocyte populat ions from human peripheral blood by a Magnetic Act ivated Cell Sorter( MACS) . Cytometry, 1993; 14: 955 6 Stanciu L A, Shute J,Holgate S T et al . Production of IL-8 and IL-4 by positively and negatively selected CD4+ and CD8+ humanT cells follow- ing a four-step cell separat ion method including magnetic cel l sort ing ( MACS) . J Immunol Methods, 1996; 189: 107 7 Silvest ri F, Banavali S, Yin M et al . CD34 positive cell select ion by im- munomagnetic beads and chymopapain.Haematologica, 1992; 77: 307 8 Hansel T T, Pound J D, Pilling D et al . Purif ication of human blood eos-i nophils by negative selection using immunomagnetic beads. J Immunol Methods, 1989; 122: 97 9 Hansel T T, De Vries I J M , Iff T et al . An improved immunomagnetic procedure for the isolation of highly purif ied human blood eosinophils. J Immunol Methods, 1991; 145: 105 10 Rubbi C P, Patel D, Rickwood D. Evidence of surface antigan detachment during incubation of cel ls with immunomagnetic beads. J Immunol Meth- ods, 1993; 166: 233 [收稿 1999-09-31 修回 1999-12-22] (编辑 徐 杰) #427#孔祥波等 野生型 p53基因脂质体转染细胞疫苗的制备 第 8期
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