基于G-四分体结构的DNA酶传感器电化学检测凝血酶

第 37卷 2009年 10月 分析化学 (FENⅪ HUAXUE) Chinese Journal ofAnalytical Chemistry 增刊 F011 基于 G．四分体结构的DNA酶传感器电化学检测凝血酶 沈碧君 王 琪 程圭芳 何品刚 方禹之 (华东师范大学化学系，上海 200062) 1990年以来，通过体外筛选和 selex技术发现了具有催化性能的DNA酶。其中被广泛研究的一种 特定的DNA酶为富含 G碱基的 DNA序列与卟啉铁(hemin)结合形成的具有 G一四分体结构的酶。由于 该酶表现的催化能力远比游离的Hemin强⋯，因此，这种新型的DNA酶被广泛作为生物传感器应用于 DNA，重金属离子的比色和化学发光检测中l引。 凝血酶的 Aptamer是一段富含 G碱基的寡聚核苷酸序列，其与 hemin形成的 DNA酶，结合凝血 酶后，G．四分体结构更加牢固，表现出强的催化活性而被用于比色法检测凝血酶I2J。本文基于 aptamer 与thrombin形成的稳固的G一四分体能催化氧化双氧水的性质，构建了电化学催化检测凝血酶的方法。 实验证明，本文对凝血酶的浓度监测能达到 6x10。 mol／L，低于相关文献，灵敏度更好。 DNA 序列(5'-HS．(CH2)6GGTTGGTGTGGTTGG．3’)；凝血酶(Thrombin)；卟啉铁(Hemin)；30％ H2O2；三羟甲基氨基甲烷盐酸盐(Tris—HC1)；二甲亚砜(DMSO)；巯基己醇(MCH)；曲拉通 X一100。电 化学工作站 660c和 832；三电极体系(金电极，Ag／AgCI参比电极，Pt对电极)。 金电极经过打磨和超声处理后，表面经氮气吹干于 200 mmol／L Tris—HCI(pH=7．4)0．1 gmol／L aptamer溶液中，4。C组装 16 h。洗涤之后MCH占位 2 h。电极经过再次洗涤后经 hemin(0．5 gmol／L) 培养 l h(25 mmol／L HEPES，pH=7．4，20mmol／L KC1，200mmol／L NaCI，0．05％(wIv)TritonX-100 and 1％(v／ DMSO)。得到的电极再浸入不同浓度的 Thrombin溶液中进行 37。C 培育 0．5 h(pH--7．4 Tris．HCI，140 mmol／L NaC1，5 mmol／L KC1，l mmol／L CaC12，l mmol／L MgC12)。 待测电极置于预先通氮气 30min 的一定浓度的双氧水的电解质溶液中(10 mmol／L HEPES，pH = 8．0，50 mmol／L NaC1，CH 。：一1．8gmol／L)在 0．2～0．7 V(vs．Ag／AgCI)的电压范围，扫速 0．1 V／s进行 电化学循环伏安检测。 将一定量的H2O2加入到除氧的0．01 mol／L的HEPES溶液中，与溶液中不存在H2O2时的循环伏安 曲线发生了明显的改变。其中还原峰庐 一0．380 V，这是 Fe山／Fe儿氧化还原过程的典型特征，并且电流 随着H 0 的浓度的增加，氧化峰电流明显减小。直到溶液中双氧水的浓度达到7．2~tmol／L时，还原峰 电流不再增加，说明 DNA酶已经成功固定在电极表面，并对 H：O：有电化学催化还原作用pJ。当电极 表面修饰不同浓度的凝血酶时，电极在相同浓度 1．8~mol／L H O2溶液中的催化能力不同，其得到的酶 在尺=一0．380 V处的峰电流随着凝血酶的浓度的增加而增加，并在浓度为 10-10_104 mol／L范围内呈现 良好的线性关系。线性方程为：y=13．6764+1．1846x，R =0．9890，检出限达到 6~10 mol／L。 References 1 Breaker R R．Chem．Rev．，1997，97(22)：371-390 2 Tao Li，Erkang Wang，et a1．Chem．Comm．，2008，3 1：3654～3656 3 Ronen Polsky，et al Langmuir，20o7，23(2)：364-366