蛋白质1

null第三章 蛋白质第三章 蛋白质蛋白质存在于所有的生物细胞中，是构成生物体最基本的结构物质和功能物质。 蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。null早在1878年，思格斯就在《反杜林论》中指出：“生命是蛋白体的存在方式，这种存在方式本质上就在于这些蛋白体的化学组成部分的不断的自我更新。” 可以看出，第一，蛋白体是生命的物质基础；第二，生命是物质运动的特殊形式，是蛋白体的存在方式；第三，这种存在方式的本质就是蛋白体与其外部自然界不断的新陈代谢。 现代生物化学的实践完全证实并发展了恩格斯的论断。null木瓜蛋白酶（组织蛋白酶） 第一节 蛋白质通论 第一节 蛋白质通论一、蛋白质的化学组成与分类 蛋白质是一类含氮有机化合物，除含有碳、氢、氧外，还有氮和少量的硫。某些蛋白质还含有其他一些元素，主要是磷、铁、碘、碘、锌和铜等。这些元素在蛋白质中的组成百分比约为： 碳 50％ 氢 7％ 氧 23％ 氮 16% 硫 0—3％ 其他 微量null氮占生物组织中所有含氮物质的绝大部分。因此，可以将生物组织的含氮量近似地看作蛋白质的含氮量。由于大多数蛋白质的含氮量接近于16%，所以，可以根据生物样品中的含氮量来计算蛋白质的大概含量： 蛋白质含量（克%）=每克生物样品中含氮的克数  6.25 凯氏定氮法测定的基础蛋白质的分类蛋白质的分类(1) 依据蛋白质的外形分类 按照蛋白质的外形可分为球状蛋白质和纤维状蛋白质。 球状蛋白质：globular protein外形接近球形或椭圆形，溶解性较好，能形成结晶，大多数蛋白质属于这一类。 纤维状蛋白质：fibrous protein分子类似纤维或细棒。它又可分为可溶性纤维状蛋白质和不溶性纤维状蛋白质。（2）依据蛋白质的组成分类（2）依据蛋白质的组成分类按照蛋白质的组成，可以分为 简单蛋白(simple protein) 结合蛋白(conjugated protein) 简单蛋白又称为单纯蛋白质；这类蛋白质只含由-氨基酸组成的肽链，不含其它成分。 1，清蛋白和球蛋白：albumin and globulin广泛存在于动物组织中。清蛋白易溶于水，球蛋白微溶于水，易溶于稀酸中。 2，谷蛋白(glutelin)和醇溶谷蛋白(prolamin)：植物蛋白，不溶于水，易溶于稀酸、稀碱中，后者可溶于70－80％乙醇中。 3，精蛋白和组蛋白：碱性蛋白质，存在与细胞核中。 4，硬蛋白：存在于各种软骨、腱、毛、发、丝等组织中，分为角蛋白、胶原蛋白、弹性蛋白和丝蛋白。 简单蛋白结合蛋白结合蛋白由简单蛋白与其它非蛋白成分（辅基）结合而成 色蛋白：由简单蛋白与色素物质结合而成。如血红蛋白、叶绿蛋白和细胞色素等。 糖蛋白：由简单蛋白与糖类物质组成。如细胞膜中的糖蛋白等。 脂蛋白：由简单蛋白与脂类结合而成。 如血清-，-脂蛋白等。 核蛋白：由简单蛋白与核酸结合而成。如细胞核中的核糖核蛋白等。null（3）按功能的蛋白质分类法 酶类, 占细胞内蛋白质种类的绝大部分 运输蛋白, 如albumin, hemoglobin, transferrin等 收缩运动蛋白, 如actin, myosin, tubolin等 激素蛋白, 如insulin, growth hormone等 细胞激动素(cytokinin), 如EGF, PDGF, IL-2等 受体蛋白, 如insulin receptor, rhodopsin等 毒素蛋白, 如cholera toxin, ricin, pertussis t. 营养贮藏蛋白, 如prolamine, glutelin等 防御蛋白, 如IgG等 结构蛋白, 如keratin, collagen等二、蛋白质的大小与分子量二、蛋白质的大小与分子量蛋白质是分子量很大的生物分子。对任一种给定的蛋白质来说，它的所有分子在氨基酸的组成和顺序以及肽链的长度方面都应该是相同的，即所谓均一的蛋白质。 蛋白质分子量变化范围很大，从6000-1000000道尔顿以上null蛋白质分子量的上下限是人为规定的，因为这决定于蛋白质和分子量概念的定义。 某些蛋白质是由两个或更多个蛋白质亚基(多肽链)通过非共价结合而成的，称寡聚蛋白质。有些寡聚蛋白质的分子量可高达数百万甚至数千万。三、蛋白质的构象三、蛋白质的构象对于不含辅基的简单蛋白质，用110除它的分子量可大略估计氨基酸残基的数目。 蛋白质分子是由氨基酸首尾相连而成的共价多肽链 每种天然蛋白质都有自己特有的空间结构，这种空间结构叫蛋白质的构象 球状蛋白、纤维状蛋白null一级结构：多肽链共价主键的氨基酸顺序 二级结构：多肽链借助氢键排列成沿一维方向具有周期性结构的构象，如α-螺旋、β-折叠。 三级结构：多肽链借助各种次级键盘绕成具有特定肽链走向的紧密构象。 四级结构：寡聚蛋白中各亚基之间在空间上的相互关系或结合方式。 第二节 蛋白质的基本结构单位—氨基酸第二节 蛋白质的基本结构单位—氨基酸一、蛋白质的水解一、蛋白质的水解蛋白质和多肽的肽键与一般的酰胺键一样可以被酸碱或蛋白酶催化水解，酸或碱能够将多肽完全水解，酶水解一般是部分水解. 多肽是由氨基酸以酰胺键形式连接而成的线性大分子。它在生物体内可以单独存在，但是更多的则是作为蛋白质的组成部分。蛋白质是由一个或多个多肽链通过共价键（主要是二硫键）或非共价力结合而成。应用化学或物理，可以将蛋白质拆分成多肽组分。null完全水解得到各种氨基酸的混合物，部分水解通常得到多肽片段。最后得到各种氨基酸的混合物。 所以，氨基酸是蛋白质的基本结构单元。 大多数的蛋白质都是由20种氨基酸组成。这20种氨基酸被称为基本氨基酸。 酸水解酸水解常用6 mol/L的盐酸或4 mol/L的硫酸在105-110℃条件下进行水解，反应时间约20小时。 此法的优点是不容易引起水解产物的消旋化。缺点是色氨酸被沸酸完全破坏； 含有羟基的氨基酸如丝氨酸或苏氨酸有一小部分被分解；天冬酰胺和谷氨酰胺侧链的酰胺基被水解成了羧基。碱水解碱水解一般用5 mol/L氢氧化钠煮沸10-20小时。 由于水解过程中许多氨基酸都受到不同程度的破坏，产率不高。 部分的水解产物发生消旋化。 该法的优点是色氨酸在水解中不受破坏。酶水解酶水解目前用于蛋白质肽链断裂的蛋白水解酶（proteolytic enzyme）或称蛋白酶（proteinase）已有十多种。 应用酶水解多肽不会破坏氨基酸，也不会发生消旋化。水解的产物为较小的肽段。 最常见的蛋白水解酶有以下几种：nullTrypsin ：R1=赖氨酸Lys和精氨酸Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。肽链水解位点胰蛋白酶null或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu，蛋氨酸Met和组氨酸His水解稍慢。肽链水解位点糜蛋白酶nullPepsin：R1和R2＝R1=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu以及其它疏水性氨基酸水解速度较快。肽链水解位点胃蛋白酶nullthermolysin)：R2=苯丙氨酸Phe,色氨酸Trp,酪氨酸Tyr; 亮氨酸Leu，异亮氨酸Ileu,蛋氨酸Met以及其它疏水性强的氨基酸水解速度较快。肽链水解位点嗜热菌蛋白酶null分别从肽链羧基端和氨基端水解 肽链水解位点羧肽酶和氨肽酶二、氨基酸的分类 常见氨基酸20种，称为蛋白质氨基酸 （一）常见的蛋白质氨基酸 除脯氨酸外，都是α-氨基酸 除甘氨酸外，都有旋光性 氨基酸的名称都用三字母和单字母简写表示二、氨基酸的分类 常见氨基酸20种，称为蛋白质氨基酸 （一）常见的蛋白质氨基酸 除脯氨酸外，都是α-氨基酸 除甘氨酸外，都有旋光性 氨基酸的名称都用三字母和单字母简写表示nullL-氨基酸的基本结构二十种氨基酸除Gly外全是L-型。残基：在肽链中每个氨基酸都脱去一个水分子，脱水后的残余部分叫残基（residue), 因此蛋白质肽链中的氨基酸统统是残基形式。COOHH2NHCRα碳原子,不对称碳原子侧链null二十种氨基酸的化学结构要求全部背出null氨基酸分类（按R化学结构）1.脂肪族 含一氨基一羧基的中性氨基酸：甘、丙、缬、亮、异亮 含羟基的氨基酸：丝、苏 含硫氨基酸：半胱、甲硫 含酰胺基氨基酸：天冬酰胺、谷氨酰胺 含一氨基二羧基的酸性氨基酸：天冬氨酸、谷氨酸 含二氨基一羧基的碱性氨基酸：赖、精 2.芳香族：苯丙、酪 3.杂环类：色、组、脯null氨基酸分类（按R极性） 非极性不带电 极性不带电 极性正电 极性负电null甘氨酸 glycine Gly G 5.97丙氨酸 alanine Ala A 6.00缬氨酸 valine Val V 5.96亮氨酸 leucine Leu L 5.98 异亮氨酸 isoleucine Ile I 6.02 苯丙氨酸 phenylalanine Phe F 5.48脯氨酸 proline Pro P 6.30非极性疏水性氨基酸目 录null色氨酸 tryptophan Trp W 5.89丝氨酸 serine Ser S 5.68酪氨酸 tyrosine Tyr Y 5.66 半胱氨酸 cysteine Cys C 5.07 蛋氨酸 methionine Met M 5.74天冬酰胺 asparagine Asn N 5.41 谷氨酰胺 glutamine Gln Q 5.65 苏氨酸 threonine Thr T 5.602. 极性中性氨基酸目 录null天冬氨酸 aspartic acid Asp D 2.97谷氨酸 glutamic acid Glu E 3.22赖氨酸 lysine Lys K 9.74精氨酸 arginine Arg R 10.76组氨酸 histidine His H 7.593. 酸性氨基酸4. 碱性氨基酸目 录null几种特殊氨基酸 脯氨酸 （亚氨基酸）null 半胱氨酸 胱氨酸（二）几种重要的不常见氨基酸（二）几种重要的不常见氨基酸在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为不常见蛋白质氨基酸。 这些氨基酸都是由相应的基本氨基酸衍生而来的。 其中重要的有4-羟基脯氨酸、5-羟基赖氨酸、N-甲基赖氨酸、和3,5-二碘酪氨酸等。这些不常见蛋白质氨基酸的结构如下。 （三）非蛋白质氨基酸（三）非蛋白质氨基酸150多种其他氨基酸，大多是20种氨基酸的衍生物。有些是β、γ、δ氨基酸。 β-丙氨酸是维生素前体，瓜氨酸和鸟氨酸是尿素循环的中间体 γ-氨基丁酸是传递神经冲动的化学介质null除甘氨酸外，氨基酸均含有一个手性-碳原子，因此都具有旋光性。比旋光度是氨基酸的重要物理常数之一，是鉴别各种氨基酸的重要依据 不对称碳原子 L,D型 +，- -氨基酸具有的这种性质称为旋光性或光学活性，手性 光学异构体在化学和物理性质上一样 D、L混合物称为消旋物 三、 氨基酸的旋光性和光吸收 nullL-氨基酸的基本结构二十种氨基酸除Gly外全是L-型。 Pro呢？残基：在肽链中每个氨基酸都脱去一个水分子，脱水后的残余部分叫残基（residue), 因此蛋白质肽链中的氨基酸统统是残基形式。COOHH2NHCRα碳原子,不对称碳原子侧链nullL型和D型的由来 甘油醛的旋光性左旋甘油醛的构型右旋甘油醛的构型按原子序数法确定了L型和D型氨基酸，但现在L和D已经不代表氨基酸的旋光性，只代表氨基酸的绝对构型。 为什么？null现在为了正确表示左旋和右旋，采用（＋）和（－）的符号，（＋）代表右旋，（－）代表左旋。从右旋的D型甘油醛出发，可以合成出左旋的D型乳酸。从这点我们也可以看出物质的旋光性与手性原子上的构型没有确定的关系。右旋D型甘油醛左旋D型乳酸nullL型氨基酸 与 D型氨基酸L- amino acidD- amino acidnull 将H原子靠近自己，观察CAR的走向，逆时针（左转）为L型，顺时针（右转）为D型。 D：dextro 右 C：carboxyl group ; L： levo 左 A：amino group ; R：residue ; L和D型氨基酸的判断拉丁语中CRAL型CD型ARnull苏氨酸 Thr 有四种异构体null半胱氨酸Cysteine和胱氨酸Cystine 二硫键 Disulfide bond氨基酸的 光吸收氨基酸的 光吸收构成蛋白质的20种氨基酸在可见光区都没有光吸收，但在远紫外区(<220nm)均有光吸收。 在近紫外区(220-300nm)只有酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸有吸收光的能力。 酪氨酸的max＝275nm，275=1.4x103; 苯丙氨酸的max＝257nm，257=2.0x102; 色氨酸的max＝280nm，280=5.6x103;紫外光吸收的测定装置光吸收的测定紫外光吸收的测定装置null蛋白质在紫外区有吸收，一般在280nm处 Lambert-Beer定律 A=lgI0/I=lg1/T=εCL A-吸光度 ε-摩尔消光系数 C-摩尔浓度 L-吸收杯的内径长度 I0-入射光强度 I-透射光强度 T-透光率四、 氨基酸的离解性质四、 氨基酸的离解性质氨基酸在结晶形态或在水溶液中，并不是以游离的羧基或氨基形式存在，而是离解成两性离子。在两性离子中，氨基是以质子化(-NH3+)形式存在，羧基是以离解状态(-COO-)存在。氨基酸的两性离子氨基酸的两性离子两性离子也称两极离子（dipolar ion）两性电解质（ampholyte）氨基酸的两性解离氨基酸的两性解离在不同的pH条件下，两性离子的状态也随之发生变化。 nullK1’和K2’分别代表α碳原子上的羧基和氨基的表观解离常数 如果侧链R上有可解离的基团，其表观解离常数用KR’表示 表观解离常数可以用测定滴定曲线的方法求得 NaOH 标准HCl Handerson-Hasselbalch方程： pH=pK’+ lg[质子受体]/[质子供体]null氨基酸的酸碱滴定氨基酸的酸碱滴定曲线null 可以算出在任一pH条件下一种氨基酸的各种离子的比例 带有可解离R基团的氨基酸，相当于三元酸，有三个pK’值 二十种基本氨基酸，除组氨酸外，在生理pH下都没有明显的缓冲容量，在接近pK’值时才显示出来。氨基酸的等电点氨基酸的等电点 当溶液浓度为某一pH值时，氨基酸分子中所含的-NH3+和-COO-数目正好相等，净电荷为0。这一pH值即为氨基酸的等电点，简称pI。在等电点时，氨基酸既不向正极也不向负极移动，即氨基酸处于两性离子状态。 侧链不含离解基团的中性氨基酸，其等电点是它的pK’1和pK’2的算术平均值：pI = (pK’1 + pK’2 )/2 同样，对于侧链含有可解离基团的氨基酸，其pI值也决定于两性离子两边的pK’值的算术平均值。 酸性氨基酸：pI = (pK’1 + pK’R-COO- )/2 碱性氨基酸：pI = (pK’2 + pK’R-NH2 )/2 null氨基酸等电点的计算nullR-CH-COOH +HNO2 NH2R-CH-COOH +N2+H2O OH与HNO2反应（瓦氏定氮法）五、氨基酸的化学反应 （一）α-氨基参加的反应 （1）与亚硝酸的反应：nullCH2-O-COCl＋R-CH-COOH NH2弱碱(2)与酰化试剂反应 与苄氧酰氯反应CH2-O-CONH-CH-COOH+Na++Cl－Rnull其他酰化试剂： 叔丁氧甲酰氯、 对甲苯磺酰氯 邻苯二甲酰氯、 丹磺酰氯 （3）烃基化反应 氨基酸氨基的一个氢原子被烃基取代 与2，4-二硝基氟苯（DNFB或FDNB）反应。 Sanger反应，鉴定多肽或蛋白质的氮端氨基酸 null与苯异硫氰酸酯（PITC）反应，生成PTC-氨基酸和PTH-氨基酸 用层析法分离鉴定，Edman反应。鉴定N-端氨基酸null（4）形成西佛碱： α-氨基与醛类化合物反应生成弱碱。 （5）脱氨基反应： 在生物体内经氨基酸氧化酶催化脱去α-氨基变成酮酸（二）α-羧基参加的反应（二）α-羧基参加的反应（1）成盐和成酯反应 羧基被保护 （2）成酰氯反应： 羧基与二氯亚砜或五氯化磷生成酰氯，可活化羧基 null（3）脱羧基反应：脱羧酶作用下，放出二氧化碳。 （4）叠氮反应 使羧基活化，用于肽的人工合成 （三）α-氨基和α-羧基共同参加的反应 （1）茚三酮反应 茚三酮在弱酸性溶液中与α-氨基酸共热，引起氨基酸氧化脱氨、脱羧反应，最后生成紫色物质。可定性定量测定氨基酸nullnull（2）成肽反应（四）侧链R基参加的反应（四）侧链R基参加的反应 侧链的羟基、酚基、巯基、吲哚基、咪唑基、胍基等都可发生化学反应 羟基: 酯化 (生物体内的磷酸化) 组氨酸咪唑基：与重氮苯磺酸形成棕红色化合物 null精氨酸的胍基：与1，2-环己二酮生成缩合物 null半胱氨酸巯基： 在微碱性pH下，-SH基发生解离形成硫醇阴离子（-CH2-S-），它能与卤代烷生成稳定的烷基衍生物。 null半胱氨酸的巯基能打开氮丙啶的环，生成的侧链带正电荷ε-NH3+，为胰蛋白酶水解肽链提供了一个新的位点，对测序和巯基的保护有作用 null巯基能和各种金属离子形成络合物，是蛋白质结晶学中制备重原子衍生物最常用的方法 六、氨基酸的分析分离六、氨基酸的分析分离（一）分配层析法的一般原理 层析系统由两个相组成，固定相和流动相 混合物在层析系统中的分离决定于该混合物的组分在这两相中的分配情况，一般用分配系数来描述。 分配定律：当一种溶质在两种一定的互不相溶的溶剂中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在两相中的浓度比值为一个常数，即分配系数（Kd） Kd=CA/CBnull两相可以是液-液、固-液、气-液 分配系数大的物质在体系中的移动速度快。所以只要有足够的分配次数，则混合物中的不同物质就可以完全分开。 （二）分配柱层析 填充物：纤维素、淀粉、硅胶等 固定相：填充物表面附着的不流动的结合水 流动相：与水不互溶的溶剂如苯酚、正丁醇 流动相流动时，加在柱上端的氨基酸混合物样品在两相之间发生连续分配，并以不同的速度向下移动，分别收集可得纯的氨基酸样品 nullnull氨基酸的鉴定和分离纯化1（三）纸层析、薄层层析null滤纸纤维上吸附的水是固定相，展开用的溶剂是流动相。 各种氨基酸在两个溶剂系统中具有不同的Rf值，彼此分开，分布在滤纸的不同区域。 Rf=原点至氨基酸停留点的距离/原点至溶剂前沿的距离 薄层层析：用纤维素粉、硅胶、氧化铝等做支持剂 null氨基酸的鉴定和分离纯化2（四）离子交换层析离子交换层析null氨基酸自动分析仪氨基酸自动分析仪null（五）气相色谱 固定相为涂在固体颗粒表面的液体，流动相为气体 微量快速，但要求样品热稳定性高，易挥发 （六）高效液相色谱（六）高效液相色谱液-液色谱，溶剂系统高压 null氨基酸的鉴定和分离纯化3氨基酸的鉴定、分离纯化（III）PTH-AA