枯草芽孢杆菌黑色变种ATCC9372的特性及其应用

文章编号 : 1001 - 7658 (2009) 02 - 0236 - 02　　　 【信息交流】 枯草芽孢杆菌黑色变种 ATCC 9372的特性及其应用 刘 波 　　李 红 　　姚 粟 　　李金霞 　　程 池 (中国食品发酵工业研究院中国工业微生物菌种保藏管理中心 ,北京 　100027) 关键词 　枯草芽孢杆菌黑色变种 ;生物学特性 ;消毒 ;指标菌 中图分类号 : R187　　　　　文献标识码 : B 　　芽孢杆菌属细菌在自然界分布较为广泛 ,由于能够产生 抗逆性内生孢子 ,因此可耐受各种不良环境 ,如可以在 pH 为 2～3的地方生存 ,也可以在温度高达 80℃甚至更高温度 的地方生长 ,而南极寒冷的冰雪中也能见到它们的踪迹。芽 孢杆菌属与人类关系极为密切 ,是越来越引起人们重视和研 究的一个重要的微生物类群。该菌群中的枯草芽孢杆菌黑 色变种 (ATCC 9372) 是一株重要的芽孢杆菌属菌株 ,目前 被广泛应用在农业、工业、科研、医疗和卫生等领域 ,美国、英 国、日本、欧盟等国家和地区已经将该菌株作为质量控制标 准检测菌株列入到食品和医疗的检测中 ,国际上将该菌 株作为化学消毒剂、干热、环氧乙烷等杀菌效果试验指 标菌〔1～3〕,我国卫生部也将该菌株作为标准检测菌株收入 《消毒与灭菌效果的评价与标准 》( GB 15981 - 1995) , 《消毒技术规范 》中。 为科学使用该株标准菌 ,现对其生物学特性、分类学演 变历程以及在医疗、卫生、科研等领域的研究应用近况作简 要介绍 ,为检测、质量控制等相关技术人员了解该菌株特性 以及在该领域的应用提供参考。 1　主要特征 枯草芽孢杆菌黑色变种属于芽孢杆菌属 ,营养细胞杆 状 ,单个或呈短链状排列 ,细胞宽 0. 5～1. 0μm , 长 2. 0～ 4. 0μm,革兰染色阳性 ;芽孢椭圆形 ,中生 ,不膨大 ,在胰胨 大豆琼脂培养基上菌落表面光滑 ,不透明 ,圆形 ,该菌株最显 著的标志就是在含有机氮培养基上菌落呈褐色或棕红色 (参见第 240 - a页图 1)。该株菌目前在国际主要菌种保藏 中心的菌种编号有 DSM 675, NC IB 8058, C IP 77. 18, NBRC 13721和 NCDO 738等。图 1是本中心保藏的 C ICC 10316 (即 ATCC 9372)的菌落形态。该菌在胰蛋白胨大豆营养琼 脂培养基上于 37℃培养不同时间 ,取菌苔涂片经孔雀绿染 色 ,在 1000倍光学显微镜下细菌繁殖体与细菌芽孢形态详 见第 240 - a页图 2、3、4,培养 5d时间芽孢形成率达到 95% 以上。 2　ATCC 9372菌株分类学演变历程 由于传统上对于芽孢杆菌的分类标准较为宽松 ,导致了 芽孢杆菌在形态、生理、基因等方面差异较大 ,这些问题随着 芽孢杆菌分类学研究的不断深入以及鉴定手段的发展不断 得到更改和修正。芽孢杆菌属是所有芽孢杆菌中命名最早 (1872年 )的一个属。1900年 ,M igula依据表型分类命名了 一个新种 B acillus g lobig ii ;上世纪 30年代 ,美国 Elizabeth分 离得到 ATCC 9372的原始菌株 ,该菌株最初保藏编号为 NRS - 1221A (红色菌株 ) ,并将其归为 B. g lobig ii。 1952 年 , Sm ith等将 B. g lobig ii的一些菌株重新进行比较研究发现 , 很多命名为 B. g lobig ii的菌株表型特征和生理生化特征其 实与 B. g lobig ii的描述不相关 ,于是对这些菌株进行重新分 类 ,建立了几个芽孢杆菌属新的种 ,如环状芽孢杆菌 ( B. circu lans ) ,短小芽孢杆菌 ( B. pum ilius )和枯草芽孢杆菌黑 色变种 ( B. subtilis va r. n iger )等。其中枯草芽孢杆菌黑色 变种和典型的枯草芽孢杆菌 ( B. subtilis )在表型特征上除 产色素特征外 ,几乎没有其它差别 ,而且色素产生根据培养 条件的改变 (如培养基葡萄糖含量和培养温度 )而不同。 Sm ith等将在含酪氨酸的培养基上产棕黑色素特性的枯草芽 孢杆菌菌株定名为枯草芽孢杆菌黑色变种 ,其中包括 ATCC 9372的原始菌株 NRS - 1221A。 近年来随着分子生物学和遗传学研究的发展 ,诸如 DNA G + C mol% , DNA - DNA体外分子杂交 , 16S rRNA核 苷酸序列等分子分类技术已逐渐成为了细菌分类学中 不可缺少的分类指征 ,为新分离株与属间亲缘关系测定和某 些种的重新分类提供了迅速而有效的方法。1973年 , Gordon 等人首次提出那些被命名为枯草芽孢杆菌 "变种 " ( var. )的 菌株命名已不合适。1989年 , Nakamura等人采用 DNA杂交 技术、电泳技术和色素生成方法对一些产色素的枯草芽孢杆 菌重新鉴定分类 ,首次提出将产棕色色素的枯草芽孢杆菌黑 色变种更名为萎缩芽孢杆菌〔4〕。2001年 Fritze和 Pukall采 用 R ibotyp ing和 DNA - DNA 杂交技术对 ATCC 9372 和 ATCC 51189进行鉴定 ,进一步确定二者应归为萎缩芽孢杆 菌〔5〕。2004年 , Burke等采用 16S rDNA序列分析和 AFLP技 术对包括 ATCC 9372在内的几个萎缩芽孢杆菌菌株重新鉴 定分类 ,结果表明 , ATCC 9372与萎缩芽孢杆菌模式菌株 ATCC 49337具有较大遗传差异 ,建议将 ATCC 9372命名为 萎缩 芽 孢 杆 菌 g lobig ii 亚 种 ( B. a trophaeus subsp. g lobig ii )〔6〕。 目前国际上较权威的保藏机构如 ATCC、DSMZ、NBRC、 ·632· Chinese Journal of D isinfection　2009; 26 (2) © 1994-2009 China Academic Journal Electronic Publishing House. All rights reserved. http://www.cnki.net C IP等已经将 ATCC 9372由枯草芽孢杆菌黑色变种更名为 萎缩芽孢杆菌 ,国内目前仍然将 ATCC 9372称之为枯草芽孢 杆菌黑色变种 ( B. subtilis va r. n iger )。 3　ATCC 9372菌株的应用 芽孢是整个生物界中抗逆性最强的生命体 , ATCC 9372 能够产生对热、紫外线、电离辐射和某些化学物质很强抗性 的芽孢 ,因此该菌株作为研究材料被广泛地用在干热灭菌、 气体灭菌、辐射灭菌等的研究以及芽孢形成、芽孢萌发机制、 芽孢耐热机理研究上。早期 Molin等研究了 ATCC 9372芽 孢在不同培养基上芽孢形成及抗干热情况 ,在不同培养基上 芽孢产量和耐干热程度 (D160值表示 )均不同 , 在 HS3培养 基上芽孢产量为 2 ×105 个 , D160值为 20 s,而在含一定浓度 蔗糖的 HS10 培养基上芽孢产量为 3 ×109 个 , D160值为 190 s,不同培养基上芽孢抗干热相差近 10倍〔7〕。 Pisano等 研究了高强度声波和超声波对 ATCC 9372芽孢的杀灭效果 , 芽孢杀灭效果随着辐射剂量和辐射时间的增加而显著增 加〔8〕。Moisan等分析了用电离辐射、蒸汽灭菌、环氧乙烷对 ATCC 9372芽孢杀灭的机制及影响 ,用电离辐射杀灭芽孢比 传统的热消毒效果好 ,且可以低温消毒〔9〕。Moeller等比较 研究了 3株芽孢杆菌芽孢对紫外线的抗性 ,其中 DSM 675 (即 ATCC 9372)抗紫外辐射 (UV - A )能力超出另外 2株菌 10倍以上〔10〕。 由于 ATCC 9372所产芽孢在抗干热等方面具有的强抗 性 ,因此该菌在消毒剂检测及灭菌质量控制方面已作为国际 质量控制标准菌株亦被广泛应用。英国、瑞士等国标准协会 将该菌株作为环氧乙烷灭菌的生物指示剂列入到与健康产 品相关的标准中 ,以及将该菌作为干热灭菌指示剂和其它液 体化学消毒剂的指示剂列入与医疗器械相关的标准中。美 国药典、欧洲药典、日本药典等也将该菌株作为灭菌生物指 示剂被收录。我国卫生部颁布的《消毒与灭菌效果的评价方 法与标准 》( GB 15981 - 1995)、《消毒技术规范 》收录有该菌 株。该菌株也为新型消毒剂的研发及其质量控制提供强有 力的依据 ,国内研究利用该菌株芽孢进行过氧丁二酸、三氯 异氰脲酸钠、二氧化氯、戊二醛等消毒剂效果的验证及评 价〔11～14〕,以反映消毒剂的实用剂量与杀菌能力。 4　ATCC 9372菌株芽孢悬液制备中存在的问题 ATCC 9372菌株芽孢作为灭菌或消毒指示剂 ,主要是用 来评价各种用途的消毒剂对该菌株所形成芽孢的杀灭作用。 在实际应用中 ,需要培养收集一定数量的芽孢悬液 ,通常用 作杀菌试验的芽孢悬液的浓度要求在 106 ～108 cfu /m l,因此 该菌株芽孢的形成、芽孢的数量是主要影响指标。在前面提 到过菌株 ATCC 9372与枯草芽孢杆菌在表型特征上除产生 色素形成典型棕红色菌落外 ,几乎没有其它差别 ,因此在培 养过程中 ,挑选典型菌落进行扩大培养至关重要 ,而这种典 型菌落的产生会因为培养基不同或培养温度等的改变而不 同。实验表明 ,培养过程中形成的一些非典型菌落往往芽孢 形成率较低 ,很难收集到较高浓度的芽孢悬液 ;其次 ATCC 9372菌株在液体培养基中培养时较难形成芽孢 ,即使有芽 孢形成 ,芽孢形成率也很低 ,不足 30% ,因此在芽孢制备过 程中 ,需要在固体培养基上培养。另外培养时间也是影响芽 孢形成率的因素 ,一般随着培养时间的增加 ,芽孢数量逐渐 增加。根据 ATCC 9372芽孢形成的上述特点 ,本中心保藏的 C ICC 10316 (即 ATCC 9372)芽孢形成率在胰胨大豆琼脂培 养基上培养 5 d可达 95% ,制备的芽孢悬液浓度达 109 cfu / m l,且芽孢悬液在 4℃保存下存活期能够达半年。本中心目 前采用该技术制备的芽孢悬液提供给多家医疗器械检验中 心和企业用于生物安全柜、无菌衣帽等消毒效果的验证 ,使 用效果良好。 参 考 文 献 〔1〕　黄育红 ,陈璐瑶 ,徐文体 ,等. 不同方法比较戊二醛对枯草杆菌 黑色变种芽孢的杀灭效果 [ J ]. 中国消毒学杂志 , 2004; 21 (3) : 227. 〔2〕　尹金贵 ,钟碧玲 ,徐位莲. 环氧乙烷灭菌终端质量监测与管理 [ J ]. 现代医院 , 2005; 9: 23. 〔3〕　李晓旭. 隧道式干热灭菌系统的微生物致死、细菌内毒素灭活 验证 [ J ]. 中国药事 , 2004; 18 (8) : 485. 〔4〕　Nakamura L. 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