柱层析分离色素

柱层析分离色素   实验目的 1．进一步了解绿叶中色素的组成及各色素的颜色和性质。 2．学会用柱层析法分离色素的操作技术，了解层析分析的有关知识。 实验原理 叶绿体色素是植物吸收太阳光能进行光合作用的重要物质，主要有叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素组成。从植物叶片中提取和分离叶绿体色素是对其认识和了解的前提。利用叶绿体色素能溶于有机溶剂的特性，可用95%乙醇或无水乙醇提取。 分离色素的方法有多种，如纸层析、柱层析等。柱层析法是色谱法中的一种，它是根据混合物中各组分对固定相的吸附能力，以及对洗脱剂（即移动相）的溶解度不同将各组分分离。常用的柱色谱有吸附色柱谱和分配柱色谱两类。 吸附柱色谱通常是在玻璃管中填入面积很大，经过活化的多孔性物质或粉状固体作为吸附剂（如氧化铝或硅胶），当混合物的溶液流经吸附柱时，就被吸附在柱的上端，然后从柱顶加入溶剂（洗脱剂）洗脱。由于不同化合物在吸附柱上的吸附能力不同，在同一溶剂中的溶解度也不同，因此各组分随溶剂以不同速度下移，形成色带。 继续用溶剂洗脱，吸附能力最弱的组分就随溶剂首先流出，整个层析过程进行反复的吸附-解析-再吸附-再解吸。用柱层析法可以分别收集各组分，并逐个鉴定。 分配柱色谱是以硅胶、硅藻土和纤维等为支持剂，以吸附较大量的液体作为固定相，而支持剂本身不起分离作用。 本实验是把三氧化二铝填入玻璃管中（压成柱状）作为吸附剂，将叶绿体色素的石油醚提取液倾于吸附柱上，色素即被吸附。由于色素的种类不同，被吸附的强弱不同，就在吸附柱上排列成为不同的色层，再利用吸附剂在不同溶剂中有不同的吸附力，用不同的溶剂进行洗脱，从而达到叶绿体主要的4种色素（叶绿素a、叶绿素b、叶黄素、胡萝卜素）的分离。 在选择溶剂时主要依据下面几条原则： （1）吸附剂要求较纯，否则会影响样品的吸附和洗脱。 （2）溶剂和吸附剂不能起化学反应。 （3）溶剂的极性应比样品小，如果大了，样品不宜被吸附剂吸附。 （4）溶剂对样品的溶解度不能太大，否则影响吸附，但也不能太小，溶液的体积增加，易使色谱分散。 （5）可使用混合溶剂，如有的组分含有较多的极性基团，在极性小的溶剂中溶解度太小。也可选用极性大的溶剂溶解，然后加入一定量的非极性溶剂。这样既降低了极性，又减少了溶液的体积。 层析柱粗细必须均匀，柱管大小可根据试剂需要选择。一般来说，细长的柱分离效果较好。若样品量多，最好选用内径较粗的柱，但此时分离效果稍差。柱管内径太小时，会发生“管壁效应”，即柱管中心部分的组份移动慢，而管壁周围的移动快。柱越长，分离效果越好，但柱过长，实验时间长，样品稀释度大，分离效果反而不好。 叶绿素存在两种结构相似的形式即叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg)，其差别仅是a中一个甲基被b中的甲酰基所取代。它们都是吡咯衍生物与金属镁的络合物，是植物进行光合作用所必需的催化剂。植物中叶绿素a的含量通常是b的3倍。尽管叶绿素分子中含有一些极性基团，但大的烃基结构使它易溶于醚、石油醚等一些非极性的溶剂。 胡萝卜素（C40H56）是具有长链结构的共轭多烯。它有三种异构体，即a-,β-和γ-胡萝卜素，其中β-异构体含量最多，也最重要。在生物体内，β-体受酶催化氧化即形成维生素A。目前β-胡萝卜素已可进行工业生产，可作为维生素A使用，也可作为食品工业中的色素。 叶黄素（C40H56O2）是胡萝卜素的羟基衍生物，它在绿叶中的含量通常是胡萝卜素的两倍。与胡萝卜素相比，叶黄素较易溶于醇而在石油醚中溶解度较小。 可用有机溶剂将上述色素萃取出来。而后用层析柱，以同样的或其他混合有机溶剂当洗脱剂，便可将这些色素分离。 试剂器材 材料    烘干的菠菜叶 试剂    无水乙醇，石英砂，丙酮，石油醚（60-90oC），三氧化二铝，饱和氯化钠溶液，无水硫酸钠，洗脱液（丙酮：石油醚=1：9） 器材    层析柱（1×30cm），研钵，蒸馏装置，脱脂棉，天平，烧杯，过滤漏斗，玻璃棒，锥形瓶，分液漏斗，试管 ，铁架台 实验步骤 色素提取 取20g青椒，加少许石英砂，再加20mL无水乙醇研磨成浆，脱脂棉过滤，保存滤液，滤渣再用无水乙醇提取一次，合并滤液，滤渣再加入30mL石油醚提取一次，过滤，合并滤液，转移至分液漏斗中，再加入40mL饱和氯化钠溶液震荡（注意不要激烈振荡，以防止发生乳化现象）。弃去下层溶液，再分别加入20mL水震荡洗涤几次，直至下层无色，保留上层溶液，转移至锥形瓶中，用无水硫酸钠干燥5min，备用。 样品浓缩 将提取液放入蒸馏烧瓶中，蒸除多余的石油醚，至剩10mL时停止加热，用余热加热至剩余5~8mL，以备加样使用。 层析柱的制备 称取12g碱性三氧化二铝加入30mL石油醚搅拌，浸泡10min。在层析柱内加入一团棉花（棉花要尽量薄）在底部再加入0.5cm的石英砂，然后用石油醚半充满柱子，再将浸泡好的三氧化二铝倒入柱内，倒时应该缓慢，重复使用下面的石油醚，直到装完。用石油醚洗柱内壁，顶部加一小团棉花，然后再加入石英砂0.5cm高。 样品的分离层析 将浓缩液小心地从柱顶部加入。加完后打开活塞，让液面下降到柱中砂层，关闭活塞，加几滴石油醚冲洗内壁，打开活塞，使液面下降如前，在柱顶小心加入约1.5—2cm高度的石油醚-丙酮洗脱剂，层析即开始进行。 当第一个有色成分即将滴出时，另取一洁净的烧杯收集，得黄色溶液，即胡萝卜素。将洗脱剂换成1：7的石油醚-丙酮混合液，继续洗脱可得到第二色带的黄绿色溶液，即叶绿素a和叶黄素。 实验结果 从左到右依次为：胡萝卜素（黄色），叶绿素a(蓝绿色)，叶黄素（黄绿色），叶绿素b(绿色) 实验 在该柱层析分离色素实验中，了解了柱层析技术的相应方法和原理，学会了层析柱的制作和准备，进一步了解绿叶中色素的组成及各色素的颜色和性质。洗脱液的配比、层析柱的制作及洗脱液的流速是本实验成功与否的三大关键因素。同时在实验过程中，为保证实验快速有效地进行，也需要注意以下问题： 1、萃取时不要剧烈振荡，以防止发生乳化现象。 2、为了保持柱子的均一性，使整个吸附剂浸泡在溶剂或溶液中是必要的，否则当柱中溶剂或溶干时，就会使柱身干裂，影响渗透和显色的均一性。因此要保证整个装样过程中溶剂要高于三氧化二铝的表面。 3、在吸附剂上端加入脱脂棉（或滤纸）是使加样品时不致把吸附剂冲起；在吸附柱下端加脱脂棉（或沙子）可以防止吸附剂细粒流出。 4、层析柱填装紧密与否，对分离效果很有影响，若各部分松紧不匀，会影响渗透速度和显色的均匀。 5、注意洗脱剂的配比，胡萝卜素出来后，换成1：7的洗脱液。 6、洗脱流速不宜过快，避免因此压紧凝胶，色素分离不开；也不要过慢，使柱装得太松，导致层析过程中，凝胶床高度下降，色素洗脱很慢。因此应控制洗脱流速，以每分钟60~80滴为宜。 7、样品一定要足够浓缩，加样量不要过大或过小。