分子遗传

分子遗传学 1. DNA的半保留复制 1.2 DNA半保留复制的证据： 1958年，Meselson和Stahl, 用重氮15N标记DNA，在复制后不同的时间经CsCl梯度密度离心实验验证了DNA的半保留复制。 Taylar 实验，验证了真核生物的半保留复制。 2.复制的起点、方向与方式 2.1.1 复制原点： 复制是从DNA 分子上特定位置开始的，这一特定的位置称之为复制原点。 a. 原核生物：通常只有一个复制原点 (E.coli :oriC)； b. 真核生物：通常具有多个复制原点； (Yeast: ARS) 复制子：基因组中能独立进行复制的单位，一个复制子中只有一个复制起点。 2.1.2 DNA复制起始区段的结构特点是： （1）有多个独特的短重复序列，但各种生物中该序列不尽相同； （2）该重复序列与多种启动复制蛋白结合，DNA聚合酶和其他复制蛋白在复制起点正确的装配就可以启动DNA的复制； （3）复制起始位点序列富含A－T碱基序列，有利于双链解开起始复制； 2.2 DNA复制的方向： · DNA是从一个起始位点开始复制的，一旦复制开始，就一定会完成，达到复制子的终点。 · 从起始位点开始后，DNA有两种复制方式：单方向的（Unidirectional Replication）；或双方向的（bidirectional replication.）两个复制叉复制的速度也可能不尽相同，可以同时复制，也可以先复制一条链，到一定程度后在复制另一条链。大多数采用双向等速复制。 2.3 复制的方式 · 滚环复制模型 · D环复制模型 · θ环复制模型 · 泡状或Y形结构 2.3.1 滚环复制模型（1968，Gilbert) 哪些 DNA进行滚环复制？ * 真核rDNA的扩增 * 大肠杆菌F因子DNA的转移 * Λ噬菌体裂解途经的复制 * φX174, M13. G4等单链环DNA噬菌体第二阶段复制都是进行滚环复制的. 2.3.2 D环复制模型 线粒体，叶绿体DNA 2.3.3 θ环复制模型 大肠杆菌，枯草杆菌等原核生物 2.3.4泡状或Y形结构 线状染色体DNA复制起始后产生的一种结构。 3. DNA复制的过程 3.1 与复制有关的酶和因子 1. 原料： dNTP 2. 双链DNA模板 3. 引物（primer），小片段的DNA或RNA，常是RNA，有游离的 3’OH。 4. 引物酶（primase，DnaG），用于合成复制所必需的RNA引物。 5. 解螺旋酶 ( helicase ) DnaB, 由DnaA和DnaC协助在复制的起始点（Ori C）上解开双螺旋。 6. 单链结合蛋白（SSB，single stranded binding protein）稳定已经解开成两股的DNA单链，防止其退火复性。 7. 拓扑异构酶（DNA topoisomerase） 拓扑一词的含义是指物体或图象做弹性移位而又保持物体不变的性质。 DNA 分子中存在打结，缠绕、连环的现象。 I 型酶： 切开双链中的一股，使DNA不致打结，切口的3’端可通过自由转动一周再与5’端磷酸连接，不需ATP。 II 型酶：切断处于超螺旋状态中双股链中的某个部位，通过切口使超螺旋松弛，利用ATP使DNA恢复复制所要求的负超螺旋状态。 8. DNA聚合酶（DNApolymerase 聚合酶III 主要的复制酶，并有校读、纠错的功能； 聚合酶 I 用于切除引物RNA,并填补留下的缺口； 聚合酶II 活性弱。 聚合酶延伸多核苷酸链总是5’——3’。 9. DNA连接酶（ligase）：将不连续的DNA片段以磷酸二酯键连接起来 3.DNA的复制 · DNA复制的起始 · DNA复制的延伸 · DNA复制的终止 3.1 DNA复制的起始 DNA的原点被一个复杂的蛋白质识别，在DNA合成之前，母链必须解开，并（短暂的）保持单链状态。然后子链的合成在复制叉起始。在大肠杆菌中，一个DNA链的起始是通过一个称为引发体的蛋白复合体完成的。 E.coli复制的起始： 从形成预引发体开始，要求6种蛋白参与 ： 复制起始（DnaA蛋白识别并结合复制起点- DnaA蛋白使DNA双链解旋- DnaB在DnaC的作用下组装到oriC上）→顶引发体形成（复制复合物的改型- DnaC蛋白从顶引发体上脱离）→DnaB螺旋酶活化（螺旋解旋酶DNA-引发酶加入）→引发体形成 3.2 DNA复制的延伸 这个过程由DNA聚合酶III催化，它是主要的复制酶。 前导链（leading chain）：为连续合成，合成方向与解链方向一致。 后随链（lagging chain ）：不连续合成，在RNA引物基础上分段合成DNA小片段（冈崎片段），方向与解链方向相反。 由此可见，整个DNA分子的复制是半不连续的。 核心酶（ α:合成DNA ε:3’-5’校正功能 θ:组装功能 ） τ亚基：使核心酶二聚化 γ复合物：β亚基的支架 β亚基：与DNA结合，使全酶具有进行性 3.2.2 DNA复制过程中协调 DNA聚合酶III全酶的循环，β夹钳控制了核心酶与DNA结合的协调 一，增加DNA的合成速度，主要是通过提高DNA聚合酶的移动速度； 二，防止先导链上的核心酶滑落。 聚合酶的核心酶和β夹钳在冈崎片段合成完成之后解离，并在下一个起点重新结合。 3. 3 DNA复制的终止： 在E.coli中，复制终点能够阻止复制叉的前进，但是复制终止点并非两个复制叉自然相遇的位置。在复制叉自然相遇位点的两边各有一个终止区域，分别包含了多个终止蛋白E、D、A和F、B 、C。而每个终止蛋白的两边的极性是不一样的；用T形状代表不同的极性，当复制叉遇到平头端时就会停止。由此可见，终止位点只有结合了专一性的终止蛋白后才可以阻止复制叉的移动，进而该复制子的复制结束。 3.4 线状 DNA的末端复制机制 · 环化：病毒，质粒 · 共价连接形成多聚体 (线状DNA分子） · 发卡引导（草履虫） · 末端蛋白引导（脊髓灰质病毒） · 端粒酶机制 伊丽莎白·布莱克本和杰克· 卓斯塔克发现由于端粒上有独特的DNA序列，从而能防止染色体的退化。 卡罗尔·葛莱德尔和布莱克本还分离出端粒酶，即合成端粒DNA所需要的一种酶。他们的发现解释了染色体末端是怎样得到端粒的保护，而端粒是在端粒酶的作用下形成的。 染色体端粒缩短与细胞衰老 端粒——端 粒 钟 学 说（telomere clock theory) 人类端粒（TTAGGG)n n=250-1500 端粒长度取决于端粒酶的活性。 · 端粒（telomere)是染色体末端特殊结构。 由于DNA聚合酶功能障碍而不能完全复制它们的染色体，因此最后复制DNA序列可能会丢失，从而最终造成细胞衰老死亡。 端粒酶 RNA （核蛋白酶） 蛋白质 端粒酶维持细胞分裂时染色体端粒长度。 端粒酶活性（+）：胚胎细胞、生殖细胞、肿瘤细胞 端粒酶活性（-）：正常组织 1.3.1 DNA复制所需要的酶和因子 1. 原料：dNTP 2. 双链 DNA模板 3. 引物 4. 引物酶 5. 解旋酶 6. 单链结合蛋白 7. 拓扑异构酶 8. DNA聚合酶 DNA复制原理的应用——PCR技术 (一)、PCR技术的基本原理 · PCR是指那些模拟体内DNA复制的方式在体外选择性的扩增DNA上的某个特定区段的技术。 · PCR在人类社会中应用广泛: DNA指纹鉴定， 血液中病毒检测等 · PCR的4种基本要素： ① ssDNA模板、② ssDNA引物、③合成DNA的4种原料dNTP、④DNA聚合酶。 · PCR反应的3种基本过程： ①变性、②退火、③延伸 (二)、PCR反应所需物质与扩增过程 1. Taq DNA聚合酶：2499 bp 嗜热水生菌Thermus aquatics YT-1菌株。 Taq 酶的活性特点： ① 5′→3′方向的聚合酶活性， ② 5′→3′方向的外切酶活性， ③ 逆转录酶活性， ④ 较弱的非模板依赖性， ⑤ 缺乏 3 ′→ 5 ′方向的外切酶活性。 (2) 保真性： · 缺乏3′→5′方向的校读(proof reading)功能 a. 影响因素：Mg 2+、pH值、模板DNA是否损伤、dNTP浓度和4种dNTP的平衡。 b. 提高保真性的可能途径： ① 掺入少量的具有3′→5′方向校对功能的其他耐高温聚合酶，错配率可降为原来的1/10；② 使4种dNTP的浓度相等，并尽可能保持在不影响DNA合成的最低浓度上；③ 在不影响DNA合成情况下，Mg 2+浓度尽可能低，④ 减少高温时间，以减少DNA热损伤；⑤ 减少循环数；⑥ 反应体系pH值在70℃时尽量低于6.0。 3. PCR引物： (1) 引物原则： ① 引物的序列应位于基因组DNA的高度保守区，且与非扩增区无同源序列。这样可以减少引物与基因组的非特异性结合，提高反应的特异性。 ②引物长度以15－30bp为宜。引物过短或过长均可使反应的特异性下降。 ③引物的碱基尽可能随机分布，避免出现数个嘌呤或嘧啶的连续排列，G+C碱基的含量在40％－60％之间。 ④ 两个引物间不应有互补性，避免形成二聚体。引物自身也不应存在互补序列，避免自身折叠形成发夹结构或本身复性。 (3)PCR引物的合成与纯化： · 用户提供碱基序列→生物公司合成 · 合成的引物→经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)或高效液相色谱(HPLC)加以纯化。 · 引物应该贮存在-20－-70℃。 循环次数： · 最适循环数：25-35次 · 制备性PCR的循环次数尽量不超过40次，循环次数过多会导致：① 非特异性产物的增加，②dNTP的错配，③ “平台效应”的产生等。 · “平台效应”：PCR反应中，当引物、模板与DNA聚合酶达到一定比值时，DNA聚合酶的催化反应将趋于饱和，即PCR反应不再增加。 · 平台效应在PCR反应中是不可避免的，但一般在平台效应出现之前，PCR产物的数量已经足以满足实验的需要了。 (三)、PCR反应的类型 ： 1. 锚定 PCR （anchored PCR）： 2. 不对称PCR （asymmetric PCR ） 3. 反向 PCR （Inverse PCR） 4. 多重 PCR（multiple PCR） 5. 反转录PCR 6. 重组PCR 7. 定量RCR 思考 · 1.当你知道一个基因的某个片段的DNA序列 时，请设计一个实验把这个基因的全长扩出来？ · 2. 如果有一株转基因植物出现了特异性的表型，如何判断是你转进去的基因所导致还是因为你转进去的基因插入某个功能基因的内部而导致？ 1. 锚定 PCR （anchored PCR）： 它是通过在离开已知的小量序列信息一定距离处加上一个确定的序列，这个序列一般为寡核苷酸，然后根据附加核苷酸的序列设计与之互补的序列作为PCR扩增的一个引物，另一个引物来自已知小量序列的核苷酸信息，在两个引物存在下进行PCR扩增（见下图）。由于其中一个引物是与人工接上的附加核苷酸序列互补的，故称为锚定PCR。 · 锚定PCR的应用： 快速扩增cDNA末端：RACE技术 (rapid amplification of cDNA ends) (1) 扩增已知序列3’端区段 (2) 扩增已知序列5’端区段 (1) 扩增已知序列3’端区段 为了产生3’端的下游区段，用oligo(dT)作引物，它与poly(A)尾互补，经逆转录合成cDNA第一条链。RNA:cDNA复合物经变性后，用mRNA已知序列设计特异引物1，进行PCR反应，就产生3’端cDNA双链。 以此双链作模板，以oligo（dT）(17-30)为其中一个引物，特异引物为另一个引物，进行第一轮PCR扩增。由于第一轮扩增产物往往不够，因而还需要对第一轮扩增产物进行第二轮扩增，引物分别是与引物1嵌套的引物2以及oligo (dT)引物。 (2) 扩增已知序列5’端区段 为了扩增5’端上游序列，首先从mRNA中的已知短片段序列计特异引物3，与mRNA退火后，用逆转录酶合成cDNA第一条链。 使mRNA:cDNA复合物变性，在第一链末端加寡同聚物尾。再与寡同聚物引物退火，Taq酶延伸，得到新合成的cDNA双链。再以此双链为模板进行PCR循环，这样5’端上游序列就得到了扩增。 2. 不对称PCR （asymmetric PCR ） 目的：扩增产生特异长度的单链DNA 在扩增循环中引入不同浓度的引物，两种引物的浓度比常为50-100：1. 在最初10－15个循环中主要产物还是双链DNA，但当低浓度引物被消耗尽后，高浓度引物介导的PCR反应就会产生大量单链DNA 。单链DNA可用作杂交探针或DNA测序的模板。 3、反向 PCR （Inverse PCR）： 常规PCR可扩增位于二个引物之间的DNA片段，但不能扩增引物外侧的DNA序列，反向PCR则可扩增引物外侧的DNA片段，并对已知DNA片段两侧的未知序列进行扩增和研究。 4、多重 PCR（multiple PCR） 多重PCR是在同一反应中采用多对引物同时扩增几个不同的DNA片段，如果基因某一区段缺失，则相应的电泳图谱上此区段PCR扩增产物长度减少或消失，从而发现基因异常。多重PCR具有灵敏快速特点，特别适用检测单拷贝基因缺失、重排、插入等异常改变，其结果与Southern blotting一样可靠，但多重PCR能检测小片段缺失。 5. 反转录PCR： RT-PCR (reverse transcription PCR) 特点：快速、简便、敏感性极高 。 目的： 检测RNA 原理：先在反转录酶作用下，以mRNA为模板合成互补的cDNA，再以此cDNA为模板进行PCR扩增。这样，低丰度的mRNA就得以扩增放大，便于检测。 6. 重组PCR： 目的：用于基因融合。 原理：巧妙地设计和利用寡核苷酸引物，进行初级和次级PCR反应。在初级PCR反应中，每对引物中的一个引物的3’端与待重组的基因互补，5’端则与另一个待重组基因互补。分别进行PCR，所得的两种PCR产物有部分重叠序列，混合两种不同的PCR产物进行次级PCR，基因就得到了融合。 7. 实时荧光定量PCR · 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过曲线对未知模板进行定量分析的方法。 · 绝对定量 · 相对定量 第三讲 基因突变与DNA损伤修复 3.1 DNA损伤 DNA损伤类别： 自发性DNA损伤 ：完全没有人为干预的自然条件下发生，随机性，概率低。 诱发性DNA损伤 ：通过人为的干预，采用各种 生物的、物理的和化学的手段造成，频率高。 3.1.1 自发性DNA损伤： 错配（mispairing or mismatch） 互变异构现象（tautomerism） DNA聚合酶“打滑” （slippage） 1. 错配：DNA在复制或修复合成时，往往发生碱基的差错配对，每次DNA复制时，其错配的发生率估计在10-7－10-11之间。 2.互变异构现象：主要有酮式－烯醇式或氨基－亚氨基两种互变异构形式： 当C或A以亚氨基形式存在时：发生 A＝C 错配 当 G或T以烯醇式存在时： 发生 G＝T错配。 3. DNA聚合酶的“打滑”：也称滑序复制 在DNA的复制过程中，不论是模板链或新生链有时都会发生碱基的“环出”现象，引起一个或数个碱基的缺失或插入，进而导致移码突变。 如果模板中含有较短的重复序列，特别容易在原位发生缺失或插入突变，其重要的原因就是重复序列的滑序复制。 后果：基因组在许多位点上出现动态的重复序列数量上的变化，从而造成子代群体在同一位点产生出许多不同的等位形式。 · 滑序复制是近年来在人类基因组中发现的三核苷酸重复顺序扩张疾病(trinucleotide repeat expansion disease)的重要原因。 · 例如人类亨廷顿氏舞蹈病(Huntington’s disease)基因所含的5’—CAG—3’重复顺序正常数目为10—35个，而患者的同一基因位点中该重复顺序则扩增为36－121个，使得谷氨酰胺数目增加，产生无功能的蛋白质。 3.1.2 诱发性DNA损伤： 1、化学因素（诱变剂）：1）、DNA-反应性化合物；2）、碱性类似物；3）、移码诱变剂；4）、代谢活化的化学物质 2、物理因素：紫外线、电离辐射 3、生物因素 3.1.2.1电离辐射和损伤 生物体接触的辐射线：ｘ射线、α射线、β射 线，γ射线以及中子和质子等 电离辐射： 1.对细胞的物理学效应（电离辐射的直接作用）： 射线或者带电粒子生物体从细胞中各种原子成分的外层击出电子产生很多离子对引起细胞内（或DNA)原子或者分子的电离和激发遗传物质改变。 3.1.2.1电离辐射与损伤 ： 2. 对细胞的辐射化学效应 (电离辐射的间接效应)： 电离辐射在DNA周围环境的其他成分(主要是水)上沉积能量，水是活细胞的主要成分，水经辐射解离后可产生许多不稳定的具有高活性的自由基(H2O2，OH- ),这些自由基能与细胞中的DNA, 蛋白质，酶等发生化学变化，进而引起DNA的损伤。 3.1.2.2紫外线引起的DNA损伤 紫外线属非电离辐射，即它没有足够的能量来诱导离子化。但紫外线是一种诱变剂，在足够高的剂量的时候，它仍能杀死细胞。 紫外线的穿透能力有限：30%可穿透玉米的花粉壁，8%可穿透鸡蛋的卵黄膜。 紫外线很少用作高等生物的诱变剂，而多用在微生物，生殖细胞，花粉粒以及培养中的细胞等等。 紫外线照射对DNA效应之一是在DNA双螺旋的相同链的相邻的嘧啶分子间或在相反链上的嘧啶分子间形成异常的化学键，多数诱导的是邻近的胸腺嘧啶 ---形成胸腺嘧啶二聚体（thymine dimers）TT，少数CC、CT和TC二聚体。这些异常配对常常在DNA链中产生膨胀（凸出部分），破坏As与相反链Ts的碱基配对。两个碱基平面被环丁基所扭转，引起双螺旋构型的局部变化，以及氢键的减弱。 3.1.2.3 DNA-反应性化合物引起的DNA损伤 · 直接与DNA反应的化合物通常是碱基的修饰剂或直接诱变剂，它们能直接作用于DNA而改变其碱基的结构。 · 例如亚硝酸、烷化剂或羟化剂等。 · 注意：熏肉，咸鱼，反复烧开的水中含有较多的亚硝酸盐，应少吃。 3.1.2.4 代谢活化的化学物质引起的DNA损伤 有些化学物质本身并不引起突变，但是一旦进入生物体内，经过代谢后，即转变为亲电子化合物。于是象烷化剂一样，它们能与DNA的亲核中心相互作用，成为诱变剂。也就是说这是一种代谢后能将大型化学基团加到碱基上的分子。例如黄曲霉素B和苯丙吡。这类反应的结果是形成一个膨胀的扭曲的双螺旋，它会阻断复制。 3.2 DNA的修复系统 直接修复（Direct repair）系统 切除修复（Excision repair）系统 错配修复（Mismatch repair）系统 重组修复(Recombination repair)系统 SOS修复系统 3.2.1 直接修复系统 · 主要指光修复或光复活 是专一地针对紫外线引起的DNA损伤而形成的嘧啶二聚体并在损伤部位就地修复的一种修复途径。 光复活酶(PR酶) 胸腺嘧啶二聚体 -------------------→ 单体 3.2.2、切除修复系统 · 由一个具识别功能的酶识别DNA分子中损伤的或改变的碱基，随后伴随包括损伤的碱基在内的切除过程，再合成新的DNA片段以代替切除的部分。 · 在一个细胞内有多种切除修复系统：有些识别所有的DNA损伤，有些只作用于特定类型的碱基损伤。可分为一般和特殊切除修复两种。 （1）一般切除修复： 是一种多步骤的酶促反应过程： 1).内切酶在损伤位点的两侧同时切割 2).外切酶除去两个切口之间的核苷酸 3).DNA合成 4).连接酶连接接口 切——移——补——封 在E.coli中，与DNA切除修复相关的蛋 白质(UvrABC系统）: 1.修复内切酶: UvrA、 UvrB、UvrC 2.外切酶： UvrD 3.PolI聚合酶 4.DNA连接酶 2.特殊切除修复途径： (a)AP核酸内切酶修复途径 (b)糖基酶修复途径 (a) AP核酸内切酶修复途径: AP位点: 在DNA链上无嘌呤（apurinic）和无嘧啶（apyrimidinic）的位点。 AP核酸内切酶可以通过剪切AP位点上的磷酸二酯键使链断裂，进而由外切酶、DNA pol I 和连接酶进行进一步的修复。 (b) 糖基酶修复途径: DNA糖基化酶（glycosylase）并不能剪切磷酸二酯键，但可以剪切N-糖苷键，释放出改变了的碱基，产生一个AP位点。这样再经AP内切酶切开磷酸二酯键，再由DNA 聚合酶的外切酶活性，5’→3’的聚合酶活性修复，最后由连接酶连接。 DNA糖基化酶（glycosylase）可以剪切N-糖苷键，释放出改变了的碱基，产生一个AP位点。 3.2.3 错配修复系统： · 主要用于对应的DNA链上不互补的碱基，错配是由于在DNA复制中新生链上的碱基与互补链上的碱基不互补产生的。通常错配系统倾向于修复新生链上的碱基。 · 在E.coli复制中发生错配时，错配的核苷酸只是其碱基不能与母链配对，核苷酸本身的结构是正常的，因此对正确母链和错配子链的区分至关重要： 亲本链上带有甲基；刚合成的子链尚未甲基化。 3.2.4 重组修复系统： · 是一种越过损伤部位而进行修复的途径。重组修复必需在DNA进行复制的情况下进行，因而又称复制后修复。 · 在大肠杆菌中已经证实，当DNA受到损伤(形成嘧啶二聚体)时能诱导产生一种重组蛋白(recA)，重组修复中的重组是在这种蛋白的参与下进行的。 3.2.5、SOS修复系统： · SOS修复是DNA分子受到重大损伤时，诱导产生的应急性修复反应，这种修复是为了保命也就管不了修补的片段是否正确，故也称为：差错倾向修复（error prone repair）。而SOS是借用国际通用的紧急呼救信号save our souls 来命名的，表示细胞受到危机状态时的修复方式。 · 表现特点： （1）细胞内原有的修复酶（切除修复酶、重组修复酶）的合成量增加； （2）利用诱导产生的修复酶（SOS聚合酶）来修复损伤部位。 · SOS修复使细胞内原有切除修复和重组修复的酶系合成增加，这与recA和lexA两个基因的调控有关: · lexA是一个调节基因，其产物LexA蛋白是一个阻遏物，它除了抑制自身基因的表达，还阻遏其它修复基因的转录。recA基因产物RecA蛋白通常具有三种活性即重组活性、单链DNA结合活性和蛋白酶活性。在正常情况下RecA蛋白没有蛋白酶活性，但它可被许多损伤DNA的因子或被抑制的DNA所激活。在RecA蛋白的作用下，LexA蛋白被水解，不再阻止SOS基因的转录，因而就启动了SOS反应。 3.2.6.DNA修复和人类疾病 ： · 与DNA修复过程有关的任何基因发生突变都将直接导致基因组范围突变率的急剧增加，因而带来严重后果(见下表)。例如人类着色性干皮病(xeroderma pigmentosum)对UV辐射极度敏感，患者在一般的光照射下即会出现许多细胞突变，引起皮肤癌。 DNA修复系统突变造成的人类疾病： 3.3 基因突变及分子效应 突变： DNA序列的改变。 基因突变：生物体在基因水平上发生的DNA序列改变，它涉及到基因的一个或多个碱基序列的改变，包括一对或多对碱基的替换，增加或缺失。 3.3.1 基因突变的类型 · Spontaneous mutation: 在自然界中发生的，不管是由于自然界中突变剂作用的结果还是由于偶然的DNA复制错误被保留下来的突变，都叫自发性突变。 · Induced mutation：由于人们使用突变剂处理而产生的突变叫诱发性突变。 2. 根据DNA碱基序列改变的多少可分为： 单点突变： 多点突变： 点突变 ：碱基替代、碱基插入 、碱基缺失 脱氨基作用 -----→ 碱基转换 3. 从对阅读框架的影响来看：移框突变（frameshift mutation ）。 插入、缺失一个或两个碱基都能引起移框突变； 扁平的碱性染料分子的嵌合也常引起移框突变。 移框突变不但改变了产物的氨基酸组成，而且会出现蛋白质合成的过早终止。 如果移框突变发生在必需基因上，常常是致死的。 如插入或缺失三个碱基，则可能对阅读框架影响不大，其产物常常有活性或有部分活性。 4. 从遗传信息的改变来看： 同义突变（synonymous mutation）：指碱基序列的改变没有引起产物氨基酸序列的变化，这主要与密码子的简并性有关。 错义突变（missense mutation）：指碱基序列的改变引起了产物氨基酸序列的改变。 无义突变（nonsense mutation）：指某个碱基的改变使代表某种氨基酸的密码子变为蛋白质合成的终止密码子，导致肽链合成过早终止。 5. 从对表现型的影响看： 致死突变(Lethal mutation):有些错义突变或无义突变严重影响到蛋白质活性甚至完全无活性, 从而影响了表现型。 渗漏突变(Leaky mutation):有些错义突变或无义突变的产物仍然有部分活性,使表现型介于完全的突变型和野生型之间的中间类型。 中性突变(Neutral mutation): 有些错义突变不影响或基本上不影响蛋白质活性,不表现出明显的性状变化。中性突变与同义突变统称为无声突变(silent mutation)。 6. 回复突变和抑制突变 回复突变(reversion)： 抑制突变(suppressor mutation)： 基因内与基因间抑制突变： 3.4 基因突变的创新与应用 · EMS突变体 · 快中子突变体 · T-DNA标签突变体 3.4.3.1转基因的常用手段 1. 显微注射 2.基因枪轰击 3. 农杆菌介导的方法 转基因植株的产生 · 最常用的手段是农杆菌介导的转基因的方法 · 在大多数的双子叶植物和少数单子叶植物中已经成熟 · 不需要特殊的仪器设备，任何实验室都能操作 农杆菌介导的植物转基因 农杆菌是土壤中的一种细菌，能够导致植物产生冠瘿病 农杆菌中含有 Ti质粒 (Tumor-inducing plasmid) Ti质粒含有T-DNA序列，T-DNA可以注射进入植物的核DNA 3.5 表观遗传变异 1. 表观遗传学(Epigenetics)与表观遗传变异 表观遗传学是研究表观遗传变异的一门遗传学分支学科。 表观遗传变异是指基因的DNA序列不发生改变的情况下，基因的功能发生了可遗传的变化，进而导致了生物体性状表型的改变。它是不符合孟德尔遗传规律的核内遗传。 DNA序列所提供的遗传信息 表观遗传学提供的遗传信息 3.5.2 表观遗传变异相关的内容： X染色体失活 DNA甲基化（methylation) 染色质结构变化 基因组印记（genomic imprinting) RNA编辑（RNA editing） 什么是RNAi? RNAi: RNA干涉, 一种在转录后水平影响基因表达的机制, 通过反义RNA与mRNA之间形成双链RNA从而导致mRNA的降解,干扰基因的表达. RNAi干扰的特点 1) 放大作用: 在使靶基因失活的效应中, 双链RNA比单链RNA的效果更为强烈; 2) 传递效应：可以在体细胞世代之间传递, 表现出表观遗传效应. 4.1 原核生物的转录 · 基本概念 · 转录机器的主要成分 · 转录的基本过程 4.1.1转录的基本过程 4个阶段 模板识别 转录起始 转录延伸 转录的终止 转录（transcription）是以DNA为模板，在依赖于DNA的RNA聚合酶的催化下，以四种rNTP(ATP、CTP、GTP、和UTP)为原料，合成RNA的过程。 4.2 RNA聚合酶 4.3RNA的酶促合成 RNA合成的基本特点： （1）以核糖核苷三磷酸（rNTP）为底物； （2）以DNA为模板； （3）按5′-3′方向合成； （4）无需引物的存在能单独起始链的合成； ( 5) 第一个引入的rNTP是以三磷酸形式存在 （6）在体内DNA双链中仅一条链作为模板； （7）RNA的序列和模板是互补的。 4.3.1 DNA为模板确定有义链 1963 J.Marmur和Doty Spiegelnan区分有义链。采用枯草杆菌的SP8噬菌体为材料， SP8 DNA 双链有“ 轻”、“ 重”差异明显。 现在将作为转录模板的DNA单链称为模板链或反义链（antisen strand）， 非模板链称为有义链（sense strand）或编码链。 在体外DNA的两条链都可作为RNA合成的模板。 模板链，反义链 编码连，有义链 · 怎样用实验证实mRNA的合成总是延着5-3′方向进行的？ · E.coli在 0(C时需13秒钟才能加上一个核苷酸，但在37(C每秒就可加上40个核苷酸; 利用这个差别以14C来标记U,在0(C培养E.coli，。 · 提取这种正在伸长的mRNA分子 · 发现14C标记首先出现在伸长的3′端，因此可以证明合成是延着5′-3′方向进行的。 总结：RNA合成和DNA复制的区别 （1）转录时只有一条DNA链为模板，而复制 时两条链都可作为模板； （2）DNA-RNA杂合双链不稳定，RNA合成后释放，而DNA复制叉形成后一直打开，新链和母成子链； （3）RNA合成不需引物，而DNA复制需引物； （4) 转录的底物是rNTP，复制的底物是dNTP； （5）聚合酶系不同。 4.4 细菌基因的转录 4.4.1 细菌的RNA聚合酶 RNA pol和DNA pol也有2点不同： （1）RNA pol没有任何校对功能； （2）能起始新的RNA链。 RNA pol 执行多功能： (1) 识别DNA双链上的启动子； (2) 使DNA变性在启动子处解旋成单链； (3) 通过阅读启动子序列，RNA pol确定它自己的转录方向和模板链。 (4) 最后当它达到终止子时，通过识别停止转录。 E.coli中不同的(因子可识别不同的启动子。 4.4.2 原核生物转录的起始延伸 4.4.2.1 启动子（promoter）的结构和转录起始 (1)结构典型,都含识别（R),结合（B)和起始（I）位点; (2)序列保守; (3)位置和距离都比较恒定； (4)直接和多聚酶相结合； (5)常和操纵子相邻； (6)位于基因的5′端； (7)决定转录的启动和方向。 (8)特殊的操纵子的R,B序列不同。 · 启动子是DNA分子可以与RNA聚合酶特异结合的部位，也就是使转录开始的部位。在基因表达的调控中，转录的起始是个关键。常常某个基因是否应当表达决定于在特定的启动子的起始过程。 · DNA链上从启动子直到终止子为止的长度称为一个转录单位。一个转录单位可以包括一个基因(真核），也可以包括几个基因（原核）。 比较不同原核生物的启动子序列 1）. -10序列： -10序列是由Pribnow和Schaller（1975）发现，故也称为Pribnow框盒（Pribnow box）。 保守序列为T80A95T45A60A50T9 位于-10bp左右，A.T较丰富，易于解链。其功能是: (1) RNA pol紧密结合; (2) 形成开放启动复合体； (3) 使RNA pol定向转录。 -10序列对转录的效率影响： · TATAAT→AATAAT，转录效率下降,称为下降突变（down mutation）。 · TATGTT→TATATT，转录效率上升，为上升突变（up mutation）。 · 以上突变为何会影响转录效率？ · 前者可能由于T-A的堆集能要小于A-T的堆积能，后者可能是由于堆集能降低和氢键的减少。 2）. -35序列 · -35序列又称为Sextama盒（Sextama box）， · 其保守序列为（T82T84G78A65C54A45） · 其功能是: (1) 为RNA pol的识别位点。σ亚基识别-35序列，为转录选择模板 (2)-35和-10序列的距离是稳定的，此与RNA pol的结构有关。 3）. 转录起始位点（I）。 · 转录开始时模板上的第一个碱基 · 在原核中常为A或G · 而且位置固定 3.4.2转录的起始 1.全酶与模板的DNA接触，生成非专一的,不稳定的复合物在模板上移动； 2. 起始识别：全酶与－35序列结合，产生封闭的酶-启动子二元复合物（closed binary complex）； 3.全酶紧密地结合在-10序列处，模板DNA局部变性，形成开放的启动子二元复合体； 4. 酶移动到I，第一个rNTP转录开始,σ因子释放,形成酶-启动子-rNTP三元复合体（ternary complex）。 4.4.3原核生物转录的终止 终止子（terminator,t） · 强终止子－内部终止子（intrinsic terminators）。 · 弱终止子 －需要ρ因子（rho factor） 又称为ρ依赖性终止子 （Rho-dependent terminator） 强终止子的结构特点 · (1) 有回文结构存在,易形成茎环结构； · （2）茎的区域富内含G-C； · (3) 强终止子3′端上有6个U； · 原核生物转录起始： 全酶的组装， σ因子，启动子结构特点 原核生物的终止： 强终止子，弱终止子， ρ因子 4.5 真核生物的转录 真核生物的转录和原核转录的不同点： (1) 原核只有一种RNA聚合酶，而真核细 胞有三种聚合酶； (2) 启动子的结构特点不同，真核有三种 不同的启动子和有关的元件； (3) 真核的转录有很多蛋白质因子的介入。 4.5.1真核的RNA聚合酶 真核生物中的转录可以分为三类，每类转录分别由不同的RNA聚合酶执行： 1.RNA聚合酶I转录rRNA，与细胞的大 部分活动有关 2.RNA聚合酶II转录mRNA，结构基因，拥有最多的产物 3. RNA聚合酶III转录 tRNA和其它的sRNA（small RNA） 4.5.1真核的RNA聚合酶 表12-2真核生物的三种RNA聚合酶的特点 RNA Pol 位置 产物 相对活性 对α-鹅膏蕈的敏 Pol Ⅰ 核仁 28s,18s,5.8s rRNAs 50～70% 不敏感 Pol Ⅱ 核质 hnRNA,mRNA,某些SnRNA 20～40% 高度敏感 Pol Ⅲ 核质 tRNA,5SrRNA,某些SnRNAs ～10% 片段特异，中等敏感 表12-3 转录的抑制剂 · 抑制剂 靶酶 抑制作用 利福霉素 细菌全酶 和β亚基结合，抑制起始 链霉溶菌素 细菌核心酶 和β亚基结合，抑制起始 放射线素D 真核PolⅠ 和DNA结合，阻止延伸 α-鹅膏蕈 真核PolⅡ 和RNA PolⅡ结合 4.5.2真核生物的启动子 真核生物细胞中有三种转录方式，分别由三种RNA聚合酶(I 、II和Ⅲ)催化，因此有三种启动子。根据启动子的不同，将真核生物的基因分为三类，即I类、II类和III类基因。这三种基因分别由三种启动子控制，它们在结构上各有特点。 4.5.2.1 真核生物的启动子II 启动子Ⅱ最为复杂，它和原核的启动子有很多不同： （1）有多种元件：TATA框，GC框，CATT框，OCT等； （2）结构不恒定； （3）它们的位置、序列、距离和方向都不完全相同； （4）有的有远距离的调控元件存在，如增强子； （5）这些元件常常起到控制转录效率和选择起始位点的作 （6）不直接和RNA pol结合； (7) 需多种转录因子介入。 TATA框 核心元件： 启始子（initiator，Inr）:一般由PY2CAPY5构成，位于-3～+5 ，可能提供RNA pol Ⅱ识别。 CAAT box、Ⅱ类启动子 上游元件组成 GC box Oct． 增强子（enhomcer）远端调控区 减弱子（dehancer） 静息子（sisencer） 上游激活序列（upstream activating seguences UASs） 起始子 · 起始点一般没有同源序列 · mRNA的第一个碱基倾向A，另一侧翼由Py组成称为起始子（initiator,Inr)。 · 一般由PY2CAPY5构成 · 位于-3～+5 · 提供RNA pol Ⅱ识别。 · 无论TATA是否存在，Inr对启动子的强度和起始位点的选择都是重要的 。 · 现已纯化了Inr 结合蛋白。 核心元件 TATA框合又称Hognes框，Goldberg-Hogness框，俚语称为金砖（Goldbrick） 其一致序列是：T85A97T93A85A63A83A50 常在-25左右，相当于原核的-10序列。 其作用是： (1) 选择正确的转录起始位点，保证精确起始， 故也称为选择子（selector）。 (2) 影响转录的速率。 增强子 · 它是在1981年由Benerji,Rusconi小组和Chambom等发现的，又称远上游序列 （far upstream seguence）。 · 其特点是： ① 具有远距离效应。 ② 无方向性。 ③ 顺式调节。 ④ 无物种和基因的特异性。 ⑤ 具有组织的特异性。 ⑥ 有相位性。其作用和DNA的构象有关。 ⑦ 有的增强子可以对外部信号产生反应。 · 增强子为什么具有远距离作用呢？ （1）拓朴效应；拓朴效应说认为增强子的 作用是诱导染色质结构变化，使核小 体产生DNaseI敏感区。 （2）滑动模型； （3）成环模型。 Enhancer 4.5.2.2 RNA polⅠ启动子 · 核心启动子（core promoter）或核心元件（core element），位于-45到+20，负责转录的起始。 · 上游控制元件（upstream,control element UCE），从-180延伸到-107， 可增加核心元件的转录起始的效率。 4.5.2.3 RNA聚合酶Ⅲ的启动子 · Pol III基因的产物为一些分子量较小的细胞质 RNA（cytoplasmic RNA scRNA ） · 包括: tRNA 5S rRNA 7SL RNA(参与细胞内蛋白质转移) U6 RNA(转录后加工) · RNA polymerase III uses both downstream and upstream promoters 小结 真核生物的转录 (1) 真核细胞有三种聚合酶； (2) 启动子的结构特点不同，真核有三种 不同的启动子和有关的元件； (3) 真核的转录有很多蛋白质因子的介入。 4.6 转录后加工 （1）、减少部分片段：如切除5’端前导序列，3’端拖尾序列和中部的内含子； （2）、增加部分片段：5’加帽，3’加poly（A）,归巢和通过编辑加入一些碱基； （3）、修饰：对某些碱基进行甲基化等。 4.6.1 原核生物mRNA加工 4.6.2真核mRNA前体的加工 (一)核内不均一RNA（heterogenous nuclear RNA,hnRNA）平均分子长度为8-10Kb(2Kb~14Kb)左右。比mRNA的平均长 度（1.8-2Kb）要大4-5倍。 hnRNA仅有总量的1/2转移到细胞质内，其余的都在核内被降解掉。 hnRNA是mRNA的前体，证据是： (1) hnRNA和mRNA有相同的序列； (2) hnRNA在体外能作为模板蛋白； (3) 两者5′端都有帽子结构； (4)表明二者为相同的聚合酶所合成； (5)两者的3′端都有多聚腺苷有尾巴。 hnRNA的结构的特点： · (1)5′端有帽结构； · (2) 3′端有poly（A）尾巴； · (3)帽结构后有3个寡聚U区，每个长约30nt · (4)有重复序列，位于寡聚U区后面； · (5)有茎环结构，可能分布于编码区（非重复序列）的两侧； · (6)非重复序列中有内含子区。 1．加帽 (1) 剪接前加帽 如呼肠病毒， 牛豆病毒 (2) 剪切后加帽 如疱疹病毒和口炎病毒 帽子的类型 · 在末端鸟苷的第7位上存在单个甲基化位点的称O型帽子（capO）； · 在次末端核苷酸的核糖上的2′-0位点上还有一个甲基位点的称1型帽子(cap 1)； · 此外，在第三个核苷酸的核糖上（2′-0）有甲基化位点的称2型帽子（cap2）。 · 这三种帽子都有特殊面对面核苷酸结构（confrontde nucleotide structure）。 帽子结构的功能： (1)有助于mRNA越过核膜，进入胞质； (2)保护5′不被酶降解； (3)翻译时供IFⅢ（起始因子）和核糖体识别。 (2) 加尾 (1)特殊组分(CPSF:剪切和多聚腺苷酸化特异因子)识别AAUAAA并指导其它的活性 (2) 剪切因子(CF)在加尾位点 AAUAAA下游11－30nt 处剪切RNA； (3)PAP末端腺苷转移酶[poly(A)聚合酶]合成 poly(A)尾巴； (4)PBP与poly(A)结合，反应停止。 加Poly(A)的反应 第一步加一个短的寡聚A序列（10nt），此反应依赖于AAUAAA序列； 反应由poly（A）聚合酶在特殊因子指导下完成的。 第二步是寡聚A尾巴延伸到240nt的长度。 此反应并不需要AAUAAA序列，但需要一个识别寡聚A并指导poly（A）聚合酶延伸的刺激因子。 翻译的过程： � EMBED Word.Document.8 \s ��� � EMBED Word.Document.8 \s ��� _1399577945.doc 3' 后滞链 5' 引发酶合成引物 5' 3' 5' 3' RNA引物 RNA引物 3' 后滞链 5' DNA pol Ⅲ 在引 5' 3' 物3'－OH延伸， 冈崎片断 形成冈崎片断 3' 后滞链 5' 5' 3' DNA polⅠ切除引 物，填补缺口 3' 后滞链 5' 5' 3' 连接酶封闭缺口 连接酶 图11-53 后滞链的合成 _1399622734.doc 表12-1 E.coli RNA Pol的结构和功能 亚基 基因 分子量（KDa） 数目 组分 可能的功能 α rpoA 40 2 核心酶 酶的连接，装配 β rpoB 155 1 核心酶 和底物（核苷酸）结合 β’ rpoC 160 1 核心酶 模板结合 ω 10 1 核心酶 σ rpoD 70 1 σ因子 和启动子结合，识别模板链 参照B. Lewin:《GENES》Ⅴ.1994,Table 14.1 14.2